Współczesne trendy biotechnologia
prof. dr hab. Małgorzata Gniewosz
GMO- organizmy modyfikowane genetycznie:
Drobnoustroje
Rośliny
Zwierzęta
Stworzone w wyniku modyfikacji genetycznych
Organizmy które zawierają w swoim genomie obce geny pochodzące z obcego oragnizmu
Przenoszony gen ą transgen
Organizm modyfikowany genetycznieą transgeniczny
Cele produkcji GMO:
Produkcja większej ilości żywności w przeliczeniu na jednostkę powierzchnię
Produkcja większej ilości żywności z mniejszym zużyciem energii
Cele modyfikacji dbn:
Wytwarzanie nowych enzymów lub większej ilości już istniejących
Związki biologicznie czynne( insulina, leki przeciw nowotworowe)
Usuwanie szkodliwych substancji ze środowiska (bioremedacja)
yródło genów ą geny z Bacillus thuringiensis- odporność roślin na owady
Cele modyfikacji roślin:
Poprawa właściwości agronomicznych :
odporność na choroby bakteryjne, grzybowe, wirusowe
odporność na szkodniki
odporność na działanie środków chwastobójczych
odporność na czynniki abiotyczne:
o naturalne:
- nadmiar promieniowania
- niska temperatura chłód >0 C, mróz < 0C
- wysoka temperatura
- deficyt wody
- zasolenie
- długotrwałe deszcze, powodzie
o antropogeniczne :
- wzrost temperatury
- zwiększenie promieniowanie UV-A, UV-B
- gazowe zanieczyszczenia atmosferyczne (CO2 , NO2, HF)
- kwaśne deszcze, mgły
- zakwaszenie wód i gleby
- metale ciężkie CD, PB, Hg
- pestycydy, herbicydy, fungicydy
poprawa jakości żywności:
wzbogacanie żywności w składniki podnoszące ich wartość odżywczą
usuwanie substancji szkodliwych i nie pożądanych
poprawa cech funkcjonalnych związanych z procesami przetwórczymi
produkcja substancji biologicznie i farmakologicznie-czynnych na potrzeby medycyny
Cele modyfikacji zwierząt :
szybki przyrost masy ciała
zwiększenie wydajności mlecznej
produkcja cennych leków dla ludzi
ksenotranspalntacje
1
każdy system prawny definiuje GMO zgodnie z ich interesem politycznym
dz. Ust. Nrv 76 poz 811 22.06.2001 o organizmach genetycznie zmodyfikowanych
organizmie - rozumie się przez to każdą jednostkę biologiczną, komórkową
lub niekomórkową, zdolną do replikacji i przenoszenia materiału genetycznego,
łącznie z wirusami i wiroidami,
2) organizmie genetycznie zmodyfikowanym - rozumie się przez to organizm
inny niż organizm człowieka, w którym materiał genetyczny został zmieniony
w sposób niezachodzący w warunkach naturalnych wskutek krzyżowania
lub naturalnej rekombinacji, w szczególności przy zastosowaniu:
a) technik rekombinacji DNA z użyciem wektorów, w tym tworzenia materiału
genetycznego poprzez włączenie do wirusa, plazmidu lub każdego
innego wektora cząsteczek DNA wytworzonych poza organizmem i
włączenie ich do organizmu biorcy, w którym w warunkach naturalnych
nie występują, ale w którym są zdolne do ciągłego powielania,
b) technik stosujących bezpośrednie włączenie materiału dziedzicznego
przygotowanego poza organizmem, a w szczególności: mikroiniekcji,
makroiniekcji i mikrokapsułkowania,
c) metod niewystępujących w przyrodzie dla połączenia materiału genetycznego
co najmniej dwóch różnych komórek, gdzie w wyniku zastosowanej
procedury powstaje nowa komórka zdolna do przekazywania
swego materiału genetycznego odmiennego od materiału wyjściowego
komórkom potomnym,
Żywność GMO Regulacje:
żywność i jej składniki zwierające lub będące organizmy modyfikowane genetyczne ( pomidory
GMO, modyfikowane truskawki)
żywność i jej składniki produkowane z GMO , lecz nie zawierające GMO (olej rzepakowy z rzepaku
modyfikowanego genetycznie i no majonez z takiego oleju)
Żywność GM- jedli zawiera pewne cechy wcześniej nie wytupujące u gatunku naturalnego , nawet jeśli
uzyskany w wyniku nat. metod hodowlanych (Kanada)
Znakowanie żywności GM:
W USA znakuje się tylko tę żywność która różni się składem chemicznym w stosunku do naturalnego
odpowiednika
Rozporządzenie KE nr 258/97 dotyczące nowej żywności (notatki od pani profesor)
Znakowanie żywności obowiązuje wszystkich oprócz tych zawierających <1 % przypadkowego
zanieczyszczenia, zawartości nowego lub genetycznie modyfikowanego białka lub i DNA
Odmiany GMO uprawy:
od lat 80 uprawiane w Chinach
najczęściej uprawiane odmiany: kukurydzy, bawełny, soi, rzepaku
obszary GMO : Ameryka PN i Pd, Australia , Azja( Chiny Indie, Japonia) Afryka (Egipt , RPA),
Europa( Szwecja , Hiszpania Portugalia, Rumunia, Niemcy, i do 1000 ha ( Polska, Niemcy, Słowacja)
Wykaz zaproponowanej żywności GM :
USA 44 produktów spożywczych
Kanada 42
WB 19
2
USA Kanada WB
12 kukurydzy 15 kukurydzy 5 rzepaku
7 rzepaku 11 rzepaku 3 pomidorów
6 pomidorów 5 bawełny 1 kukurydzy
5 bawełny 4 ziemniaków 1 soi
4 ziemniaków 3 pomidory
3 soi 1 soi
2 buraków cukrowych
1 rzodkiewka
1 papai lenu
Wykład 2
Genom- to pełny zestaw informacji genetycznej organizmu
Gen- odcinek DNA jednostki informacji biologicznej
Gen 1 białko
Wielkość genomu- liczba par zasad wchodzących w skład nukleotydów
Człowiek 3200 Mpz
Zwierzęta 180-2500 Mpz
Rośliny 125-466 Mpz
Bakterie 0,6-9 Mpz
Archeony 1,7 Mpz
Ludzki genom zwiera okoolo 40 000 genów. Sekwencje kodujące to około 25%
Zwierzęta 13000 30000 genów 30-50%
Rośliny 20 000-50 000 genów 45-50%
Bakterie kilkustet do dilku tyś. (85-89%)
Jak zbudowany jest genom ?
Introny- jednostki nie kodujące, są usuwane podczas translacji
Eksony- jednostki kodujące
Bakterie nie potrafią odczytać i uaktywnić genów zawierających intronyą ukariotycznego genu
Gen bakteryjny może być odczytany i uaktywniony w organizmie eukariotycznym
Promotor uaktywnia gen, rozpoczyna translację
Przyłącza polimerazę RNA II
Przepisywanie sekwencji DNA na sekwencję nukleotydów mRNA
Geny aktywowane są przez aktywatory:
Hormony i cytohiny
Tylko na swoistych etapach rozwoju organizmu
W określonych dojrzałych tkankach (insulina w trzustce)
Promotor konstytutywny gen zawsze aktywne i produkuje dane białko
Silny promotor k......- powoduje ciągłe przepisywanie genu i duże ilości wytwarzanego białka
słaby promotor k......- powoduje ciągłe przepisywanie genu i małe ilości wytwarzanego białka
zadania terminatora :
sekwencja kończąca gen
wiele sekwencji terminatorowych jest prawie zawsze wymiennych między genami i gatunkami
3
Jak uzyskujemy gen do transmisji w inżynierii genetycznej :
informacja genetyczna- przepis na gen z banku genów
bank genów- dost informacji na temat sekwencji genu zasad DNA
to między narodowe bazy danych sekwencji zasad Dna i związanych z nimi sekwencji aminokwasów
Gen bank
Pozyskiwanie genu :
1. skonstruowanie fizyczne Dna- maszyna genowa ą sztuczna synteza DNA wg przepisu z
banku
2. proces inżynierii odwróconej wyizolowanie oczyszczenie białka , określenie struktury 1-
rzedowej z sekwencji aminokwasów białka , poszukiwanie sekwnecji zasad DNA
3. zakup genu z firm komercyjnych dysponujących genami ATTC American Culture Celection
Wirgiinia USA
4. wykorzystanie inf z baków do synteazy primerów i zasad technika PCR
primery ( krótkie odcinki DNA komplementarne do końców fragmentu DNA który chcemy powielić 8-24
nukleotydów ) stosowane do wyłapywania homologicznego genu z gnomem interesującego gatunku i techniką
pcr powiela się gen
PCR- reakcja łańcuchowa polimerazy :
powtarzalna dwukierunkowo synteza DNA , polegająca na wydłużeniu primerów homologicvznych do
matrycy DNA
umożliwia powielenie ilości genu
wymagania : termocykler, odczynniki, primery, polimerazaa DNA
Trzy cyklicznie powtarzające się etapy :
1. denaturacja matrycy DNA
2. hybrydyzacja primeru z matrycą
3. synteza DNA przez podłączenie nukleotydów do primerów przy zastosowaniu termostabilnej
polimerazy :
Wydajnosc PCR :
25 cykli
postęp geometryczny po 1cyklu 2 nici po 2 4 po 3 8 itd.
http://www.youtube.com/watch?v=vmlLj1aLZ7s PCR
Konstrukcje genowe i metody transformacji Jak umieścić gen w komórce dbn, rośliny
zwierzęcia
Konstrukcje genowe
Podstawowe elementy:
wyizolowany i sklonowany gen w odpowiedniej ilości
nośnik genu
biorca genu
4
Nośnik:
wektor składnik do wprowadzenia i powielenia fragmentu DNA w komórce wybranego genu
kuliste czasteczki DNA
naturalne plazmidy bakterii
sztuczne- skonstruowane cz. DNA metodą inzynierii genetycznej
Budowa wektora:
ori- miejsce inicjacji replikacji
polilinker- sztuczny odcinek DNA mający kilkanaście miejsc restrykcyjnych , miejsce ciecia wektora
miejsce restrykcyjne- obszar DNA rozpoznawany przez e restrykcyjne które przecinają części DNA w ściśle
określonych miejscach
Marker 1-gen pozwalający na odróżnienie bakterii posiadających wektor od tych które nie posiadają.
Geny oporności na antybiotyki apicyklinę i tetracykliny
Marker II- pozwala na odróżnienie komórek które pobierały wektor ze wstawka od tych które pobrały
wektor bez wstawki
Co wprowadzone Dna do kom zawiera :
gen którym się interesujemy
promotor, części kodujące, terminator
co najmniej 1gen markerowy mała wartość handlowa
są niezbędne do wykrywania i wyizolowania kilku kom w które zostały transformowane
potrzebne w początkowych fazach lecz nieporządne w organizmie końcowym
Markery selektywne :
gen NPT-II- koduje informację odporności na kanamycynę
pozwala na wzrost dbn na podłożu z kanmycyną i oddzielenie komórek zmutowanych od nie
nietransformowanych
Wydajność transferu genu :
mała kilka na mln transferowanych kom
Wykład 3
Metody transformacji organizmów:
bakteria łatwo modyfikować
rośliny znaczne trudniej
zwierzęta bardzo trudne
Metody transformacji bakterii:
1. naturalna zdolność bakterii do pobierania DNA-kompetencja
2. indukcja kompetencji
3. protoplastyzacja komórek
4. elektroporacja (wykorzystanie prądu elektrycznego)
5
Elektropolacja protoplastu ( bez ścian komórkowych)
zastosowanie pola elektrycznego , prądu stałego o dużej częstotliwości
następuje przebicie błony cytoplazmatycznej ( roztwór komórek w polu elektrycznym)
tworzone są pory (tunele) w łonie cytoplazmatycznej , przez które wnika DNA do wnętrza
komórek
Modyfikacje roślin :
1. bezwektorowe bez posrednictwa wektora
2. wektorowe- użycie bakterii z plazmidem zawierających transgeny
Metoda bezwekterowa- mikrowstrzeliwanie :
DNA umieszcza się z kuleczkami ze złota lub wolframu (um0,5-5)
Jeden mikronośnik pokryty jest od 0,01-0, ug DNA
Pokryte DNA kuleczki umiesczone w linii podmuchu strumienia helu aby aby mogły
być wstrzeliwane do kom. rośliny (armatka genowa)
Prędkość do kilkuset m/s
obce DNA dołaczone do DNA komórki
regeneracja komórek i odtworzenie pełnej rośliny
kukurydza, ryż pszenica
Wektorowa- kompetencja :
naturalna zdolność bakterii glebowych
Agrobacterium temufaciens lub A. Rhizogenes.
Do infekowania roślin w miejscu zranienia i przekazywania fragmentu plazmidu , która uległa infekcji
z geomem komórki roślinnej
Agrobacterium czeka na zrranienie rośliny na poziomie gleby
Wycięcie TDNA zwanego plazmidem Ti i - opakowawszy je w odpowiednie białka - przesyła je przez
specjalnie wytworzony tunel do wnętrza komórki roślinnej
TDNA wprowadzone do komórki roślinnej z komórki bakteryjnej i łączy się z DNA komórki
roslinnej.
Komórka roślinna rozpoczyna syntezę białek według sekwencji zawartej w TDNA
Geny kodujące syntezę opin
Onkogeny- kodują są odpowiedzialne za produkcję
przez komórki roślinne hormonów wzrostu nie
wykorzystywane przez bakterie
pobudzających podziały komórek roślinnych.
Rosliny zkieniają w zbryloną ,masę komórek
Powstaje choroba ą gruzełkowatość korzeni ą
Przy modyfikacji roślin wykorzystuje się:
Rozbrojone szczepy agrobacterium
Metoda polega na usunięciu odcinka T-DNA genów bakterii i na ich miejsce wprowadzane geny
przenoszone do roślin
Są to geny użytkowe selektywne wraz z ich sekwencjami regulatorowymi
Transformacja agrobacterium powoduje powielanie wektoróww komórkach bakteryjnych
Wydajność od kilkunastu do 100
Komórka rozbrojonaą transformacjaą selekcjaą kolonia kalusowa ą regeneracja komórek
Przykłady modyfikacji roślin (rośliny I generacji)
1. odporność na owady
2. odporność na działanie herbicydów
3. odporność na wirusy
4. zmiany barwy kwiatów
6
soja odporna na herbicyd i/lub szkodniki
kukurydza odporna na herbicyd i/lub szkodniki
bawełna odporna na herbicyd i/lub szkodniki
nasiona rzepaku odporna na herbicyd i/lub szkodniki
burak cukrowy odporna na herbicyd i/lub szkodniki
odbiorcy korzyści wynikające z upraw roślin transgenicznych
1. odporność na owady
kukurydza i soja
od lat 50 XX w. W mieszaninie proszków owadobójczych do zwalczania głównie gąsienic
w ogrodach domowych
na farmach
powszechnie stosowane naturalne bakterie Bacillus thuringiensis
gen BT wytwarza kryształy białka Cry toksycznego dla owadów łuskoskrzydłych (stonka,
omocznica prosowianka, złotok zielony, motyl monarch (paz królowej)
białko cry w środowisku zasadowym w przewodzie pokarmowym gąsienicy , białko zostaje
aktywowane (istnieje około 130 białek cry) łączy się ze specyficznymi receptorami w błonie
kom. przewodu pokarmowego , powoduje powstawanie otworków w błonie i niszczą ją
prowadząc do śmierci owada.
Receptory tych białek nie występują na powierzchni komórek jelitowych ssaków i ludzi
Bawełna Bt (Cry1Ac) chroni przed zranieniem przez owady dorosłe i larwy
Ziemniak Bt (gen z 3 Cry A) w 1995
Kukurydza (Cry 1Ab) na omocnicę prosowiankę
Ryż Bt Cry 1Ac
Z bakterii Bt skpiowano gen Bt I wprowdzaono do rosliny (ektorowo lub bezwektorowo)
Niska ekspresja genu Bt w roslinach natywnych ( wytwarzane białka w małych
ilościach warunkach polowych), przyczyna wysoka zawartość nukleotydów
A/T w genach bakteryjnych (60-70%) , a roślin przeszczepianych 40-50% .
regiony ATAT i ich warianty były odczytywane jako sekwencje kończące
geny i dlatego była niska wydajność białka Cry.
Modyfikacja genu Bt:
Modyfikacja genu 1Ab i 1Ac
Usuniueto wszystkiesekwencje ATTA co zmniejszyło liczbe nukeotydów z
615 do 356 i spowodowało 100% ekspresję genów w komórce roślinnej
Usunięto promotory genu Bt i użyto promotorów z wirusa mozaiki
kalafiorowej
Kukurydza MON 810 odporna na larwy owadów żywiących się łodygami
Kukurydza MoN 863- odporna na larwy korzeniowe jak np. stonka kukurydziana
Obie odmiany dopuszczone na polskim rynku do użytku spożywczego i
przemysłowego ale zakaz uprawy.
2. Oporność na herbicydy
hamowanie enzymu kluczowego dla danego szlaku biochemicznego
plantacje odporne na ten herbicyd są właśnie nim traktowane w celu wytępienia
chwastów i innych roślin niepożądanych
Mechanizm:
wytwarzanie enzymu rozkładającego herbicyd
synteza innej formy enzymu kluczowego odpornej na herbicyd
wytwarzanie barier fizjologicznych zapobiegających wnikaniu herbicydu do komórek , tkanek
Odporność na glifosat:
działa n syntazę EPSPS, enzymu biorącego udział w syntezie aminokwasów
aromatycznych
7
modyfikacja roślin polega na wprowadzeniu genu kodującego niewrażliwą na ten herbicyd
syntezę EPSPS
kukurydza, soja rzepak, tytoń pomidory
Kukurydza GS 21z tolerancja an glifosta ze zmienioin genem s. EPSPS
Modyfikacji dokonano za pomocą armatki genowej
Rzepak GT 73- metoda wektorowa z agrobacterium , zastosowanie pasze i przemysłowe wykorzystanie
3. odporność na choroby grzybowe i bakteryjne
geny enzymów które niszczą ściany komórkowe bakterii i grzybów
chitynaza (serratia marcescens )
gklukanaza ( z lucerny)
gen osmotyny w błonie komórkowej i niszczy ją (grzyby) petunia i tytoń
4. Oporność na wirusy:
Geny białek płaszcza kapsydu danego wirusa
Geny enzymów replikazy i protezy -odporność na dany wirus
Ziemniak na virus Y
Tytoń na mozaikę tytoniu
Ogórek na mozaikę ogórka
Kaloafior na mozaice kalafiora
5. Zmiany barwy kwiatu Floringene (www.floringene.com )
niebieskie kwiaty róży
modyfikacje genów ht1 i df1 odpowiedzialnych za barwę kwiatu
dłuższy okres trwałości kwiatu
Agrobacterium temufaciens
8
Białko Cry działanie
Wykład 4.
II generacja roślin:
Mają cechy bardziej istotne dla poszczególnych konsumentów
niskokaloryczne buraki cukrowe ( przekształcenie sacharozy w niskokaloryczną fruktozę)
ziemniaki ze zmodyfikowana skrobią
inne rośliny z poprawionym składem
Pomidory z opóznionym dojrzewaniem:
geny kodujące najważniejsze enzymy kontrolujące proces dojrzewania
- poligalakturonaza PG rozkłada pektyny w ścianach komórkowych
- metyloesteraza pektynowa PE demetyluje pektyny w błonach wtórnej ściany
- komórkowych
- synteza fitoenu- synteza karotenoidów
gen kodujący enzym PG w pozycji antysensownej
- 90-99% zmniejszenie aktywności poligalakturanazy w dojrzewających
owocach
gen negatywny PG- znacznie skrócony opóznione mięknięcie , zachowują czerwona barwę
Przydatność pomidorów GM dla przetwórstwa:
bardzo mała synereza
poprawa barwy
zwiększona lepkość koncentratu
niestwierdzono różnic:
zawartość cukrów redukujących
zawartość kwasu cytrynowego
zawartość pektyn
Ziemniaki:
zwiększenie zawartości s.s
wzrost zawartości skrobi
odmiany składające się wyłącznie z amylopektyny
ziemniaki z zwiększoną zawartością s.s:
gen z E.coli z pirofosforylazą ADP-galakturozową
wzrost s.s o 20-30%
zmniejszenie powstawania cukrów redukujących zachowanie jasnej barwy miąższu produkcja frytek
9
zmniejszenie kiełkowania bulwy ziemniaków GM w czasie długotrwałego przechowywania w 16 C
Amflora GM ziemniaki:
wytwarzanie skrobi zawierającej tylko amylopektynę
wstawiono gen pochodzący od innej odmiany ziemniaka w pozycji antysensownej ą zmniejszenie
zawartości amylozy i zwiększenie zawartości amylopektyny
w 2010 zezwolono na import tej odmiany w UE
Złoty ryż:
500 000 powoduje utratę wzroku z powodu niedoboru witaminy A w diecie
produkuje 20 razy więcej -karotenu niż odmiana złotego ryżu I
wprowadzono 2 geny
kodujący syntaze fitoenu
kodujący desaturazę karotenu
zawartość witaminy A w kolejnych odmianach
GR bayer Petrykus 1,6 ug/g
GR1 syngenta 6 ug/g
GR2 syngenta 37 ug/g
Zwiększenie zawartości Fe w kukurydzy:
2 geny
gen z soi wytwarzające białko ferrytynę
gen z Aspergillus fitaza rozkład kwasu fitynowego odpowiedzialne za pobieranie wydajniejsze
żelaza z gleby oraz udostępnienie go w formie przyswajalnej
III generacja roślin
GM do produkcji związków chemicznych wielkiej wartości np. sałata ze szczepionka n wirusa wzw
typu B
Raport produkcji GMO 2011
Przez międzynarodowy instytut propagowania upraw biotechnologicznych (http://www.ISAAA
International
Raport publikowany co roku od 1996 od pojawienia się produkcji na większa skalę GMO
1996 1,7 mln ha ą 2006 102 mln ha ą 2011 160mln ha
Najwięcej USA 69 mln ha Brazylia, Argentyna 30 mln, 23 mln ha , Indie Kanada 10 mln ha , W europie <
10 mln ha
Hiszpania- kukurydza bt
Portugalia- kukurydza bt
Rumunia- soja bt , kukurydza bt
Niemcy- kukurydza bt, ziemniaki
Słowacja Polska kukurydza bt
USA- soja, bawełna, lucerna, kukurydza
Około 8% wzrost powierzchni upraw 2010-2011
Największy areał:
Soja biotechnologiczna 47% światowego areału
Kukurydza biotechnologiczna 32%
Bawełna biotechnologiczna 15%
Rzepak biotechnologiczna 5%
Wśród GMO :
1. dominują rośliny z odpornością na herbicyd 59% (93,9 mln ha) na 60 mln ha (soja
rzepak kukurydza )
2. z odpornością na herbicyd i owady (bawełna, buraki, lucerna, 26% areału 42,2
mln ha
10
3. odporność na owady 15 % areału świata 26,3 mln ha.
Korzyści z upraw biotechnologicznych :
zmniejszenie zużycia pestycydów w latach 1999-2010około 443 mln kg składnika aktywnego
stałe oszczędności w emisji CO2 poprzez ograniczenie zużycia paliw kopalnych
zmniejszone ilości owadobójczych herbicydów , rozpylanych w 2010 roku było szacowane
oszczędnością ,7 mld kg CO2 w powietrzu co odpowiada zmniejszeniu liczby samochodów na drogach o
0,8 mln ( mniejsza liczba przejazdów ciągników na polach przy opryskiwaniu)
zwiększenie produktywności w przeliczeniu jednostkę powierzchni , oszczędzając tym samym wylesienie
i emisję CO2
Zwierzęta modyfikowane genetycznie:
Zwierzęta mające w swoim genomie egzogenne DNNA:
losowo zintegrowany fragment liniowego DNA
zmodyfikowanie właściwości genu przez wprowadzenie egzogennego DNA
wprowadzenie sztucznej jednostki genetycznej
Koszty transgenicznych zwierząt użytkowych:
świnie transgeniczne 25 tys. $
owce transgeniczne 60 tys. $
krowy transgeniczne 300-500 tys $
Sposoby otrzymywania :
mikroiniekcja Dna do zygoty
transfer DNA przy pomocy wirusa
modyfikacja pierwotnych komórek zarodkowych ES
transplantacja jąder komórkowych
1. mikroiniekcja Dna do zygoty
mikroiniekcja transgenu do 1 z podjądrzy jednokomórkowego zarodka (zygoty ) przy
pomocy mikrochirurgicznej szklanej pipety
przedjądrza posiadają materiał genetyczny pochodzący od ojca i matki przed połączeniem w
jedną komórkę
Etapy:
roztwór Dna w wstrzykiwany do wybranego przedjądrza
nastrzykiwane zygoty , hodowana w warunkach in vitro do stadium dwukomórkowego
zarodek przeniesiony do jajowodu matki zastępczej
ciąża/poród
( nie można kontrolowac ilosci wbudowanego transgenu , ani liczby powstałych kopii
wprowadzonego genu wydajność około 50%)
komórki macierzyste
komórki mające zdolność do podziało i różnicowania w inne komórki
w odpowiednich warunkach rozwijają się w dojrzałe komórki o określonej budowie i funkcjach
komórki macierzyste zarodka ES
komórki macierzyste dorosłego organizmu (szpik, wątroba, skóra)
3.modyfikacja pierwotnych komórek zarodkowych:
komórki ES izolowane z balstocysty , posiadają zdolności wbudowywania do tkanek rozwijającego się
zarodka po ponownym wprowadzeniu do blastocysty
Etapy:
wprowadzenie genów do komórki elektroporacja
namnażanie komórek z transgenem w odpowiednich warunkach
11
transfer komórek polarnych do blastocysty , zmodyfikowane komórki ES łączą
się z niezmodyfikowanymi komórkami zarodka tworząc organizm
Cele modyfikacji zwierząt gospodarczych:
aspekty handlowe
polepszenie lub uzyskanie nowych cech produkcyjnych ważnych żywieniowo i ekonomicznego pkt
widzenia
- szybki wzrost zwierząt hodowlanych
- lepsze wykorzystanie pasz
- redukcja tłuszczu
- doskonalenie składu mleka
- zwiększenie odporności na choroby
aspekty biomedyczne:
produkcja licznych białek przydatnych medycynie
hodowla zwierząt transgenicznych jako dawców organów dla ludzi np. serc.
Aspekty handlowe:
Szybki wzrost zwierząt hodowlanych:
wprowadzenie genu hormonu wzrostu GH do: myszy 1982, króliki 1995, owce i świnie
myszy uzyskano gigantyczne myszy (szczurzy gen wzrostu) , gen ludzki bydlęcy owczy. 2x większe
niż normalne myszy, udany proces zwierzęta płodne i przekazujące gen potomstwu , u pozostałych
zwierząt wykazywało bezpłodność
króliki ludzki gen GH przyłączony do genu metatioeniny przyspieszenie wzrostu przyspieszony
wzrost bez negatywnych efektów dla zdrowia
świnie brak zwiększonego tempa wzrostu ( mimo ekspresji genu) zaburzenia zdrowotne ( artretyzm,
owrzodzenie żołądka, podatność na infekcję, bezpłodność)
Transgeniczne Owce:
bydlęcy i ludzki hormon wzrostu
zdecydowane negatywne wyniki ( chorowały na cukrzycę, artretyzm, żadna nie przezywała roku )
przyczyna inne mechanizmy regulacji wzrostu niż przy zwierzętach modelowych)
transgeniczne ryby z hormonem wzrostu:
hormon wzrostu małych zwierząt lub ludzki
badania udane (zwierzęta dłuższe i cięższe o 6%)
pstrągi, łososie, karpie, inne gatunki ryb
Doskonalenie składu mleka
1. zmiana składu białek mleka
2. zmiana zawartości tłuszczu w mleku
3. zmiana zawartości cukrów w mleku
1. Zmiana składu białek mleka:
zmiana struktury I-rzedowej kazeiny może polepszyć jakość serów
wprowadzenie dodatkowych genów kappa-kazeiny może zwiększyć odporność mleka
na podwyższoną temperaturę
zastąpienie części genów białek krowich ludzkimi , spowoduje humanizację mleka
krowiego
zmniejszenie zawartości -laktoglobuliny białko które jest głównym alergenem mleka
2. Zmiana zawartości tłuszczu w mleku:
unieczynnianie genu (1 z wielu) enzymów uczestniczących w biosyntezie lipidów ą
zmniejszenie zawartości tłuszczu
zwiększenie udziału nienasyconych kwasów zdrowszych dla konsumentów
3. Zmiana zawartości cukrów w mleku
zmniejszenie zawartości laktozy można dokonać przez
12
unieczynnianie genu kodującego ą-laktoalbuminę
wprowadzenie genu kodującego -galaktozydazę
redukcja laktozy wpłynie korzystnie na jakość serów i innych produktów mleczarskich
np. lodów.
Aspekty biomedyczne
Zwierzęta jako żywe bioreaktory:
modyfikacje maja na celu wytwarzanie w organizmie genetycznie zmienionych genetycznie białek
wykorzystywanych jako leki
transgeneza gruczołu mlecznego w celu modyfikacji składu mleka
Bakterie transgeniczne Gruczoł mleczny
mogą produkować tylko proste białka nie mogą produkować białka wymagające
wymagające obróbki po translacyjnej obróbki po translacyjnej
wytwarzanie mostków disiarczkowych
glikozydacja reszt azotowych lub tlenowych
Transgeniczne myszy i króliki:
1987 pierwsze transgeniczne myszy wytwarzające owczą -laktoglobulinę
do wytwarzania 4 czynników krzepliwości krwi IX
przy ekspresji ludzkiego białka rzedu 1 g/l mleka wykorzystać trzeba zwierząt transgenicznych :
1 krowę
7 kóz
10 świń
3 owiec
714 królików
1. antytrombina ludzki enzym czynnik krzepliwości krwi wytwarzana w mleku
transgenicznym kóz od 2009 . lek przeciw zakrzepowy w profilaktyce zakrzepowej
2. antrypiny- w leczeniu rozedmy
3. antyerytropoetyna anemia
4. laktoryferytyna -dla osób z niedoborem Fe
zwierzęta jako dawcy narządów:
transgeniczna świnia TG-1154
gen może znieść immunoglogiczną barierę międzygatunkową pomiędzy człowiekiem u
świnią.
Ryzyko transfekcji virusowej
Drobnoustroje transgeniczne:
Prace realizowane z dbn w zamkniętych bioreaktorach , w urządzeniach w pełni izolowanych od
środowiska
produkcja hormonów
produkcja enzymów
produkcja leków
Biotechnologiczna insulina ludzka:
szczepy transgeniczne E. coli i Sachcharomycess cerevisiae
zaakceptowane od 1982
indentyczna z insulina endogenną
wytwarzaną przez komórki trzustki ludzkiej
producenci:
USA
DANIA
NIEMCY
13
Polska firma Bioton
Etapy transgenezy:
1. konstrukcja plazmidu z fragmentem DNA kodującym zmodyfikowany prekursor ludzkiej
insuliny
sekwencja kodująca zawiera tez gen dysmutazy ponadlenkowej cel zwiększenie
wydajności i ilości produkowanego białka
2. transmutacja plazmidu do E. coli
Insulina:
51 aminokwasów
w dwóch łańcuchach polipeptydowych A i B połączonych mostkami disiarczkowymi (3 mostki S-S)
łańcuch A z 21 aminokwasów
łańcuch B z 30 aminokwasów
Produkcja insuliny:
1. biosynteza w komórkach E .coli
proinsulina- jest syntetyzowana w postaci układów inkuzyjnych
gromadzonych w cytozolu w postaci złogów (mini-pre i mini
proinsulina).
2. oddzielanie biomasy od pożywki
odwirowanie komórek od płynu pofermentacyjnego w hermetycznych
wirówkach
rozbicie ścian komórkowych dezintegratorami ciśnieniowymi
odwirowanie ciał inkluzyjnych
3. transformacja enzymatyczna i oczyszczanie
usuwanie w łańcuchu A i B elementów dipeptydowych i tworzenie
mostków disiarczkowych
4. krystalizacja wychładzanie
wytracanie surowej insuliny
oczyszczanie chromatograficzne
krystalizacja i suszenie pod próżnią
5. tworzenie form farmaceutycznych (pakowanie w układy do iniekcji)
preparaty pod nazwą geninsulin R,N,M
cykl trwa 2 tygodnie
regulację 1829/2003:
biomasa drożdżowa firmy Novo Nordisk
Novo Yeast cream produkt wytwarzany z genetycznie modyfikowanych drożdży
Sachcharomyces cerevisiae
Bakteryjna biomasa firmy nimomdei
Proteina bakteryjna chlorowodorek l- lizyny pCoBl bacterial biomas
Pasze przyspieszony wzrost zwierząt
Preparaty dla sportowców
Brevibacterium lactofermntum
Lizyna niedobór powoduje zanik mięsni, odwapnienie kości, zakłócenie biosyntezy białek.
14
Wyszukiwarka
Podobne podstrony:
Współczesne trendy wykład 1Współczesne trendy zwięrzęce wykład z 02 042012 JMWspółczesne trendy w motywowaniuWspółczesne trendy wykład 3Pytania współczesne trendyWspółczesne trendy wykład 4,5Wspołczesne trendy wyklad 2317 biotechnologia wspolczesna 1Radość współczuciaWYKŁAD 1 Wprowadzenie do biotechnologii farmaceutycznejTrendy w światowej produkcji i obrocie narkotykamiWspółcześni7) Współczesne koncepcje tragizmu i tragiczności1 Współczynnik przenikania ciepła Uwięcej podobnych podstron