Wykład 3
Konstrukcje genowe i metody transformacji komórek
Kolejność etapów konstrukcji genowych
1. Pozyskiwanie genu użytkowego (transgenu):
- maszyna genowa,
- technika PCR.
2. Wyłączenie genu użytkowego do wektora- uzyskiwanie DNA hybrydowego.
3. Klonowanie DNA hybrydowego w komórkach mikroorganizmu.
4. Izolacja DNA hybrydowego z namnożonych komórek.
5. Transformacja DNA hybrydowym komórek roślinnych lub zwierzęcych.
Nośnik genu
- wektor- nośnik służący do wprowadzania i powielania fragmentów DNA w komórkach
wybranego organizmu.
- koliste cząsteczki DNA:
" naturalne plazmidy bakteryjne lub drożdżowe
" sztucznie skonstruowane cząsteczki DNA metodami inżynierii genetycznej
Cechy plazmidów:
- poruszają się swobodnie w komórce gospodarza
- replikują się niezależnie od chromosomu bakteryjnego
- namnażają się do kilku tysięcy kopii w komórce
- nie dokują funkcji niezbędnych do życia komórki, ale zwiększają szansę na różnorodność
zajmowanych środowisk (np. oporność na antybiotyki)
- łatwe do izolacji na skutek niewielkich rozmiarów
- naturalnie mogą przenośić swoje potomne kopie z jednej komórki gospodarza do innej
- cząsteczki są zazwyczaj kowalencyjnie zamknięte, koliste i super-zwinięte (pewne bakterie i
drożdże mają plazmidy liniowe)
Budowa wektora
1. Ori- miejsce inicjacji replikacji
2. Polilinker- sztuczny odcinek DNA mający kilkanaście miejsc restrykcyjnych- miejsc cięcia
wektora przez enzymy restrykcyjne
3. Geny markerowe:
" marker selektywny I- gen pozwalający odróżnić komórki, które pobrały wektor od tych, które
go nie pobrały
" marker reporterowy II- gen pozwalający odróżnić komórki, które pobrały wektor z transgenem
od tych, które pobrały wektor pusty- bez transgenu
Markery selektywne
- Gen npt-II- gen kodujący fosfotransferazę neomycyny- oporność na antybiotyk kanamycynę.
- Gen npt-II umożliwia wzrost na pożywce z kanamycyną tylko komórkom, które uległy
transformacji
- pozostałe komórki, które nie zostały transformowane na podłożu z kanamycyną giną!
Markery reporterowe
- Gen Lac Z- koduje enzym beta-galatozydazę.
- Substratem tego enzymu jest X-gal- enzym rozkłada substrat, co powoduje niebieskie
zabarwienie kolonii bakteryjnej
- Umożliwia odróżnienie komórek transformowanych wektorem bez transgenu od
transformowanych wektorem z transgenem:
- kolonie komórek z wektorem bez transgenu mają niebieskie zabarwienie
- kolonie komórek z transgenem- są białe
Działanie genu LacZ

1
Gen kodujący beta-galaktozydazę= enzym beta-galaktozydaza + X-gal (w podłożu selektywnym)-
wywołuje niebieskie zabarwienie komórek szczepu
Przeciecie enzymem restrykcyjnym genu kodującego beta-galaktozydazę -> wstawienie transgenu
-> gen kodujący beta | transgen | galaktozydazę
Gen został przerwany i komórka nie wytwarza enzymu beta-galaktozydazy- komórki pozostają
białe
Włączenie transgenu do wektora LIGACJA- (etapy A i B)
A. Przygotowanie wektora do klonowanie- trawienie enzymem restrykcyjnym w miejscu polilinkera
B. Ligacja- proces włączenia transgenu do wektora. A
ącznie końców transgenu i wektora pod
wpływem enzymu- ligazy.
Wydajność ligacji jest nieduża
- Po ligacji powstają trzy rodzaje kolistych cząsteczek:
1. Wektor z trangenem (DNA hybrydowe)
2. Odtworzony pusty wektor
3. Zamknięte w kółko DNA genu użytkowego
Klonowanie DNA hybrydowego w komórkach mikroorganizmu (Escherichia coli)
Pobranie wektorów z transgenem przez kompetentne komórki-biorców (np. bakterie)-
transformacja komórek bakterii.
Metody transformacji bakterii:
a. metoda szoku cieplnego (m. chemiczna)
b. elektroporacja (m. fizyczna)
a. metoda szoku cieplnego:
- bakterie Escherichia coli- w niskich temperaturach komórki traktowane są chlorkiem wapnia (w
lodzie)
- podgrzanie zawiesiny bakterii z DNA hybrydowym do 42 stopni C na 1 minutę
b. elektroporacja:
- umieszczenie mieszaniny protoplastów komórek bakterii z DNA hybrydowym w kuwecie aparatu
do elektroporacji:
" uruchomienie krótkiego impulsu elektrycznego,
" tworzą się pory (tunele) w błonie cytoplazmatycznej, przez które wnika DNA do wnętrza
komórki.
Efekt transformacji:
1. komórki z wektorem i transgenem
2. komórki z wektorem bez transgenu
3. komórki bez wektora
Selekcja komórek na podłożu selektywno-wzrostowym
- podłoże selektywno-wzrostowe zawiera czynniki selektywne:
- antybiotyk, np. kanamycynę,
- X-gal
1. na tym podłożu komórki, które nie przyjęły wektor-zginą
2. komórki, które przyjęły wektor z transgenem wyrosną w postaci białych kolonii
3. komórki, które przyjęły wektor bez transgenu (pusty wektor)-wyrosną w postaci niebieskich
kolonii
4. Selekcja zmodyfikowanych komórek
Wysiano na podłoże miliardy komórek po transformacji

2
Rola genów markerowych w konstrukcjach genowych
Zaleta:
- bez zastosowania markerów selektywnych i reporterowych niemożliwa byłaby selekcja komórek,
do których włączono transgen.
- Geny te są niezbędne w pierwszych etapach konstruowania GMO.
- Stosuje się geny antybiotyków względnie rzadko stosowanych w leczeniu ludzi i zwierząt.
WADA:
zastrzeżenia w stosunku do genów oporności na antybiotyki
- kiedy pomyślnie zidentyfikowane zostaną przekształcone komórki drobnoustroju lub rośliny, gen
oporności na antybiotyki staje się bezużyteczny i niepotrzebny.
- ALE: gen jest ciągle obecny w drobnoustroju czy roślinie i działa.
- są obciążeniem, którego nie da się usunąć.
- przeciwnicy GMO uważają, że: geny oporności na antybiotyki mogą być przenoszone w
pozostałościach GMO podczas trawienia w ludzkim przewodzie pokarmowym do
drobnoustrojów w nim żyjących.
- Skutek: antybiotyk przestanie być skutecznym lekiem niszczącym mikroorganizmy.
Działania zmierzające do wycofania genów oporności na antybiotyki:
- stosuje się inne markery (niebędące antybiotykami): mające odporność na herbicyd
Metody transfomacji roślin:
1. Metody wektorowe (AGROINFEKCJA)
Wykorzystują bakterie do wprowadzenia DNA hybrydowego do komórki roślinnej.
2. Metody bezwektorowe (MIKROWSTRZELIWANIE)
Nie wykorzytują bakterii do wprowadzenia DNA hybrydowego do komórki roślinnej.
Wektorowa metoda transformacji roślin
- naturalna zdolność bakterii glebowych- Agrobacterium tumefaciens
- do infekowanie roślin w miejscach zranień i przekazywaniu fragmentu megaplazmidu Ti.
- proces ten zw. jest agroinfekcją.
Agrobacterium tumefaciens:
- bakteria czeka na zranienie rośliny, a następnie przedostaje się do zranionych komórek w części
znajdującej się na poziomie gleby,
- fragment T-DNA zostaje wycięty i owinięty specjalnymi białkami zabezpieczającymi,
- kompleks T-DNA-białko jest wprowadzany do komórki rośliny przez kanał łączący komórkę
bakteryjną z komórką roślinną,
- T-DNA łączy się z DNA komórki roślinnej,
- komórka roślinna rozpoczyna syntetyzować białka zgodnie z sekwencją zawartą w genach T-
DNA:
- geny kodujące syntezę opin,
- geny kodujące syntezę fitohormonów.
- roślina produkuje opiny- pochodne aminokwasów, są wykorzystywane preferencyjnie przez
bakterie jako z
ródło C i N,
- nadprodukcja fitohormonów stymuluje podziały komórkowe (powstaje tkanka nowotworowa),
- roślina zmienia się w zbryloną masę komórek,
- wynikiem jest powstawanie w roślinie choroby zwanej guzowatością korzeni.
Etapy tworzenia roślin GM przy użyciu metody agroinfekcji (egzamin !!!):
1. Przygotowanie hodowli Agrobacterium tumefaciens
2. Zainfekowanie komórek roślinnych poprzez bakterie A. tumefaciens
3. Wyselekcjonowanie pozytywnych mutantów roślin
4. Ukorzenienie transformowanych roślin
5. Przystosowanie zmodyfikowanych roślin do wzrostu w warunkach polowych

3
Przygotowanie szczepów Agrobacterium tumefaciens
1. Modyfikacja megaplazmidu Ti- polega na usunięciu z odcinka T-DNA genów syntezy opin i
fitohormonów.
2. Wprowadzenie transgenu do drugiego małego wektora. Wektor zawiera markery selektywne.
3. Transformacja komórek bakteryjnych A. tumefaciens małym plazmidem z trangenem
4. Klonowanie konstrukcji genowej w komórkach A. tumefaciens na podłożu selektywnym.
EFEKT: transgenicze komórki A. tumefaciens
Zainfekowanie komórek roślinnych
- koinkubacja- inkubacja fragmentów roślin z transgenicznymi komórkami A. tumefaciens w
zawiesinie wodnej,
- przekazanie komórkom roślinnym transgenu.
Selekcja zmodyfikowanych komórek roślinnym- kokultura na pożywce agarowej
Metody bezwektorowe
Polegają na bezpośrednim wprowadzeniu DNA hybrydowego do komórek roślinnych:
1. Mikrowstrzeliwanie komórek roślinnych (metoda biolistyczna)
- DNA miesza się z kuleczkami złotymi lub wolfranowymi (0,5-5 mikrom),
- jeden mikronośnik pokryty jest od 0,01 do 0,1 pg DNA hybrydowego (m.in. zawiera transgen i
gen selektywny)
- pokryte DNA kuleczki umieszcza się na linii podmuchu strumienia helu, tak aby kuleczki
mogły dostać się do komórek roślinnych,
- prędkość pocisków wynosi kilkaset metrów na sekundę,
- transgen jest wbudowywany do genomu komórki-biorcy,
- selekcja transformowanych komórek na pożywce selektywnej,
- regeneracja kalusa i odtworzenia pełnej rośliny,
- metodę najczęściej stosuje się do: pszenicy, ryżu i kukurydzy.

4