Biotechnologia współczesna
Co to jest  biotechnologia ?
�� Jest to interdyscyplinarna dziedzina nauki, integrująca nauki przyrodnicze i
inżynieryjne w celu osiągnięcia zastosowao organizmów, komórek lub ich części oraz
molekularnych analogów do pozyskiwania produktów lub usług
�� Podstawowe terminy biotechnologiczne:
�� Ex vivo: wyodrębnienie określonych komórek z organizmu, ich modyfikacja
genetyczna In vitro i powtórne wprowadzenie do organizmu
�� In vivo: wprowadzenie genu (np. z wektorem) do organizmu
�� In vitro: modyfikacja genetyczna poza organizmem (w laboratorium)
�� Transformacja: proces przeniesienia DNA wyizolowanego z hodowli
bakteryjnej do bakterii biorcy
�� Transfekcja: proces przeniesienia DNA wyizolowanego z bakteriofaga do
bakterii biorcy lub proces przeniesienia DNA do komórek eukariotycznych
�� Transgenizacja: proces transformowania całych organizmów, w wyniku
którego organizm ulega modyfikacji genetycznej
�� Transgen: gen przeniesiony do organizmu, w wyniku czego powstaje organizm
transgeniczny
�� Sonda genetyczna: jednoniciowy kwas nukleinowy (DNA/RNA) znakowany
radioaktywnie, używany do identyfikacji komplementarnej sekwencji dzięki
parowaniu zasad
�� Wektor: czynnik (np. plazmid lub wirus) przenoszący informacje genetyczną
�� Cząsteczki adaptorowe: krótkie fragmenty DNA z jednej strony tępe, a z
drugiej posiadające specjalnie przygotowane lepkie kooce, właściwe dla danej
restryktazy
�� Linkery: tępo zakooczone sekwencje łącznikowe zawierające miejsca cięcia
dla określonych restryktaz
Inżynieria genetyczna
�� DNA jako podstawowy materiał dla inżynierii genetycznej
�� Metody pracy z DNA:
1. Wydzielanie czystego DNA z komórek i tkanek na drodze homogenizacji polega
na rozdrobnieniu mechanicznym fragmentu badanej tkanki w celu zniszczenia ich
struktur komórkowych. Następnie to tak otrzymanej zawiesiny dodaje się
detergentu powodującego rozpad błony komórkowej oraz uwolnienie DNA do
roztworu. Kolejną czynnością jest dodanie proteazy (enzym trawiący białko), w
celu oddzielenia od DNA towarzyszących mu białek, które są następnie
denaturowane przy użyciu ciekłego fenolu. Ostatnim etapem jest dodanie do
niemieszającej się fazy wodnej DNA i fenolu, który wytrąca DNA w postaci białych
włókienek, które po rozpuszczeniu są gotowe do dalszej obróbki.
1 Wykorzystanie działania enzymów restrykcyjnych w praktyce
2. Fragmentacja DNA wydzielonego z komórek jest niezbędna dla dalszej nad nim
pracy, gdyż otrzymane w ten sposób czyste fragmenty DNA zawierają olbrzymie
ilości par zasad, a do dalszej obróbki najkorzystniejsze jest otrzymanie
fragmentów o długości jednego genu. W tym celu wykorzystuje się nukleazy
restrykcyjne wyizolowane z bakterii i charakteryzujące się zdolnością do
przecinania DNA jedynie w miejscach występowania określonych,
rozpoznawanych jedynie przez dany enzym, krótkich sekwencji zasad. W
konsekwencji ich działania otrzymywane są fragmenty:
�� Lepkie kooce: efekt przecięcia DNA, w taki sposób, że miejsca cięcia w
niciach komplementarnych są przesunięte w stosunku do siebie o kilka par
zasad, co powoduje powstawanie krótkich odcinków jednoniciowego DNA
komplementarnych do siebie.
Sekwencje lepkich kooców powstałych w wyniku działania tego samego
enzymu są komplementarne i mogą łatwo hybrydyzowad ze sobą. W
obecności enzymu (ligazy DNA) można takie cząsteczki połączyd
kowalencyjnie, co jest wykorzystywane przy rekombinowaniu DNA
�� Tępe kooce: efekt przecięcia obu nici DNA w miejscach położonych
naprzeciwko siebie, co powoduje powstawanie krótkich fragmentów DNA
nie będących komplementarnymi dla siebie.
Tępe kooce można
poddad
odpowiednim
modyfikacjom
umożliwiając ich
wykorzystanie w
procesie
rekombinacji DNA.
Jedną z nich jest
dołączenie
cząsteczek
adaptorowych
bądz
linkerów
(przed
dołączeniem
linkerów
niezbędna jest
metyzacja
genomowego
DNA dla ochrony
przed enzymem
restrykcyjnym
używanym do
2 Schemat klonowania DNA przy zastosowaniu wektora bakteryjnego
wytwarzania
lepkich kooców po przyłączeniu linkerów)
3. Metoda elektroforezy posiadających ładunek związków organicznych uwzględnia
ich różną szybkośd w poruszaniu się w polu elektrycznym. Przeprowadza się ja
umieszczając roztwór DNA w studzienkach wyciętych w agarozowym bloczku
umieszczonym w płaskim naczyniu wypełnionym roztworem soli oraz
posiadającym elektrody podłączone do z
ródła stałego prądu na przeciwległych
brzegach. Fragmenty DNA wędrują do elektrod poruszając się w polu
elektrycznym odpowiednio do swojej wielkości. Po zakooczeniu procesu
umieszcza się bloczek w roztworze barwiącym DNA, który wybarwia prążki
cząsteczek DNA o określonej długości.
4. Ligaza DNA jako metoda łączenia ze sobą rozdzielonych nukleazami
restrykcyjnymi fragmentów DNA (zarówno tych o lepkich, jak i tępych koocach).
�� Klonowanie DNA jest metodą pracy z DNA pozwalającą na otrzymanie milinów
identycznych kopii cząsteczek DNA o żądanej sekwencji. Na początku tego procesu
wyizolowane z komórki człowieka DNA oraz plazmidy bakteryjne/ bakteriofagowe
tnie się przy użyciu odpowiednich restryktaz pozostawiających lepkie kooce.
Następnie miesza się przecięte fragmenty DNA i plazmidów, które odnajdują
wzajemnie swoje wolne kooce i pod wpływem dodanej ligazy wytwarzają między
sobą wiązania kowalencyjne (zrekombinowany plazmid). Tak powstały wektor (służy
do przenoszenia fragmentów DNA do komórek, sztucznie zmodyfikowany)
wprowadza się do komórek bakterii, który to proces musi poprzedzid umieszczenie
bakterii w roztworze chlorku wapnia o temperaturze 273 K w celu osłabienia ich ścian
komórkowych i umożliwienia wprowadzenia wektora (transformacja). Następnie na
drodze hybrydyzacji (powstawanie dwunicieniowych struktur z połączenia
komplementarnych nici DNA), za
pomocą sondy (krótki fragment
poszukiwanej sekwencji z
dodatkiem radioaktywnego
fosforu) identyfikuje się kolonię
bakterii zawierającą poszukiwaną
sekwencję. W metodzie z sondą
należy uprzednio przyłożyd do
powierzchni hodowli
celulozowy/ nylonowy krążek do
którego przyczepiają się komórki
z każdej kolonii dając replikę
wszystkich kolonii na szalce.
Następnie krążki płucze się w
roztworze wodorotlenku sodu
powodując rozpad DNA na
fragmenty jednonicieniowe i
wiąże się je promieniami UV z
podłożem. Tak przygotowany
krążek umieszcza się w
3 Hybrydyzacja DNA przy użyciu sondy
roztworze z sondą, która
przyłącza się tylko do sekwencji komplementarnej do niej. Po wypłukaniu i
wysuszeniu przykłada się go w ciemności do kliszy fotograficznej i wywołuje (jeżeli
nastąpiło zespolenie DNA z sondą powstaje zaciemnienie na kliszy, jej porównanie z
oryginalną szalką pozwala zidentyfikowad poszukiwaną kolonię). Z tak
zidentyfikowanej kolonii pobiera się małą ilośd bakterii i umieszcza na kilkanaście
godzin w świeżej pożywce, po czym z mikroorganizmów izoluje się plazmidy
poddawane następnie działaniu nukleazy restrykcyjnej oraz procesowi elektroforezy,
podczas której jeden z powstałych prążków będzie utworzony wyłącznie z
poszukiwanego fragmentu DNA. W ten sposób proces klonowania zostaje
zakooczony.
�� Biblioteka DNA to zbiór bakterii transformowanych plazmidami zawierającymi
fragmenty reprezentujące poszczególne sekwencje całego DNA danego organizmu:
�� Genomowa: zawiera fragmenty DNA występujące w jadrze
komórkowym (eksony, introny, sekwencje promotorowe)
��  cDNA : zawiera tylko sekwencje DNA kodujące białka (brak
intronów) otrzymane z preparatu m RNA wszystkich komórek
organizmu przepisanego z powrotem na DNA (odwrotna
transkryptaza)
�� Korzyści płynące z zastosowania bakterii transformowanych ludzkimi genami:
�� Możliwośd otrzymywania na dużą skalę białka występującego w
organizmie człowieka w znikomych ilościach,
�� W przeciwieostwie do preparatów, które mogłyby byd pozyskiwane z
tkanek człowieka czy zwierząt, są one pozbawione ludzkich czynników
zakaz
nych: wirusów i prionów
�� Białka terapeutyczne: insulina, czynnik VIII (uczestniczy w krzepnięciu
krwi), erytropoetyna, aktywator plazminogenu (rozpuszcza zakrzepy),
hormon GH,
�� Otrzymywanie antygenów stosowanych jako szczepionki.
�� Sekwencjonowanie DNA
4 Schematy wyników sekwencjonowania DNA
�� Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (RELP) jako metoda ustalania
tożsamości wykorzystująca analizę przecinania DNA nukleazami restrykcyjnymi
(wykorzystanie wzoru utworzonego w genomie przez mutacje punktowe
charakterystyczne dla konkretnej osoby, uniemożliwiające działanie nukleaz
restrykcyjnych w miejscu ich występowania). W jej przebiegu rozcina się DNA
określoną kombinacją nukleaz i powstałe fragmenty poddaje elektroforezie.
Następnie przeprowadza się hybrydyzację z użyciem określonej sondy, ujawniając
wzór odcinków, które zawierają te sekwencje (zależny o mutacji punktowych).
Metoda ta jest stosowana do ustalania pokrewieostwa, ojcostwa, oraz przynależności
danych próbek DNA do konkretnej osoby.
�� A
aocuchowa reakcja polimerazy (PCR) jako metoda otrzymywania dowolnej liczby
kopii fragmentu DNA o określonej sekwencji wykorzystująca zdolnośd polimerazy
DNA do kopiowania jednoniciowych odcinków DNA. Na początku procesu
dwuniciowy DNA umieszcza się w roztworze ze starterami (krótkie odcinki DNA
komplementarne do początku i kooca fragmentu DNA, który ma byd sklonowany),
czterema rodzajami
trifosfonukleozydów
oraz polimerazą Taq
DNA (termoodporną),
który jest ogrzewany
do temperatury 363 K
powodując
denaturację DNA do
dwóch
komplementarnych
nici. Następnie
roztwór jest
schładzany do 323-
333 K wywołując
przyłączanie się
starterów do kooców
pojedynczych nici oraz
rozpoczęcie działania
polimerazy Taq i
wydłużanie nici. Cały
cykl powtarza się
kilkadziesiąt razy.
Różnica między PCR a
5 Schemat przebiegu PCR
klonowaniem polega
na tym, że do rozpoczęcia PCR niezbędna jest znajomośd początkowego i koocowego
fragmentu DNA, który ma byd powielany, a niewymagana jest obecnośd wektorów
ani bakterii. W przypadku klonowania sytuacja jest dokładnie odwrotna
Wykorzystanie PCR: badanie śladów zbrodni, diagnostyka chorób oraz zakażeo
wirusowych u roślin i zwierząt, kontrolowanie pochodzenia żywności (rozróżnianie
żywności transgenicznej i nietransgenicznej)
Organizmy transgeniczne
�� Organizm transgeniczny to taki, którego wszystkie komórki zawierają w swoich
chromosomach transgen (obcy fragment DNA) wprowadzony za pomocą metod
inżynierii genetycznej (transformacja) = GMO
�� Warunek: transgen musi byd w komórce transkrybowany, a jego transkrypt
wykorzystywany w komórce do syntezy
białka (obecnośd w transgenie genu
kodującego białko oraz promotora
pozwalającego na jego transkrypcję)
�� Cel: zmiana właściwości organizmu, do
którego wprowadzany jest transgen
poprzez ekspresję zawartej w nim
informacji
�� Otrzymywanie roślin transgenicznych
�� Z wykorzystaniem plazmidu Ti z
bakterii Agrobacterium
tumefaciens, po usunięciu z
niego fragmentu DNA
odpowiedzialnego za
wywoływaną przez te bakterie
chorobę roślin,
�� Przy użyciu strzelby genowej z
kuleczkami złota, do których
przylepione są fragmenty DNA,
które po wniknięciu do komórki
dostają się do jądra i są
włączane do genomu
�� Wprowadzanie obcego DNA do
komórek zwierzęcych (nie są to
organizmy transgeniczne!)
�� Zakażanie komórek wirusem
6 Otrzymywanie roślin transgenicznych z zastosowaniem
plazmidu Ti
pozbawionym sekwencji DNA
umożliwiającej namnażanie się go w organizmie, a posiadającym w genomie
wstawiony transgen,
�� Umieszczanie komórek zwierzęcych w roztworze zawierającym obce DNA,
�� Wstrzykiwanie DNA do komórek
�� Otrzymad zwierzę transgeniczne można jedynie poprzez wprowadzenie DNA do
zapłodnionej komórki jajowej ssaka, która jest następnie wprowadzana do macicy
samicy (implantacja), rozwija się zarodek i nowy organizm przychodzi na świat (nie
zawsze aktywna transkrypcja zachodzi w całym organizmie)
�� Zastosowanie GMO:
�� Otrzymywanie rzadkich ludzkich białek z komórek zwierząt transgenicznych
(nie wszystkie białka wytwarzane przez bakterie są pełnowartościowe ze
względu na brak enzymów je modyfikujących),
�� Otrzymywanie roślin transgenicznych odpornych na szkodniki, choroby,
herbicydy o lepszej jakości i wyższej wartości użytkowej,
�� Regulacja tempa dojrzewania roślin t. oraz ich składu chemicznego
Współczesna biotechnologia w medycynie
�� Komórki macierzyste: częściowo zróżnicowane komórki, które w razie
zapotrzebowania ponownie się dzielą (liczba tych podziałów jest jednak ograniczona),
występują m. In. w szpiku kostnym, mózgu, krwi, tkance tłuszczowej, skórze,
mięśniach szkieletowych, trzustce, wątrobie
�� Zarodkowe komórki macierzyste: całkowicie niezróżnicowane (nie tracą możliwości
podziału), w stadium blastuli tworzą warstwę komórek otaczającą wypełnioną
płynem przestrzeo, które można pobrad za pomocą mikropipety i hodowad na
pożywkach aż do konieczności ich zróżnicowania w odpowiednią tkankę (za pomocą
podania czynnika wzrostowego)
�� Klonowanie organizmów
Mechanizm: umieszczenie jądra pobranego z komórki somatycznej dorosłego
osobnika i umieszczenie go w oocycie pozbawionym własnego materiału
genetycznego; białka cytoplazmy oocytu odróżnicowują materiał genetyczny komórki
somatycznej i jest zdolny do dalszego rozwoju po umieszczeniu w macicy matki
zastępczej
�� Etapy
7 Schemat przebiegu klonowania
klonowania organizmów:
1. Pobranie komórek somatycznych dawcy i poddanie ich hodowli In vitro
2. Wyizolowanie z pobranych Komorek somatycznych dawcy jądra
3. Pobranie komórki jajowej biorcy i usunięcie z niej jądra
4. Wprowadzenie wyizolowanego jądra komórek somatycznych dawcy do
pozbawionej jądra komórki jajowej biorcy
5. Pobudzenie zmodyfikowanej komórki jajowej do podziałów
6. Implantacja powstałego zarodka do macicy biorcy
7. Uzyskanie organizmu identycznego genetycznie w stosunku do organizmu
dawcy
�� Diagnostyka genetyczna przy zastosowaniu metody PCR do ustalania mutacji w
danych odcinkach DNA, określaniu odmian choroby i wykrywania obecności
patogenów oraz pasożytów
�� Terapia genowa (np. w przypadku wrodzonego zespołu niedoboru
immunologicznego)
�� Międzynarodowe banki sekwencji
Współczesna biotechnologia a etyka
�� Czy rośliny transgeniczne mogą wytwarzad szkodliwe dla człowieka produkty
uboczne, chociażby alergeny?
�� Czy transgeny mogą rozprzestrzenid się w środowisku przez krzyżowanie z
pokrewnymi organizmami dzikimi?
�� Czy wiedza o genetycznej podatności osób na niektóre choroby może stad się
przyczyną ich dyskryminacji?
�� Czy technologia In vitro oraz klonowanie człowieka mogą zostad społecznie
zaakceptowane?
Praktyczne zastosowania osiągnięd inżynierii genetycznej
�� Testy genetyczne w celu ustalenia, czy dana osoba ma określoną mutację genową,
związaną z występowaniem np. mukowiscydozy, hemofilii, anemii sierpowatej,
określenie ryzyka zachorowania m. In na nowotwory, co umożliwia odpowiednią
profilaktykę, szybkie wykrycie choroby i odpowiednie działania lecznicze
�� Terapia genowa (użycie specyficznego DNA do leczenia choroby poprzez naprawę
defektu genetycznego)
�� Produkcja środków farmaceutycznych np. insuliny (podawana insulino zależnym
diabetykom), hormonu GH (podawany dzieciom wykazującym niedobory wzrosty,
szczególnie przy karłowatości przysadkowej), ludzkiego czynnika krzepliwości krwi VIII
(leczenie hemofilii typu A), tkankowego aktywatora plazminogenu (terapia chorób
naczyo krwionośnych i serca gdyż jest białkiem zapobiegającym powstawaniu
zakrzepów i rozpuszczającym je), tkankowego czynnika wzrostowego beta (leczenie
ran oraz oparzeo, aktywuje wzrost naczyo krwionośnych i skóry)
�� Produkcja szczepionek
�� Typowanie DNA wykorzystywane w identyfikacji ofiar katastrof, określaniu linii
komórkowych nowotworów ludzkich, wykrywaniu skażonej żywności, w badaniach
genetycznych przodków populacji ludzkich, przy ustalaniu ojcostwa dziecka
�� Organizmy genetycznie modyfikowane i ich wykorzystanie w medycynie oraz
rolnictwie (czyt. wyżej)
�� RELP i PCR wykorzystywane w kryminologii do ustalania/ potwierdzania tożsamości
przestępców oraz ofiar nie mogących byd rozpoznanych na podstawie cech
fenotypowych
�� Umożliwianie bezpłodnym rodzicom posiadanie własnego potomstwa (zapłodnienie
In vitro  metoda polegająca na połączeniu komórki jajowej i plemnikowej w
warunkach laboratoryjnych oraz póz
niejszym umieszczeniu zarodka w macicy matki;
In vivo  mechaniczne wtryśnięcie plemników pobranych wcześniej od dawcydo dróg
rodnych kobiety)
�� Hodowla organów zastępczych dla zwiększenia liczby i skuteczności przeszczepów
Bibliografia:
1. Solomon, Berg, Martin;  Biologia ; Warszawa, Multico, 2007r.
2. Grykiel, Mazurek i inni;  Tablice biologiczne , Gdaosk. Podkowa, 2007r.
3. Falkowski, Foremniak i inni;  Matura 2010  Vadenecum biologia , Gdynia, Operon, 2006r.
4. Spalik;  Biologia częśd 3, Podręcznik dla liceum ogólnokształcącego, liceum profilowanego i
technikum - kształcenie w zakresie rozszerzonym , Warszawa, WSiP, 2004r.
5. Zakład Genetyki Uniwersytetu Warszawskiego  Genetyka molekularna
(http://www.igib.uw.edu.pl/skrypt_genetyka_molekularna.pdf)
6. http://www.biotechnolog.pl/
7. http://gmwh.republika.pl/index/enz.htm