MIKROBIOLOGIA TECHNICZNA  studia zaoczne Ćwiczenie 3
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
ĆWICZENIE 3: IDENTYFIKACJA I CHARAKTERYSTYKA
BIOCHEMICZNA WYIZOLOWANYCH SZCZEPÓW BACILLUS
Wstęp
Do rodziny Bacillaceae zalicza się laseczki, ba ogół gramdodatnie zdolne do wytwarzania
przetrwalników o wysokiej oporności na działanie czynników chemicznych i fizycznych.
Należą tu dwa rodzaje: tlenowce Bacillus i beztlenowce Clostridium.
Występowanie
Bakterie rodzaju Bacillus, dzięki możliwości tworzenia przetrwalników, są szeroko
rozpowszechnione w przyrodzie. Zawdzięczają to także zdolnościom adaptowania się do
warunków środowiska i aktywny rozwój w otoczeniu o dużej rozpiętości temperatur, pH
i zasolenia. Można je spotkać w glebie, w wodach słodkich i słonych, mule, osadach wód
powierzchniowych, gorÄ…cych z
ródłach, na rożnych częściach roślin, w przewodzie
pokarmowym zwierząt czy psującej się żywności.
Bakterie z rodzaju Bacillus najpospolitsze są w glebie. Występują tu zarówno gatunki
mezofilne, jak i psychrofilne. Zaliczane sÄ… do zymogenicznej mikroflory gleby, a
więc w przeciwieństwie do autochtonicznej, ich intensywny rozwój występuje w
przypadku dużego napływu do gleby materii organicznej (np. opad liści w lesie,
nawożenie obornikiem itp.). Uczestniczą w mineralizacji gleby. W przypadku
niekorzystnych warunków mogą penetrować środowisko w poszukiwaniu dostępu do
substancji odżywczych (gatunki urzęsione) lub tworzą endospory. Głównym
przedstawicielem laseczek glebowych jest Bacillus cereus, nieco mniej liczne sÄ… B.
licheniformis, B. subtilis, B. pumilus. SÄ… to bakterie o niewielkich wymaganiach
pokarmowych. Bardziej wymagajÄ…ce gatunki (B. psychrosaccharolyticus, B.
polymyxa, B. macerans, B. azotofixans) rosną głównie w strefie ryzosfery, korzystając
z substancji odżywczych wydzielanych przez rośliny i odwdzięczając się im
wiÄ…zaniem azotu atmosferycznego.
Bakterie występują też w wodzie. W wodach słodkich klimatu umiarkowanego
spotyka się te same gatunki co w glebach, tylko w mniejszych ilościach. W gorących
z
ródłach, gejzerach i jeziorach o wysokich temperaturach swoją niszę znalazły gatunki
termofilne, które nie rosnÄ… w temperaturze poniżej 45ºC (Bacillus stearothermophilus
i Bacillus thermoruber). W przybrzeżnych wodach morskich i ujściach rzek
(zwłaszcza zanieczyszczonych) spotyka się bakterie glebowe: B. subtilis i B.
licheniformis. W wodach morskich o dużej czystości rozwija się B. cereus. W wodach
i glebach zasadowych spotyka siÄ™ laseczki alkalofilne (B. firmus, B. alcalophilus, B.
lentus).
Bakterie z rodzaju Bacillus powszechnie występują w ściółce i na martwych
tkankach roślin, aktywnie uczestnicząc w II fazie ich rozkładu (B. megaterium, B.
cereus, B. mycoides). Bakterie te wydzielają liczne enzymy, w tym rozkładające
biopolimery i pochodne aromatyczne, przyczyniając się do rozkładu martwych
liści drzew bogatych w taniny i ligniny.
Bakterie występujące na powierzchni żywych roślin, często są dostarczycielami
azotu (asymilowanego z powietrza), chroniÄ… przed szkodliwymi owadami (wydzielajÄ…
´-endotoksyny), zapobiegajÄ… lub hamujÄ… rozwój chorób grzybiczych.
__________________________________________________________________________________________
KATEDRA TECHNOLOGII FERMENTACJI I MIKROBIOLOGII TECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
1
MIKROBIOLOGIA TECHNICZNA  studia zaoczne Ćwiczenie 3
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
Niektóre gatunki Bacillus występują w przewodzie pokarmowym zwierząt
uczestniczÄ…c w procesach trawienia. B. coagulans, B. licheniformis, B. circulans, B.
laterosporus, B. pumilus znaleziono w żwaczu przeżuwaczy, gdzie pomagają w
degradacji białek, hemiceluloz, ksylenu, glikozydów.
Morfologia i fizjologia
Bakterie z rodzaju Bacillus są tlenowymi lub względnie beztlenowymi,
gramdodatnimi laseczkami, często tworzące układy łańcuszkowe. Tworzą cylindryczne,
ruchliwe komórki o przeciÄ™tnych dÅ‚ugoÅ›ciach 1-3 µm, ale bywajÄ… też wiÄ™ksze (Bacillus
meganterium zalicza się do jednych z największych bakterii).Urzęsienie głównie
peritrichalne lub biegunowe. Spotyka się jednak również szczepy nieurzęsione i
nieruchliwe (B. anthracis).
Ze względu na kształt i rozmieszczenie przetrwalników w komórce bakterie
rodzaju Bacillus dzieli siÄ™ na trzy grupy:
- laseczki wytwarzające przetrwalniki o średnicy mniejszej od sporangium, o kształcie
owalnym lub cylindrycznym: B. anthracis, B. cereus, B. megaterium, B. licheniformis,
B. subtilis, B. thuringiensis,
- laseczki wytwarzające przetrwalniki o średnicy większej od sporangium (komórka
macierzysta ulega rozszerzeniu), o kształcie owalnym lub kulistym: B. macerans, B.
stearothermophilus, B. circulans, B. polymyxa,
- laseczki wytwarzające duże kuliste endospory o średnicy większej niż komórka
macierzysta, położone terminalnie: B. pasteurii, B. sphaericus.
Wśród bakterii Bacillus znane są gatunki mezofilne, termofilne, psychrofilne, a
nawet psychrotrofowe. WiÄ™kszość dobrze roÅ›nie w temperaturze pokojowej oraz w 37ºC (B.
licheniformis, B. subtilis). Gatunki termofilne nie rosnÄ… w temperaturze poniżej 45ºC, należą
do nich m.in. Bacillus stearothermophilus i Bacillus thermoruber. Do typowych
zimnolubnych bakterii zalicza siÄ™ Bacillus macquariensis, B. psychrophilus i B.
psychrosaccharolyticus. Liczne gatunki z rodzaju Bacillus mogÄ… bez wyraz
nych zmian
metabolicznych adaptować się do warunków środowiska, np. gatunki mezofilne (B.
licheniformis, B. subtilis, B. coagulans, B. badius, B. smithii) mogą rosnąć w temperaturach
siÄ™gajÄ…cych 60-70ºC. SÄ… to tzw. termotolerancyjne laseczki.
Bakterie Bacillus, w zależności od gatunku wymagają do wzrostu środowiska o
różnym pH. Grupa laseczek alkalofilnych (B. firmus, B. alcalphilus, B. lentus, B. pasteurii)
preferuje pH zasadowe, natomiast B. subtilis, B. coagulans, B. licheniformis, B. circulans, B.
laterosporus, B. pumilus lepiej rosną w pH obojętnym.
Niektóre laseczki są halofilne (B. globisporus, B. marinus, B. halophilus).
Metabolizm
Bacillus należą do grupy wybitnie heterogennych chemoorganotrofów. Dobrze rosną
na podłożach bulionowych (wyj. B. larvae). Na agarze rosną w postaci dużych kolonii o
rozmiarach 3-5 mm. W płynnym bulionie rosną w postaci kożucha lub tworzą zmętnienie w
całej objętości pożywki.
Wymagania pokarmowe są bardzo zróżnicowane gatunkowo. Są gatunki, którym
wystarczajÄ… pojedyncze z
ródła węgla, azotu i energii (B. cereus, B. licheniformis, B. pumilus,
B. subtilis), inne potrzebują kompleksowych podłoży z dodatkowymi czynnikami wzrostu
__________________________________________________________________________________________
KATEDRA TECHNOLOGII FERMENTACJI I MIKROBIOLOGII TECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
2
MIKROBIOLOGIA TECHNICZNA  studia zaoczne Ćwiczenie 3
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
(witaminy, aminokwasy) np. B. azotofixans, B. macerans, B. polymyxa, B.
psychrosaccharolyticus.
Wykorzystywane do wzrostu substancje organiczne, metabolizowane są w komórkach
Bacillus w procesach tlenowych i/lub fermentacyjnych. U niektórych gatunków tlen, jako
akceptor elektronów, może być zastąpiony przez jony NO3- (oddychanie azotanowe u
B. licheniformis). Niektóre gatunki (B. polymyxa, B. macerans i B. azotofixans) mogą wiązać
azot atmosferyczny. Gatunki oddychajÄ…ce beztlenowo przeprowadzajÄ… fermentacjÄ™
sacharydów. B. cereus i B. licheniformis wytwarzają 2,3-butandiol, glicerol, CO2 i niewielkie
ilości mleczanu oraz etanolu. B. polymyxa i B. macerans rozkładają skrobię i pektyny, przy
czym B. polymyxa daje 2,3-butandiol, CO2 H2 i etanol, a B. macerans  etanol, aceton, octan i
mrówczan, CO2 i H2. Właśnie na podstawie produktów fermentacji rozróżnia się
poszczególne gatunki z rodzaju Bacillus. Alkalofilna bakteria B. pasteurii może rozkładać
mocznik (ureaza).
Podczas wzrostu wegetatywnego bakterie Bacillus gromadzÄ… kwasy organiczne
powodując zakwaszanie środowiska nawet do pH 4,0-5,0. Jest to spowodowane tym, że
powstający w glikolizie pirogronian nie jest włączany jako acetylo-CoA do cyklu Krebsa
(niektóre enzymy tego cyklu są zablokowane  represja kataboliczna), tylko wchodzi w cykl
glioksalowy. Cykl Krebsa jest uruchamiany dopiero w trakcie przygotowania do sporulacji.
W końcowej fazie wzrostu wykładniczego, gdy wyczerpaniu ulegają łatwo przyswajalne
z
ródła węgla i energii, a komórki zaczynają się przygotowywać do wytworzenia endospor,
odblokowywane są enzymy cyklu Krebsa i acetylo-CoA ulega całkowitemu utlenieniu do
CO2. Powstaje też wtedy dużo ATP niezbędnego przy sporulacji. Wtedy też, w warunkach
tlenowych, zostają utlenione nagromadzone wcześniej kwasy organiczne, a pH środowiska
wzrasta.
Chorobotwórczość
Wśród bakterii Bacillus jedynie B. anthracis jest uważany za gatunek silnie
patogenny dla człowieka i innych ssaków (a nawet kręgowców). Endospory tego gatunku, są
bardzo odporne na warunki środowiska i mogą wiele lat oczekiwać w glebie czy wodzie. Ich
przedostanie się do żywności powoduje chorobę zwaną wąglikiem, której śmiertelność wśród
zwierząt sięga 100%. U ludzi  stykających się zawodowo z materiałem pochodzenia
zwierzęcego (szczególnie skóry, wełna, sierść)  choroba ma łagodniejszy przebieg, choć jej
postaci płucna lub jelitowa także mogą przebiegać ciężko i prowadzić do śmierci.
Z B. anthracis blisko spokrewniony jest B. cereus, wywołujący zatrucia pokarmowe, lokalne
infekcje ran, choroby oczu, posocznicę i in. Ze względu na swoje występowanie w glebie,
zatrucia tymi laseczkami są dość powszechne (łatwość przedostania się do produktów
spożywczych, szczególnie niedokładnie umytych owoców, warzyw). Patogenami są także
Bacillus alvei, B. popilliae i B. larvae wywołujące choroby pszczół i chrząszczy.
Pozostałe gatunki uważa się za saprofity, jakkolwiek mogą wywołać infekcje w przypadku
osłabienia organizmu.
Znaczenie dla przemysłu
Względnie tlenowe laseczki z rodzaju Bacillus mogą odgrywać negatywną rolę w
przemyśle spożywczym, powodując psucie się różnego rodzaju produktów
konserwowanych: mięsnych, warzywnych i mlecznych. Najczęściej przyczyną jest B.
licheniformis (produkuje gaz wywołując psucie się konserw połączone z bombażem), a w
konserwach zawierajÄ…cych skrobiÄ™ B. stearothermophilus (psucie z zakwaszeniem, bez
bombażu puszek). B. coagulans odpowiada za psucie się konserw mlecznych.
__________________________________________________________________________________________
KATEDRA TECHNOLOGII FERMENTACJI I MIKROBIOLOGII TECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
3
MIKROBIOLOGIA TECHNICZNA  studia zaoczne Ćwiczenie 3
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
Najważniejszą rolę bakterie z rodzaju Bacillus odgrywają jednak w przemyśle
enzymatycznym. Prawie 60% produkowanych w światowej skali preparatów
enzymatycznych przypada na proteinazy (w tym subtilizyny, enzymu stosowanego do
produkcji środków piorących) i ą-amylazy otrzymywane w oparciu o hodowlę bakterii
Bacillus (tab. 1.). W odróżnieniu od bakterii gramujemnych nie posiadają w swej ścianie
komórkowej toksycznych lipopolisacharydów oraz mają tylko pojedynczą warstwę
membrany cytoplazmatycznej co ułatwia sekrecję wytwarzanych przez nie enzymów.
TABELA 1. NAJWAŻNIEJSZE POZAKOMÓRKOWE ENZYMY BAKTERII Z RODZAJU BACILLUS
GATUNEK ENZYM
Hydrolazy polisacharydów
Alkalofilne szczepy Bacillus sp.
Ä…-amylaza, ²-1,3-glukanaza, liaza pektynowa, pululanaza
Bacillus amyloliquefaciens
Ä…-amylaza, galaktanaza, izoamylaza, mannanaza, ksylanaza
Bacillus brevis celulaza
Bacillus circulans
chitynaza, ²-1,3-glukanaza, liaza pektynowa, ²-1,6-glukanaza, fosfomannanaza
Bacillus cereus
²-amylaza
Bacillus coagulans
Ä…-amylaza, izomeraza glukozowa
Bacillus firmus celulaza, ksylanaza
Bacillus licheniformis
Ä…-amylaza
Bacillus macerans
Ä…-amylaza, glukonotransferaza cyklodekstryn
Bacillus megaterium
²-amylaza, glukonotransferaza cyklodekstryn, dekstranaza
Bacillus polymyxa
²-amylaza, celulaza, ²-1,3-glukanaza, izoamylaza, liaza pektynowa, ksylanaza
Bacillus pumilus liaza pektynowa, celulaza, lichenaza
Bacillus sphaericus liaza pektynowa
Bacillus subtilis
Ä…-amylaza, arabinaza, celulaza, Ä…-glukozydaza, dekstranaza, galaktanaza, , liaza
pektynowa, ksylanaza, ²-1,3-glukanaza
Bacillus stearothermophilus
Ä…-amylaza
Bacillus sp. agaraza, chitosanaza
Hydrolazy peptydowe
Alkalofilne szczepy Bacillus sp. proteinaza serynowa alkalofilna
Bacillus amyloliquefaciens metaloproteinaza, subtilizyna
Bacillus cereus metaloproteinaza
Bacillus licheniformis subtilizyna, aminopeptydaza
Bacillus megaterium metaloproteinaza
Bacillus polymyxa metaloproteinaza
Bacillus pumilus subtilizyna
Bacillus subtilis metaloproteinaza, subtilizyna, esteraza, aminopeptydaza
Bacillus stearothermophilus metaloproteinaza
Bacillus sp. proteinaza halofilna
Penicylazy
Bacillus anthracis
²-laktamaza
Bacillus cereus
²-laktamaza
Bacillus licheniformis
²-laktamaza
Bacillus megaterium
²-laktamaza, acylaza penicylinowa
Bacillus sphaericus acylaza penicylinowa
Bacillus subtilis
²-laktamaza
Nukleazy i fosfatazy
Bacillus amyloliquefaciens alkaliczna fosfataza, deoksyrybonukleotydo-rybonukleaza
Bacillus cereus alkaliczna fosfataza, deoksyrybonukleotydo-rybonukleaza, 5-nukleotydaza
Bacillus megaterium 5-nukleotydaza
Bacillus subtilis alkaliczna fosfataza, deoksyrybonukleotydo-rybonukleaza, 5-nukleotydaza, 3-
nukleotydaza
Enzymy bakteriolityczne
Bacillus licheniformis endo-N-acetyloglukozoaminidaza, amidaza-N-acetylomuramylo-L-alaninowa
Bacillus subtilis endo-N-acetyloglukozoaminidaza, egzo-N-acetyloglukozoaminidaza, endo-N-
acetylomuramidaza, amidaza-N-acetylomuramylo-L-alaninowa
Inne enzymy
Bacillus anthracis fosfolipaza C
Bacillus cereus fosfolipaza C
Bacillus licheniformis lipaza
Bacillus subtilis lipaza
Bacillus thiaminolyticus tiaminaza
Bacillus thuringiensis fosfolipaza C
__________________________________________________________________________________________
KATEDRA TECHNOLOGII FERMENTACJI I MIKROBIOLOGII TECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
4
MIKROBIOLOGIA TECHNICZNA  studia zaoczne Ćwiczenie 3
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
Bakterie Bacillus podzielono na 3 grupy (tab. 2.). Bakterie należące do grup A i B są
tradycyjnie używane w produkcji żywności lub są uważane za nieszkodliwe  produkowane
przez nie enzymy nie wymagajÄ… testowania lub testowane sÄ… jedynie pod kÄ…tem ewentualnej
toksyczności. Należą tu 22 gatunki niepatogenne. Natomiast 26 gatunków, które mogą być
patogenne zalicza się do grupy C, stosowanie wytwarzanych przez nie enzymów w produkcji
żywności wymaga specjalistycznych testów.
TABELA 2. PODZIAA
BAKTERII Z RODZINY BACILLUS
GRUPA GATUNKI
OPIS
Bacillus subtilis (wraz ze szczepami
Wytwarzane enzymy nie wymagajÄ…
A znanymi jako B. mesentericus, B.
testowania
natto, B. amyloliquefaciens)
B. stearothermophilus,
B. licheniformis,
Wytwarzane enzymy testowane sÄ…
B. coagulans,
B pod kÄ…tem ewentualnej
B. Megaterium,
toksyczności
B. circulans,
B. pumilus
Ewentualne stosowanie enzymów B. cereus,
produkowanych przez te gatunki w B. anthracis
C
przetwórstwie żywności wymaga
specjalistycznych testów
Zestaw enzymów wytwarzanych przez bakterie z rodzaju Bacillus jest bardzo szeroki
(tab. 1.) i nie do końca wykorzystany. Enzymy te znajdują zastosowanie w procesach
biotransformacji i biodegradacji. Na skalę przemysłową laseczki Bacillus wykorzystuje się
także do produkcji antybiotyków (bacytracyny, gramicydyny S) i bioinsektycydów (´-
endotoksyn). W inżynierii genetycznej są wykorzystywane są do klonowania genów
przeznaczonych dla innych biorców. Dodatkowym atutem jest dość duża podatność szczepów
bakterii Bacillus na doskonalenie na drodze mutacji i selekcji, powodując coraz większą ich
produktywność.
Enzymy
Enzymy pozakomórkowe, zwane też egzoenzymami, to enzymy wydzielane z
komórek do otaczającego środowiska. Zalicza się tu także niektóre enzymy związane z
błonami komórkowymi, które w odpowiednich warunkach są uwalniane poza komórkę. Z
fizjologicznego punktu widzenia, służą najprawdopodobniej komórce do pozyskiwania
związków odżywczych z otoczenia. Niektóre są wydzielane podczas sporulacji. Większość
enzymów pozakomórkowych ma charakter indukcyjny. To znaczy, że w nieobecności
substratu są produkowane w komórkach w niewielkich ilościach (poziom bazowy). W chwili
pojawienia się substratu w pożywce, ta niewielka ilość enzymu wystarcza by przereagować z
substratem. W wyniku tej reakcji (najczęściej rozkładu) uwalniany jest induktor, który wnika
do komórki i uaktywnia syntezę enzymu na dużą skalę. W momencie wyczerpania substratu,
ilość enzymu wraca do poziomu bazowego.
Obok indukcji, drugim podstawowym mechanizmem regulacji metabolizmu bakterii z
rodzaju Bacillus na poziomie genetycznym, jest represja. Represja kataboliczna polega na
nieustannym hamowaniu biosyntezy enzymów w pożywkach zawierających glukozę lub
inne Å‚atwo przyswajalne z
ródła węgla. Biosynteza proteinaz oraz wielu enzymów
działających na substraty zawierające azot jest silnie hamowana u bakterii Bacillus przez jony
__________________________________________________________________________________________
KATEDRA TECHNOLOGII FERMENTACJI I MIKROBIOLOGII TECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
5
MIKROBIOLOGIA TECHNICZNA  studia zaoczne Ćwiczenie 3
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
amonowe (podobny mechanizm jak represja kataboliczna-glukozowa), a u niektórych
gatunków represyjnie działają mieszaniny aminokwasów.
Technologia produkcji enzymów pozakomórkowych
Technologia produkcji dzieli siÄ™ na 2 etapy: proces biosyntezy enzymu i proces jego
wyodrębniania. Biosyntezę prowadzi się przeważnie w oparciu o wgłębną, okresową hodowlę
bakterii w klasycznych fermentorach w ciekłych pożywkach o ściśle określonym składzie
i przy zastosowaniu specyficznych dla każdego szczepu warunków fizycznych i chemicznych.
Skład pożywki dobiera się indywidualnie dla każdego gatunku, musi uwzględniać
mechanizmy regulacji biosyntezy (represję) oraz być ekonomiczny.
Substancje wchodzące w skład pożywki:
z
ródło węgla  mogą to być mono-, di- i polisacharydy, czasami stosuje się także
glicerol, alkohole czy kwasy organiczne. Często wykorzystuje się surowce odpadowe
(melasę buraczaną lub trzcinową), ziarna zbóż, hydrolizaty skrobi ziemniaczanej,
mÄ…kÄ™ kukurydzianÄ…,
z
ródło azotu  zwykle stosuje się substancje organiczne, będące jednocześnie z
ródłem
azotu, węgla, witamin i mikroelementów (serwatka, odpady sojowe, otręby zbożowe,
mąka, ekstrakty lub wyciągi z kukurydzy, soi, jęczmienia, czasami kiełki słodowe,
mączkę rybną). Szeroko stosowane są pożywki z białkami, aminokwasami lub
peptydami, kazeinÄ… lub peptonem,
zwiÄ…zki czynne  np. witaminy, zasady purynowe i pirymidynowe, ich z
ródłem są
drożdże lub ich ekstrakt,
mikroelementy  jak jony manganu, żelaza, cynku czy potasu wprowadzane są zwykle
w wystarczającej ilości z innymi składnikami pożywki.
Warunki hodowli:
pH 6,5-7,5, dla szczepów alkalofilnych 8,0-11,0, przy czym pH optymalne do
produkcji egzoenzymów nie zawsze pokrywa się z optimum dla wzrostu,
temperatura  w zakresie 28-40ºC, i jak wyżej temperatura optymalna dla produkcji
enzymu nie zawsze pokrywa się z optymalną dla wzrostu, np. B. mesentericus rośnie
najlepiej w 42ºC, a maksymalna synteza subtilizyny wystÄ™puje w 28ºC,
odpowiednie napowietrzenie  dobierane indywidualnie, zwykle w granicach 0,7-1,0
objętości powietrza na objętość podłoża na 1 minutę, często zmienne w zależności od
fazy rozwoju.
Po zakończeniu hodowli wydzielony enzym wyodrębnia się z pożywki metodą wirowania lub
filtracji. Filtrat podlega następnie oczyszczaniu (w zależności od przeznaczenia z różną
dokładnością) i ewentualnemu jałowieniu.
Bioinsektycydy
BiaÅ‚ka ´-endotoksyn otrzymywane z hodowli różnych szczepów bakterii Bacillus
thuringiensis stały się alternatywą dla stosowania chemicznych środków owadobójczych
stosowanych w rolnictwie i leśnictwie. Toksyny te są produkowane w czasie sporulacji
i odkładane w komórkach poza przetrwalnikiem. Charakteryzują się wysoką aktywnością,
ukierunkowaną specyficznością w stosunku do poszczególnych rzędów, rodzin, rodzajów, a
nawet gatunków owadów i nieszkodliwością dla innych organizmów.
__________________________________________________________________________________________
KATEDRA TECHNOLOGII FERMENTACJI I MIKROBIOLOGII TECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
6
MIKROBIOLOGIA TECHNICZNA  studia zaoczne Ćwiczenie 3
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
Ze względu na specyficzność dzieli się je na 4 klasy: od CryI do CryIV, a te dalej na
podklasy i odmiany. Poszczególne szczepy Bacillus thuringiensis produkujÄ… ´-endotoksyny
aktywne w stosunku do wybranej grupy owadów.
W obecnej chwili trwają badania nad zwiększeniem trwałości i wyeliminowaniem z
dotychczasowych preparatów wtórnych metabolitów (np. ²-egzotoksyn, hemolizyn), które
mogą być toksyczne dla innych organizmów.
Antybiotyki
W oparciu o hodowlę wgłębną bakterii z rodzaju Bacillus produkuje się obecnie kilka
antybiotyków o budowie oligopeptydowej: gramicydynę S, tyrocydynę A, B i C (B. brevis),
bacytracyna (B. subtilis). Poszczególne szczepy Bacillus subtilis produkują ponad 65
antybiotyków o budowie polipeptydowej. Bacillus polymyxa wytwarza polimyksyny.
Wszystkie te antybiotyki działają na bakterie gramujemne. Gramdodatnie i grzyby,
najczęściej poprzez blokadę syntezy ściany komórkowej, zakłócanie funkcji błon
komórkowych, rzadziej przez zakłócanie replikacji, transkrypcji czy translacji.
Wyjątkowy wśród bakterii z rodzaju Bacillus jest B. circulans, który wytwarza
antybiotyk aminoglukozydowy  butyrozynÄ™. Na drodze biotransformacji uzyskuje siÄ™ z
niej jeden z najefektywniejszych antybiotyków  amikacynę.
Biotransformacja
Biotransformacja to jedno-, rzadziej dwuetapowe, chemiczne przekształcenie
egzogennych związków w strukturalnie im podobne, dokonywane przez żywą komórkę.
Produkty końcowe często nie mają znaczenia dla komórki, a niekiedy są wręcz toksyczne.
Biotransformacja nie jest celem działania komórki, zachodzi niejako  na boku . Biotechnolog
wykorzystuje naturalny aparat enzymatyczny komórki, podsuwa jej pewne związki i czeka aż
zostaną one przekształcone zgodnie z jego przewidywaniami. Proces ten jest niezależny od
funkcji życiowych komórki.
Bakterie z rodzaju Bacillus znalazły zastosowanie w wielu procesach biotransformacji:
" hydroliza estrów  esterazy produkowane przez Bacillus wykazują się wysoką
specyficznością, w tym także stereospecyficznością, i regioselektywnością, co zostało
wykorzystane przy rozdziale enancjomerów
- hydroliza octanu II-rzędowego, wydajność enancjomeru R ~94%
- rozdział mieszaniny podstawionych enancjomerów ą-arylo- i ą-aryloksypochodnych
kwasu propionowego, sÄ… to m.in. znane leki przeciwzapalne (Naproxem), przy czym
aktywność farmaceutyczną wykazuje tylko enancjomer S
- hydroliza racemicznych estrów kwasów i alkoholi z kilkoma chiralnymi atomami
węgla
- regioselektywna hydroliza estrów karboksylowych katalizowana przez subtilizynę
- hydroliza estrów L-aminokwasów (bez hydrolizy estrów D-aminokwasów) przez
subtilizynÄ™
" produkcja aminokwasów
- szczególnie duże znaczenie odgrywają bakterie z rodzaju Bacillus w otrzymywaniu
czystych L- lub czystych D-aminokwasów
- niektóre gatunki mogą w odpowiednich warunkach produkować aminokwasy: B.
subtilis  L-izoleucynÄ™ lub L-treoninÄ™
__________________________________________________________________________________________
KATEDRA TECHNOLOGII FERMENTACJI I MIKROBIOLOGII TECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
7
MIKROBIOLOGIA TECHNICZNA  studia zaoczne Ćwiczenie 3
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
" antybiotyki
- wykorzystanie acylazy penicylinowej z bakterii E. Coli, B. sphaericus, B.
meganterium do transformacji penicyliny G i penicylinÄ™ V w kwas 6-
aminopeicylanowy, główny półprodukt półsyntetycznych penicylin
" steroidy
- bakterie z gatunku Bacillus meganterium jako jedne z nielicznych hydroksylujÄ…
progesteron w pozycji a i b przy węglu 15-tym
- B. lentus i B. sphaericus mogą przeprowadzać reakcję odwodorowania przekształcając
kortyzon w prednizon.
Biodegradacja
Biodegradacja to chemiczny rozkład związków organicznych na prostsze
składniki chemiczne zachodzący przy udziale żywych organizmów. W odróżnieniu od
mineralizacji, termin ten używa się w odniesieniu do substancji obcych i szkodliwych dla
środowiska naturalnego, syntetyzowanych sztucznie przez człowieka i nie występujących
naturalnie przyrodzie (ksenobiotyków).
Biodegradacja n-alkanów o długości łańcucha C9-C44
Znane sÄ… 3 drogi:
mono- lub diterminalna oksydacja
subterminalna oksydacja
poprzez alkeny
Bakterie z rodzaju Bacillus uczestniczą w pierwszej z nich, w szczególności
odgrywają znaczącą rolę przy biodegradacji n-alkanów o łańcuchu powyżej C16 (parafiny),
które są ciałami stałymi, a wykorzystywane były do produkcji kremów, kosmetyków,
smarów, świec, pokrywania papieru itp. Problem z ich degradacją polega na tym, że są one
katabolizowane wewnątrzkomórkowo, a więc ich rozkład jest uzależniony od dostępu do
komórki mikroorganizmu. B. subtilis pokonuje ten problem wydzielając do otoczenia
bioemulsator ułatwiający wnikanie cząstek n-alkanu do komórek własnych i innych
mikroorganizmów.
Oksydacja polega na wprowadzeniu grupy OH do łańcucha przy węglu 1. (terminalna), 2,3
lub 4 (subterminalna). Bacillus macerans może hydroksylować 4, 5 i 6. atom węgla. Mieszane
kultury Bacillus i Streptomyces hydroksylują długie n-alkany w dowolnym miejscu.
Wprowadzona grupa OH pod wpływem dehydrogenaz i esteraz ulega dalszemu utlenieniu, a
łańcuch alkanu skróceniu.
Biodegradacja związków amidowych
Pochodne aromatycznych amidów (anilidów) i fenylokarbamidów (fenylomocznika)
sÄ… powszechnie stosowanymi pestycydami. Ich biodegradacjÄ™ prowadzÄ… B. firmus i B.
sphaericus, wytwarzające enzym: arylo-acyloamidazę rozkładający anilidy do kwasu
karboksylowego i aniliny.
Biodegradacja innych związków
Bacillus cereus jest zdolny do biodegradacji wielu barwników azowych.
Bacillus pumilus wytwarza dihydratazę cyjanidową i degraduje cyjanowodór.
Bacillus subtilis mogą eliminować grupę nitrową z pochodnych fenoli, w
szczególności 2- i 4-nitrofenole, częstych substancji zanieczyszczających środowisko
(ścieki przemysłowe, gleba zanieczyszczona insektycydami)
__________________________________________________________________________________________
KATEDRA TECHNOLOGII FERMENTACJI I MIKROBIOLOGII TECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
8
MIKROBIOLOGIA TECHNICZNA  studia zaoczne Ćwiczenie 3
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
Biodegradacja związków aromatycznych np. pochodnych toluenu, protokatecholu,
pirydyny, kwasu nikotynowego.
Taksonomia
Grupa tlenowców jest stosunkowo mało opracowana. Dopiero w ostatnich dekadach, głównie
dzięki pracom Smitha i wsp. wprowadzono pewien ład w systematykę tej grupy, znacznie
uszczuplając jej zasoby. Okazało się bowiem, że wielokrotnie naukowcy opisywali ten sam
mikroorganizm pod różnymi nazwami. Trudności z podziałem taksonomicznym są
spowodowane wysoką niestałością cech morfologicznych i biochemicznych tej grupy
bakterii. Obecnie przyjęty podział przedstawia tabela 3. Uważa się, że cechą odróżniającą
Bacillus od Clostridium jest zdolność wytwarzania katalazy. Jeśli chodzi o wymagania
tlenowe, to wśród Bacillus znajdują się zarówno tlenowce jak i względne beztlenowce.
TABELA 3. PODZIAA
RODZAJU BACILLUS
I Przetrwalniki owalne lub cylindryczne, Bac. megaterium
1. Laseczki szer.> 0,9 µm,
nie deformujące laseczki ułożone Bac. cereus
w młodych hodowlach barwią
pośrodku lub bliżej jednego z końców, Bac. cereus var. mycoides
się nierównomiernie
o cienkich ścianach, Bac. anthracis
laseczki Gram-dodatnie Bac. thuringiensis
Bac. licheniformis
2. Laseczki szer. < 0,9 µm,
Bac. subtilis
w młodych hodowlach barwią
Bac. pumilis
się równomiernie
Bac. coagulans
Bac. badius
Bac. firmus
Bac. lentus
II Przetrwalniki owalne, 1. Wytwarzają gaz na podłożu z Bac. polymyxa
wyraz
nie zniekształcające laseczkę, węglowodanami Bac. macerans
ułożone pośrodku lub na końcu,
2. Nie wytwarzajÄ… gazu na Bac. alvei
o grubych ściankach, łatwo barwiące podłożach z węglowodanami Bac. stearothermophilus
siÄ™, Bac. circulans
laseczki barwiÄ… siÄ™ metodÄ… Grama
Bac. laterosporus
zmiennie Bac. pulvifaciens
Bac. brevis
Bac. larvae
Bac. papillae
Bac. lentomorbus
III Przetrwalniki okrągłe, 1. Rosną przy pH 6,0, Bac. panthothenicus
zniekształcające laseczkę, do wzrostu nie wymagają Bac. sphaericus
ułożone końcowo obecności mocznika
2. Do wzrostu wymagajÄ… Bac. pasteuri
obecności mocznika i reakcji
alkalicznej
Identyfikacja szczepów nie może być oparta jedynie na samym wyglądzie kolonii, gdyż
drobnoustroje te wykazują dużą zmienność. Ważną cechą diagnostyczną jest wygląd komórek
przetrwalnikujących i samych endospor. Przetrwalniki łatwo można oglądać w preparatach
barwionych rozcieńczoną fuksyną, ale opracowano metody ich barwienia znacznie bardziej
przydatne w badaniach diagnostycznych. Ocenia się wygląd sporangiów, kształt i ułożenie
przetrwalników. W młodych (24-godzinnych) hodowlach zabarwionych fuksyną ocenia się
równomierność zabarwienia (nierównomierne, budowa ziarnista, piankowata  obecność
wodniczek).
W celu dalszej identyfikacji, zgodnie z metodyką stosowaną Międzynarodowym Ośrodku
Mikrobiologii Żywności w Lille, stosuje się posiewy na rząd biochemiczny (tab. 4):
__________________________________________________________________________________________
KATEDRA TECHNOLOGII FERMENTACJI I MIKROBIOLOGII TECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
9
MIKROBIOLOGIA TECHNICZNA  studia zaoczne Ćwiczenie 3
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
TABELA 4. RÓŻNICOWANIE TLENOWCÓW PRZETRWALNIKUJ
CYCH
Żelatyna
Grupa Nazwa gatunku
I grupa Bacillus subtilis Jednolite + - + + + + + +s + - - + - -
przetrwalniki nie Bac. licheniformis  + + + + + + + +p + - - + - -
zniekształcające Bac. pumilus  + - + + + - + +s + - - - - ą
Bac. cereus Niejednolite + + + - - + + +s + ++ +++ Ä… - -
Bac. anthracis  + + + - - + + +p + + zmienne Ä… - +?
Bac. megaterium  - - + Ä… Ä… + + Ä…s + -  - - +
Bac. coagulans  + + + Ä… Ä… + - - -  - - -
Bac. firmus  - - - - - + + + -  + - -
Bac. lentus  - - - - - + - - -  - + -
Bac. polymyxa Jednolite + + + + + + + + -  + - -
II grupa Bac. macerans  - + + + + + - + -  Ä… - -
przetrwalniki Bac. circulans  - + + + + + Ä… Ä… -  Ä… - -
zniekształcające Bac. brevis  - - + - - - + + -  ą - -
III grupa przetrwalniki Bac. alvei Jednolite + + + - - + + + -  - - -
zniekształcające Bac. sphaericus  - ą - - - - - ą -  - - -
okrągłe Bac. pasteuri  - - - - - - - - -  + + -
s  szybko, p  powoli, + wynik dodatni,  wynik ujemny, Ä… odczyn dodatni lub ujemny
__________________________________________________________________________________________
KATEDRA TECHNOLOGII FERMENTACJI I MIKROBIOLOGII TECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
10
VP
Skrobia
sodowy
fuksyn
Ä…
Ksyloza
Kazeina
Glukoza
Azotany
Mocznik
Wzrost w
Cytrynian
Arabinoza
warunkach
Lecytynaza
Hemolizyna
Barwi
Ä…
ce si
Ä™
beztlenowyvh
k
Å‚
uta
bulion
MIKROBIOLOGIA TECHNICZNA  studia zaoczne Ćwiczenie 3
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
Ocenia siÄ™:
wytwarzanie acetylometylokarbinolu oceniane na podłożu Smitha (reakcja Voges-
Proskauera, VP+)
fermentację węglowodanów na podłożach syntetycznych bez peptonu
zdolność wzrostu w warunkach beztlenowych (posiew na agar w wysokim słupku)
rozkład skrobi
rozkład kazeiny
rozkład żelatyny
wytwarzanie lecytynazy
wytwarzanie hemolizyny
ruchliwość
Lemille i wsp. na podstawie szczegółowych badań zaproponowali zmodyfikowany klucz
do oznaczania laseczek rodzaju Bacillus, należących do I grupy (tab. 5.).
TABELA 5. KLUCZ DO OZNACZANIA GATUNKÓW BACILLUS I GRUPY
(wg Lemille F., de Barjac H., Bonnefoi A.)
MR +
Bac. cereus
VP+
Ureaza -
Wzrost w Mannitol -
Rafinoza -
warunkach
Ksyloza -
beztlenowych
Inulina -
MR -
Bac. megaterium
VP-
Ureaza +
Brak wzrostu w Mannitol +
Rafinoza +
warunkach
Ksyloza +
beztlenowych
Inulina +
Kazeina -
Bac. coagulans
Żelatyna -
Azotany -
VP+
Gaz na bulionie z azotanami -
Wzrost w Mannitol -
Kazeina +
warunkach
Bac. licheniformis
Żelatyna +
beztlenowych
Azotany +
Gaz na bulionie z azotanami +
Mannitol +
Ureaza -
Bac. pumilis
VP+
Skrobia -
Brak wzrostu w Azotany -
Ureaza +
warunkach
Bac. substilis
Skrobia +
beztlenowych
Azotany +
Ureaza -
Bac. badium
VP-
Azotany -
Kazeina -
Brak wzrostu w
Glukoza -
warunkach
beztlenowych
Ureaza +
Bac. lentus
Azotany -
Brak wzrostu na agarze
Kazeina -
o pH 6,
Żelatyna -
VP 
Ureaza -
Bac. firmus
brak wzrostu w warunkach
Azotany +
beztlenowych Kazeina +
Żelatyna +
W tabeli pominięto B. anthracis i B. thuringiensis.
+ wynik dodatni
 wynik ujemny
__________________________________________________________________________________________
KATEDRA TECHNOLOGII FERMENTACJI I MIKROBIOLOGII TECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
11
6+
µ
m. Wodniczki s
Ä…
szeroko
Å›
ci ponad 0,9
Wzrost na agarze o pH
Komórki wegetatywne o
Wzrost na agarze o pH 6+
Brak wodniczek, wymiary: 0,6-0,9 x 1,2-5
µ
m.
Komórki wegetatywne o szeroko
Å›
ci poni
ż
ej 0,9
µ
m.