Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
UNIWERSYTET MARII CURIE-SKA
ODOWSKIEJ
WYDZIAA
BIOLOGII I BIOTECHNOLOGII
ZAKA
AD BIOLOGII MOLEKULARNEJ
ĆWICZENIA Z BIOLOGII MOLEKULARNEJ
dla studentów II roku biologii oraz
III roku mikrobiologii i biotechnologii
LUBLIN 2013
Wersja 1.1
1
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
Spis treści:
1. Charakterystyka chemiczna kwasów nukleinowych & & & & & & & & & & & & & & 3
2. Izolacja genomowego DNA z drożdży Saccharomyces cerevisiae & & & & & & & & .6
3. Amplifikacja genów kodujących rybosomowe białka P1A i P1B
drożdży Saccharomyces cerevisiae& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & .10
4. Izolacja jąder komórkowych i histonów& & & & & & & & & & & & & & & & & & ..13
5. Analiza składu białkowego chromatyny& & & & & & & & & & & & & & & & & & ..16
6. Trawienie DNA chromatyny nukleazÄ… ze Staphylococcus aureus& & & & & & & & & ..17
7. Elektroforetyczna analiza DNA po trawieniu nukleazÄ…
ze Staphylococcus aureus& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & 20
8. Transkrypcja w warunkach in vivo w komórkach bakteryjnych
i drożdżowych& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & ...21
9. Izolacja i elektroforetyczna analiza RNA z komórek drożdży& & & & & & & & & ....23
10. Translacja w warunkach in vivo w komórkach bakteryjnych i drożdżowych& & & & .26
11. Badanie wpływu inhibitorów translacji na wzrost komórek drożdżowych& & & & & ..28
12. Otrzymywanie rybosomów i frakcji cytoplazmatycznej
drożdży Saccharomyces cerevisiae& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & ..30
13. Izolacja kwaśnych białek rybosomowych z drożdży& & & & & & & & & & & & & ..33
14. Analiza elektroforetyczna białek rybosomowych& & & & & & & & & & & & & & & 35
15. Izolacja kinaz białkowych z drożdży Saccharomyces cerevisiae& & & & & & & & & 36
16. Lokalizacja i regulacja aktywności kinazy białkowej CK2 & & & & & & & & & & & 38
17. Aktywacja i specyficzność substratowa kinazy zależnej od cAMP& & & & & & & & .42
18. Wykrywanie inhibitorów proteaz serynowych & & & & & & & & & & & & & & & ...46
19. Identyfikacja inhibitora trypsyny metodÄ… elektroforezy w warunkach
niedenaturujÄ…cych& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & 49
20. Badanie aktywności enzymatycznej w żelu poliakrylamidowym
na przykładzie inwertazy & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & 51
21. Cykl życiowy drożdży Saccharomyces cerevisiae & & & & & & & & & & & & & & .54
22. Transfer genów do komórek ssaczych  transfekcja& & & & & & & & & & & & & & 60
23. Wykorzystanie metod immunocytochemicznych w diagnostyce nowotworów & & & 68
2
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
Charakterystyka chemiczna kwasów nukleinowych
Analiza składu chemicznego RNA lub DNA jest poprzedzona ich hydrolizą.
W przypadku RNA, można stosować zarówno hydrolizę zasadową, jak i kwaśną. DNA zaś
jest odporny na działanie zasad. Decyduje o tym brak grupy -OH przy węglu 2 -
deoksyrybozy. Z tego względu, analizę chemiczną DNA przeprowadza się po hydrolizie
kwasami.
Przed przystąpieniem do wykonania ćwiczenia przygotować wrzącą łaz
niÄ™ wodnÄ….
Hydroliza kwaśna RNA i DNA
W celu całkowitej hydrolizy RNA lub DNA i uzyskania wolnych zasad purynowych
i pirymidynowych, stosuje się wysokie stężenia kwasu solnego, nadchlorowego lub
siarkowego.
Odczynniki
1% wodne roztwory DNA i RNA (preparaty handlowe)
1M roztwór H2SO4
Wykonanie ćwiczenia
Do jednej zlewki odmierzyć 10 ml 1% roztworu RNA, a do drugiej 10 ml 1% roztworu DNA.
Następnie, do obu zlewek odmierzyć po 10 ml 1M H2SO4. Zlewki zatkać gumowym korkiem
z umieszczoną w nim rurką szklaną i ogrzewać na wrzącej łaz
ni wodnej przez 60 min. Po tym
czasie zlewki wyjąć z łaz
ni, oziębić i zachować do dalszych doświadczeń.
Wykrywanie pentoz (reakcja Biala)
Pentozy (wolne oraz związane w nukleozydach) ogrzewane ze stężonym HCl ulegają
cyklizacji do furfuralu, który w obecności jonów Fe3+ kondensuje z orcyną, tworząc związek
barwy zielonej.
Odczynniki
0,5% roztwory RNA i DNA po hydrolizie
3
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
Odczynnik orcynolowy; nietrwały-przygotować bezpośrednio przed użyciem (0,3 g orcyny
rozpuścić w 100 ml stężonego HCl i dodać 5 kropli 10% roztworu FeCl3)
Wykonanie ćwiczenia
Do jednej probówki odmierzyć 0,5 ml hydrolizatu RNA, a do drugiej 0,5 ml hydrolizatu
DNA. Do każdej z probówek dodać po 1 ml odczynnika orcynolowego i ogrzewać
ok. 5-10 min. we wrzÄ…cej Å‚az
ni wodnej. W probówce zawierającej pentozę pojawia się zielone
zabarwienie.
Wykrywanie deoksyrybozy (reakcja Dischego)
Odczynniki
Odczynnik difenyloaminowy (1g difenyloaminy rozpuścić w 100 ml lodowatego CH3COOH
z dodatkiem 2,75 ml stężonego H2SO4 cz.d.a.)
0,5% roztwory RNA i DNA (przed lub po hydrolizie)
Wykonanie ćwiczenia
Do jednej probówki odmierzyć 0,5 ml roztworu RNA, a do drugiej 0,5 ml roztworu DNA. Do
każdej z probówek dodać po 1 ml odczynnika difenyloaminowego. Probówki umieścić
we wrzÄ…cej Å‚az
ni wodnej na 5-10 min. Pojawienie siÄ™ niebieskiego zabarwienia w badanej
próbie świadczy o obecności deoksyrybozy.
Wykrywanie kwasu ortofosforowego
Wykrywanie ortofosforanów w hydrolizatach kwasów nukleinowych polega na reakcji
z molibdenianem amonu. Jon ortofosforowy tworzy kompleks soli amonowej
heteropolikwasu tetratrimolibdeniano-fosforowego o barwie żółtej.
Odczynniki
Roztwór molibdenianu amonowego: 10g kwasu molibdenowego rozpuścić w mieszaninie:
14,4 ml 25% roztworu amoniaku i 27,1 ml wody. Następnie, całość wlać powoli, ciągle
mieszając, do roztworu kwasu azotowego (48,9 ml stężonego kwasu azotowego plus 114,8 ml
wody)
0,5% roztwory RNA i DNA po hydrolizie
4
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
0,5% roztwór NaH2PO4 ( roztwór wzorcowy)
Wykonanie ćwiczenia
Do jednej probówki odmierzyć 0,5 ml hydrolizatu RNA, do drugiej 0,5 ml hydrolizatu DNA,
a do trzeciej 0,5 ml wzorcowego roztworu ortofosforanu (kontrola). Do każdej z probówek
dodać po 1 ml roztworu molibdenianu amonowego. Zawartość probówek ogrzać na łaz
ni
wodnej do wrzenia. W obecności ortofosforanów wytrąca się żółty osad fosfo-molibdenianu
amonowego.
Wykrywanie zasad purynowych
Odczynniki
1M roztwór NaOH
1% roztwór CuSO4
0,5% roztwor RNA po hydrolizie
Nasycony roztwór Na2S2O5 (10 ml)
Wykonanie ćwiczenia
Do 0,5 ml hydrolizatu RNA dodawać kroplami 1M NaOH, by uzyskać pH roztworu około 6,0
(odczyn sprawdzać papierkiem wskaz
nikowym). Następnie, roztwór ogrzewać przez 3 min.
we wrzÄ…cej Å‚az
ni wodnej, po czym wprowadzić 6 kropli 1% CuSO4, a potem ostrożnie
kroplami nasycony roztwór Na2S2O5. Pirosiarczyn sodu redukuje jony Cu2+ do Cu+, które z
purynami tworzÄ… nierozpuszczalne sole miedziawe.
Rozpuszczalność kwasów nukleinowych w kwasach, zasadach i alkoholu
Odczynniki
1 % wodne roztwory RNA i DNA
2M roztwór HCl
2M roztwór NaOH
Alkohol izopropylowy (oziębiony)
Wykonanie ćwiczenia
1. Do dwóch probówek zawierających oddzielnie po 0,5 ml roztworów RNA i DNA,
dodawać kroplami 2M HCl, aż nastąpi wytrącenie się kwasów nukleinowych.
Następnie dodawać kroplami 2M NaOH. Zanotować wynik.
5
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
2. Do jednej probówki odmierzyć 0,5 ml roztworu RNA, a do drugiej 0,5 ml roztworu
DNA. Do każdej z nich dodać po 1,5 ml oziębionego izopropanolu. Zanotować wynik.
Izolacja genomowego DNA z drożdży Saccharomyces cerevisiae
Izolacja kwasów nukleinowych jest pierwszym etapem wielu procedur stosowanych
w inżynierii genetycznej oraz diagnostyce molekularnej. Celem metody jest uzyskanie
materiału o wysokiej czystości, czyli wolnego od białek i polisacharydów, mogących
negatywnie wpływać na dalsze analizy. Istotne jest także, aby izolowany kwas nukleinowy
nie uległ zbytniej fragmentacji czy enzymatycznej degradacji w czasie stosowanych procedur.
Aktualnie dysponujemy bardzo zróżnicowanymi metodami otrzymywania kwasów
nukleinowych, od złożonych, wieloetapowych procedur wykorzystujących rozpuszczalniki
organiczne do metod szybszych, prostszych i bezpieczniejszych, których wybór zależy od:
rodzaju otrzymywanego kwasu nukleinowego (DNA genomowe, mitochondrialne,
plazmidowe, RNA itd.),
z
ródła pochodzenia (roślinne, zwierzęce, bakteryjne, wirusowe itd.) i rodzaju
materiału
z którego przeprowadzamy izolację (np. z tkanek, organu, hodowli komórkowej
itd.),
docelowego przeznaczenia kwasu nukleinowego (np. PCR, klonowanie, synteza
cDNA, itd.), co nakłada konkretne wymagania względem jego czystości
i jakości.
Każda izolacja drożdżowego DNA wymaga rozbicia ściany komórkowej. W
przypadku drożdży stosowane są metody mechaniczne lub łagodniejsze obejmujące
enzymatyczną degradację ściany komórkowej i lizę otrzymanych sferoplastów przy
udziale detergentów. Enzymy wykorzystywane do otrzymania sferoplastów drożdżowych
to najczęściej: litykaza (z Arthrobacter luteus) lub glukulaza (ze ślimaka), hydrolizujące
wiązanie -1,3 glikozydowe występujące w glukanie ściany komórkowej.
Zastosowana w niniejszym ćwiczeniu metoda izolacji DNA umożliwia otrzymanie
kilkunastu mikrogramów preparatu, który jest gotowy do cięcia enzymami restrykcyjnymi
i może służyć jako matryca w rekcji PCR.
6
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
Materiały i odczynniki
1. 12- godzinna hodowla drożdży S. cerevisiae w pożywce YPD (50 ml)
2. Bufor do sferoplastyzacji:
1 M sorbitol,
50 mM Tris-HCl, pH 7,5
20 mM EDTA,
20 mM ²-MET (dodać bezpoÅ›rednio przed użyciem)
3. Zymoliaza 100T (handlowy preparat zawierajÄ…cy litykazÄ™) - 2,5 mg/ml w buforze
do sferoplastyzacji
4. 10 % w/v SDS
5. Bufor do lizy (50 mM Tris pH 7.5; 20 mM EDTA)
6. 5 M octan potasu
7. 96% i 70% etanol (oziębiony)
8. Bufor TE (10 mM Tris  HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA)
9. Termoblok lub Å‚az
nia wodna
10. Jałowe probówki Eppendorfa o poj. 2 ml i końcówki do pipet
11. Mikroskop świetlny oraz szkiełka podstawowe i nakrywkowe
12. Odczynniki i zestaw do elektroforezy kwasów nukleinowych (patrz załącznik do
ćwiczeń)
Przed przystąpieniem do wykonania ćwiczenia przygotować łaz
niÄ™ wodnÄ… o temp. 370C oraz
blok grzejny o temp. 650C oraz schłodzić wirówkę do temp. 40C
Wykonanie ćwiczenia
1. Przenieść 4 ml zawiesiny komórek do dwóch probówek Eppendorfa o poj. 2 ml.
Osadzić komórki przez wirowanie przy prędkości 5000 rpm przez 3 min.
w temp. 40C.
2. Uzyskane osady komórek zawiesić łącznie w 0,5 ml buforu do sferoplastyzacji
w jednej probówce Eppendorfa (dodać ²-MET do koÅ„cowego stężenia 20 mM!).
7
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
3. Dodać 20 źl roztworu zymoliazy 100T, dobrze wymieszać i inkubować przez 20 min
w temp. 370C (sferoplastyzacja trwa od 20 do 120 min, zależnie od szczepu, rodzaju
podłoża czy fazy wzrostu komórek).
Uwaga! Formowanie się sferoplastów można monitorować w dwojaki sposób:
a) pod mikroskopem świetlnym - na jedno szkiełko podstawowe nanieść 4 źl
zawiesiny komórek oraz 4 źl 0,1% SDS, a na drugie 4 źl zawiesiny komórek oraz
4 źl buforu do sferoplastyzacji; formowanie sferoplastów uznaje się za
zakończone, gdy 80-90 % komórek występuje jako tzw. komórki-duchy (z ang.
ghost cells);
b) do dwóch szklanych probówek dodać po 0,5 ml buforu do sferoplastyzacji,
następnie do pierwszej z nich dodać 50 źl 10 % roztworu SDS, po czym do obu
probówek dodać po 5 źl zawiesiny komórek i energicznie zamieszać; stopień
strawienia ściany komórkowej można uznać za zadowalający, jeśli zawiesina w
probówce z SDS stanie się klarowna.
4. Uzyskane sferoplasty osadzić przez wirowanie przy prędkości 3000 rpm przez 5 min.
w temp. 40C. Supernatant delikatnie usunąć za pomocą pipety, a do osadu
sferoplastów dodać 0,5 ml buforu do lizy i kilkukrotnie przepipetować w celu
wymieszania zawartości probówki.
5. Dodać 25 źl 10% SDS (końcowe stężenie 0,5 % SDS). Zawartość dokładnie
wymieszać przez kilkakrotne odwracanie probówki. Uważać aby zawartość
probówki nie uległa spienieniu! Całość inkubować 20 min. w temp. 650C.
6. Po inkubacji schłodzić probówkę w lodzie po czym dodać 0,2 ml 5M octanu potasu,
Zawartość dokładnie wymieszać przez kilkakrotne odwracanie probówki, a następnie
inkubować w lodzie przez 20 min. Widoczny po dodaniu octanu potasu biały
precypitat tworzą kompleksy SDS ze zdenaturowanymi białkami.
7. Próbkę odwirować przy prędkości 10000 rpm przez 10 min. w temp. 40C.
8. Przenieść 500 źl supernatantu do nowej probówki Eppendorfa o poj. 2 ml (temp.
pokojowa) i dodać do niego trzy objętości oziębionego 96% etanolu (precypitacja
kwasów nukleinowych). Próbkę pozostawić w temp.  200C do kolejnych ćwiczeń.
8
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
9. Osadzić wytrącony kwas nukleinowy przez wirowanie przy prędkości 10000 rpm
przez 15 min. w temp. 40C, po czym delikatnie usunąć supernatant.
10. Uzyskany osad DNA przemyć 1 ml oziębionego 70% etanolu, a następnie odwirować
przez 5 min. przy prędkości 10000 rpm w temp. 40C. Supernatant odrzucić, a osad
wysuszyć w eksykatorze przez ok. 20 min. (aż do całkowitego zaniku zapachu
etanolu).
11. Otrzymany osad rozpuścić w 50-100 źl buforu TE (pH 8.0); jeśli pojawią się
problemy z rozpuszczalnością DNA - inkubować ok. 10 min w temp. 620C lub
pozostawić w lodówce na okres około 12 godzin.
12. Sprawdzić jakość wyizolowanego DNA metodą elektroforezy w 0.7 % żelu
agarozowym (przygotowanie żelu i przeprowadzenie elektroforezy DNA  patrz
załącznik do ćwiczeń). W tym celu przygotować próbki do elektroforezy zawierające
15 źl otrzymanego roztworu genomowego DNA i 5 źl buforu próbkowego do DNA.
Preparat otrzymanego DNA przechowywać w temp.  700C. Należy unikać
wielokrotnego zamrażania i odmrażania próbek DNA.
9
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
Amplifikacja genów kodujących rybosomowe białka P1A i P1B
drożdży Saccharomyces cerevisiae
Oczyszczone genomowe DNA może służyć jako matryca do amplifikacji genów
z wykorzystaniem metody PCR (z ang. Polymerase Chain Reaction). Amplifikacja sekwencji
DNA odbywa się z użyciem pary oligonukleotydowych starterów, z których każdy jest
komplementarny do jednego końca docelowej sekwencji DNA. Startery te są wydłużane
w kierunku do siebie przy udziale termostabilnej polimerazy DNA w cyklu kilkunastu
(kilkudziesięciu) reakcji, na które składają się: denaturacja, przyłączanie starterów oraz
polimeryzacja. Poszczególne etapy cyklu reakcji PCR zachodzą w różnych temperaturach:
zaczynajÄ…ca caÅ‚y cykl reakcja denaturacji odbywa siÄ™ w temperaturze 93-96°C, czego
wynikiem jest rozplecenie podwójnych nici DNA,
następnie odbywa się ochłodzenie mieszaniny reakcyjnej do doświadczalnie dobranej
temperatury (42-680C), w której dochodzi do przyłączania się starterów do matrycy
(ang. annealing). Na tym etapie można kontrolować specyficzność łączenia się
starterów do DNA),
w kolejnym etapie, polimeryzacji, temperatura wzrasta do 720C (optymalna temp.
działania polimerazy) i następuje wydłużanie nici - począwszy od końca 3' startera
enzym dokłada kolejne, komplementarne w stosunku do matrycy nukleotydy w tempie
około 1000 nukleotydów na minutę dla najczęściej wykorzystywanej polimerazy Taq
(z Thermus aquaticus).
Ze względu na jednoczesne kopiowanie dwóch komplementarnych nici matrycy, po
każdym cyklu następuje podwojenie liczby amplifikowanych cząsteczek DNA. Liczba kopii
DNA po zakończeniu około 30 cykli przekracza kilka milionów. Jakość uzyskanego,
metodą reakcji PCR, DNA można analizować za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym,
wybarwiajÄ…c DNA bromkiem etydyny.
Interpretując wyniki uzyskane metodą PCR, należy pamiętać, że najczęstszą
przyczyną braku amplifikacji jest hamujący wpływ zanieczyszczeń obecnych w matrycowym
DNA. Innym często występującym problemem jest obecność niespecyficznych produktów
10
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
amplifikacji, która najczęściej wynika z niewłaściwego doboru temperatury przyłączania się
starterów czy nieodpowiedniego stężenia jonów Mg2+, koniecznych do prawidłowego
Å‚Ä…czenia siÄ™ DNA ze starterami.
Celem ćwiczenia jest porównanie długości genów dla dwóch drożdżowych białek
rybosomowych: P1A i P1B (powielonych metodą PCR z genomowego DNA drożdży). Białka
te cechuje jednakowa długość łańcucha polipeptydowego (106 aminokwasów) i duże
podobieństwo struktury pierwszorzędowej, czego pochodną są zbliżone masy cząsteczkowe
białek wynoszące odpowiednio 10 908 i 10 667 Da. Pozwala to założyć jednakową długość
sekwencji nukleotydowej mRNA kodującego te białka. Startery reakcji PCR zostały
zaprojektowane w ten sposób, aby powieleniu uległa sekwencja obejmująca początkowy
kodon ATG jak też kodon STOP obu białek, dlatego uzyskane po reakcji PCR fragmenty
DNA będą bezpośrednio odpowiadały długości genów kodujących te białka.
P1A 1 MSTESALSYA ALILADSEIE ISSEKLLTLT NAANVPVENI WADIFAKALD
P1B 1 MSDSIISFAA FILADAGLEI TSDNLLTITK AAGANVDNVW ADVYAKALEG
P1A 51 GQNLKDLLVN FSAGAAAPAG VAGGVAGGEA GEAEAEKEEE EAKEESDDDM
P1B 51 KDLKEILSGF HNAGPVAGAG AASGAAAAGG DAAAEEEKEE EAAEESDDDM
P1A 101 GFGLFD
P1B 101 GFGLFD
Rys. Porównanie sekwencji aminokwasowych drożdżowych białek P1A i P1B
Materiały i odczynniki
1. Genomowe DNA drożdży uzyskane w poprzednim ćwiczeniu.
2. Startery reakcji PCR dla genów kodujących białka P1A i P1B
3. Polimeraza Taq 0,5U/ l
4. Bufor dla polimerazy Taq (firmowy)
5. 2 mM mieszanina deoksynukleotydów (dNTP)
6. 25 mM MgCl2 (firmowy)
7. Jałowa dejonizowana woda
11
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
8. Jałowe probówki Eppendorfa o poj. 0,5 ml, cienkościenne probówki do reakcji PCR
o poj. 0,2 ml oraz końcówki do pipet
9. Odczynniki i zestaw do elektroforezy kwasów nukleinowych (patrz załącznik do
ćwiczeń)
Wykonanie ćwiczenia
1. Do probówki Eppendorfa o poj. 0,5 ml, umieszczonej w lodzie, odmierzyć następujące
składniki mieszaniny reakcyjnej:
23 l dejonizowanej wody
5 l dNTP
5 l buforu dla polimerazy Taq
5 l roztworu MgCl2
2 l genomowego DNA drożdży
2 l polimerazy DNA Taq
2. Wymieszać zawartość probówki i osadzić płyn ze ścianek przez krótkie odwirowanie,
po czym rozdzielić mieszaninę reakcyjną na dwie równe części do dwóch próbówek
do PCR. Następnie, do jednej z próbówek dodać po 2 l obu starterów do amplifikacji
genu kodującego białko P1A, a do drugiej probówki dodać po 2 l obu starterów do
amplifikacji P1B.
3. Reakcje przeprowadzić w termocyklerze w warunkach wskazanych przez
prowadzącego ćwiczenia. Po reakcji, do każdej probówki dodać po 5 l buforu do
elektroforezy DNA i dokonać elektroforetycznego rozdziału powstałych fragmentów
oraz komercyjnego wzorca DNA w 1% żelu agarozowym (według przepisu
zamieszczonego w załączniku do ćwiczeń).
Interpretacja wyników
1. Określić długość, rozdzielonych w żelu agarozowym, fragmentów DNA
i zinterpretować otrzymane wyniki.
2. Samodzielnie przeprowadzić porównanie sekwencji genów kodujących oba białka
korzystając z bazy http://www.yeastgenome.org/ (nazwy genów dla białek to
odpowiednio RPP1A i RPP1B) i przedstawić zestawienie sekwencji nukleotydowej
genów dla obu białek w formie pisemnej na następnych zajęciach.
12
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
Izolacja jąder komórkowych i histonów
U organizmów eukariotycznych, większość DNA znajduje się w wyspecjalizowanych
organellach  jądrach komórkowych. DNA jądrowy występuje w postaci kompleksu
nukleoproteinowego, zwanego chromatynÄ…. PodstawowÄ… jednostkÄ… strukturalnÄ… chromatyny
jest nukleosom. W skład nukleosomu wchodzi tzw. cząstka rdzeniowa (ang. core particle),
cząsteczka histonu H1 i fragment DNA o długości ok. 190-220 pz. Cząstkę rdzeniową tworzy
kompleks ośmiu histonów (oktamer) zwanych histonami rdzeniowymi (po dwie cząsteczki
histonów H2A, H2B, H3 i H4). Wokół oktameru owinięty jest odcinek DNA o długości 140-
150 pz. Pozostałą część stanowi łącznikowy DNA (ang. linker DNA) o długości 50-70 pz
z którym oddziałuje pojedyncza cząsteczka histonu H1. Znanych jest wiele wariantów
sekwencyjnych histonu H1, występujących w określonych tkankach lub etapach rozwoju
danego organizmu. Na przykład w jądrzastych erytrocytach ptaków zamiast histonu H1
występuje histon H5.
Histony mogą podlegać szeregu modyfikacjom potranslacyjnym, np. acetylacji,
metylacji, fosforylacji czy ubikwitynacji. Modyfikacje te majÄ… istotne znaczenie w regulacji
stopnia upakowania DNA i jego dostępności dla replikacji i transkrypcji np. acetylacja reszt
lizyny na N-końcu łańcucha polipeptydowego histonów rdzeniowych zmniejsza ich
powinowactwo do DNA, co powoduje rozluz
nienie struktury chromatyny i zwiększenie
poziomu ekspresji genów. Warto zauważyć, że wpływ modyfikacji potranslacyjnych
histonów na stopień kondensacji chromatyny i ekspresję genów nie zależy tylko od rodzaju
modyfikacji ale także od miejsca wystąpienia takiej modyfikacji na białku histonowym,
np. metylacja reszty lizyny w pozycji 9 łańcucha polipeptydowego histonu H3 powoduje
zwiększenie stopnia upakowania chromatyny i wyciszenie ekspresji genów zaś metylacja
reszty lizyny w pozycji 4 wpływa na rozluz
nienie struktury chromatyny. Wysunięto więc
hipotezę  kodu histonowego , która zakłada, że istnieją pewne określone wzory modyfikacji
histonów odpowiedzialne za zachodzenie konkretnych procesów w komórce.
Materiał badawczy do ćwiczeń to linia komórkowa fibroblastów mysich NIH 3T3 lub
linia komórkowa wywodząca się z komórek raka szyjki macicy HeLa. Komórki hodowane są
na płytkach Petriego (10x14cm) odpowiednio w płynie hodowlanym DMEM
i RPMI, w temperaturze 370C i w atmosferze 5% CO2. Celem ćwiczenia jest otrzymanie
preparatów zawierających wszystkie białka jądrowe oraz izolacja histonów z jąder komórek
13
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
linii NIH 3T3 lub HeLa. Histony oczyszcza się z jąder komórkowych wykorzystując zdolność
tych białek do rozpuszczania się w kwasach nieorganicznych, np. 0,25M HCl lub 0,2M
H2SO4.
Materiały i odczynniki
1. Hodowla komórkowa fibroblastów mysich NIH 3T3 lub komórek HeLa o gęstości
komórek ok. 90% (trzy płytki Petriego na jeden zespół studentów)
2. Bufor PBS
137 mM NaCl
2,7 mM KCl
10 mM Na2HPO4
2 mM KH2PO4, pH 7,5
3. Bufor do izolacji jÄ…der:
200 mM Tris-HCl, pH 7,5
100 mM NaCl
250 mM sacharoza
1 mM EDTA
0,5% Triton X-100
4. Bufor próbkowy do elektroforezy białek w żelu poliakrylamidowym
SDS-PAGE (4x stężony)
5. 0,25 M HCl
6. Aceton (oziębiony)
7. Zdrapywacz do komórek
8. Homogenizator szklano-teflonowy o pojemności 2 ml
9. Jałowe probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 i 2 ml oraz końcówki do pipet.
Przed przystąpieniem do wykonania ćwiczenia przygotować blok grzejny o temp. 950C
oraz schłodzić wirówkę do temp. 40C
14
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
Wykonanie ćwiczenia
Uwaga! Jeśli nie zaznaczono inaczej, poniższe czynności należy wykonywać
w temp. +40C
Otrzymywanie jąder z fibroblastów mysich NIH 3T3 lub komórek HeLa
1. Trzy płytki Petriego z komórkami fibroblastów mysich o gęstości ok. 90% przenieść
na lód i ściągnąć pipetą płyn hodowlany.
2. Przepłukać komórki na każdej płytce 5 ml oziębionego buforu PBS.
3. Po ściągnięciu pipetą buforu PBS zeskrobać komórki fibroblastów z płytek za pomocą
specjalnego zdrapywacza do komórek. Zawiesinę komórek spłukać ze wszystkich
płytek 3 ml oziębionego PBS i przenieść do dwóch probówek Eppendorfa o poj. 2 ml.
4. Komórki odwirować przy prędkości 2000 rpm przez 5 min. Supernatant odrzucić,
a osad z obu probówek zawiesić łącznie w 2 ml buforu do izolacji jąder i inkubować
20 min. w lodzie.
5. Przenieść zawiesinę komórek do homogenizatora szklano-teflonowego
i dezintegrować wykonując 40 ruchów teflonowym tłoczkiem (stopień dezintegracji
można zweryfikować przy użyciu mikroskopu świetlnego).
6. Uzyskany dezintegrat komórek przenieść do probówki Eppendorfa o poj. 2 ml
i odwirować przy prędkości 2000 rpm przez 10 min.
7. Supernatant (zawierający białka cytoplazmatyczne) przenieść do nowej probówki
Eppendorfa, oznaczyć w nim stężenie białka metodą Bradford (przepis w załączniku
do ćwiczeń), a następnie przygotować próbki do elektroforezy SDS-PAGE
zawierające po 15 źg i 30 źg białka (przepis w załączniku do ćwiczeń). Gotowe
próbki do analizy metodą SDS-PAGE przechowywać w temp. -200C do kolejnych
ćwiczeń.
8. Do osadu jąder dodać 1 ml buforu PBS, kilkukrotnie przepipetować zawartość
probówki w celu jej dokładnego wymieszania i odwirować przy 2000 rpm przez 10
min.
9. Po odwirowaniu usunąć z probówki supernatant przy pomocy pipety, a do osadu jąder
dodać 1 ml buforu PBS i dokładnie wymieszać ( za pomocą pipety).
15
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
Izolacja białek jądrowych
1. Do probówki Eppendorfa o poj. 1,5 ml przenieść 500 źl zawiesiny jąder i wirować
przy prędkości 2000 rpm przez 10 min.
2. Supernatant odrzucić a osad jąder zawiesić w 60 źl buforu próbkowego
do elektroforezy SDS-PAGE (1x stężony).
3. Próbki dokładnie wymieszać i inkubować w temp. 950C przez 5 min.
W wyniku uwolnienia DNA z jÄ…der zawiesina przyjmuje galaretowatÄ… konsystencjÄ™.
4. Po inkubacji próbki odwirować przy prędkości 10000 rpm przez 5 min. Supernatant
zawierający białka jądrowe przenieść do nowej probówki Eppendorfa i zamrozić.
Izolacja histonów z użyciem 0,25 M HCl
1. Do probówki Eppendorfa o poj. 1,5 ml przenieść 500 źl zawiesiny jąder i wirować
przy prędkości 2000 rpm przez 10 min.
2. Supernatant odrzucić, a do osadu jąder dodać 50 źl 0,25 M HCl i dokładnie
wymieszać.
3. Próbkę pozostawić w temp. pokojowej na 25 min. (ekstrakcja histonów),
a następnie odwirować przy prędkości 2000 rpm przez 10 min.
4. Supernatant zawierający histony przenieść do nowej probówki Eppendorfa o poj.
1,5 ml.
5. Do osadu dodać ponownie 50 źl 0,25 M HCl, dokładnie wymieszać i pozostawić
na 25 min. w temp. pokojowej (ponowna ekstrakcja w celu zwiększenia wydajności).
6. Próbkę odwirować przy prędkości 2000 rpm przez 10 min.
7. Uzyskane supernatanty, zawierające histony, połączyć.
8. Wytrącać histony z supernatantu przez dodanie 8 objętości (0,8 ml) oziębionego
acetonu. Całość pozostawić do kolejnych ćwiczeń (minimum na 24 godziny)
w temp. -20OC.
Analiza składu białkowego chromatyny
Ćwiczenie ma na celu dokonanie analizy białek jądrowych techniką elektroforezy
jednokierunkowej w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących SDS-PAGE
(metoda Laemmli ego).
16
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
Materiały i odczynniki
1. Aceton (oziębiony)
2. Odczynniki i zestaw do elektroforezy SDS-PAGE (patrz załącznik do ćwiczeń)
3. Preparaty białek jądrowych, cytoplazmatycznych i histonów otrzymane w poprzednim
ćwiczeniu
Przed przystąpieniem do wykonania ćwiczenia przygotować blok grzejny o temp. 900C
oraz schłodzić wirówkę do temp. 40C
Wykonanie ćwiczenia
1. rzygotować 13,8 % żel poliakrylamidowy do elektroforezy białek w warunkach
denaturujących według przepisu zamieszczonego w załączniku do ćwiczeń.
2. Próbki z wytrąconymi histonami odwirować przy prędkości 10000 rpm przez 15 min.
w 40C w celu otrzymania osadu białek histonowych. Następnie osad przemyć 1 ml
oziębionego acetonu i wysuszyć na powietrzu. Osad białek histonowych zawiesić
w 30 źl buforu próbkowego do elektroforezy SDS-PAGE (1x stężony).
3. Próbki zawierające wszystkie białka jądrowe, wyizolowane histony, białka
cytoplazmatyczne oraz wzorce białkowe zawieszone w buforze próbkowym do
elektroforezy SDS-PAGE ogrzewać przez 3 min. w temp. 900C. Bezpośrednio po
ogrzaniu nanosić na żel po 30 źl przygotowanych próbek. Rozdział prowadzić pod
napięciem 150V, tak długo, aż barwnik przesunie się do końca żelu separującego. Po
rozdziale białka wybarwić błękitem Coomassie (patrz załącznik do ćwiczeń).
Interpretacja wyników
1. Porównać skład białkowy preparatów poddawanych elektroforezie.
2. Określić masy cząsteczkowe białek histonowych.
17
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
Trawienie DNA chromatyny nukleazÄ… ze Staphylococcus aureus
Nukleaza ze Staphylococcus aureus (MN-aza, nukleaza mikrokokowa) jest
stosunkowo niespecyficzną endonukleazą, gdyż tnie zarówno jedno- jak i dwuniciowe kwasy
nukleinowe, chociaż bardziej aktywna jest wobec substratów jednoniciowych. Cięcie DNA
lub RNA następuje preferencyjnie w regionach bogatych w AT lub AU. Zmieszana
z chromatyną MN-aza tnie fragmenty DNA, które nie są chronione przez związanie
z białkami. Dlatego też w wyniku działania MN-azy na chromatynę otrzymuje się szereg
fragmentów odpowiadających mono- i oligonukleosomom. Enzym ten wykazuje swoją
aktywność w obecności jonów Ca2+. Reakcję trawienia chromatyny przez MN-azę można
zahamować stosując odpowiednie stężenie EGTA lub EDTA, które działają jako chelatory
jonów dwuwartościowych.
Ćwiczenie ma na celu otrzymanie mieszaniny oligonukleosomów w wyniku trawienia
chromatyny jąder fibroblastów mysich NIH 3T3 lub komórek HeLa przez niespecyficzną
endonukleazÄ™ ze Staphylococcus aureus.
Materiały i odczynniki
1. Hodowla komórkowa fibroblastów mysich NIH 3T3 lub komórek HeLa o gęstości
komórek ok. 90% (trzy płytki Petriego na jeden zespół studentów)
2. Bufor PBS
3. Bufor do izolacji jÄ…der
4. Zdrapywacz do komórek
5. Homogenizator szklano-teflonowy o poj. 2 ml
6. Bufor do cięcia MN-azą:
20 mM Tris-HCl, pH 8,8
5 mM CaCl2
7. Roztwór MN-azy w H2O (300 U/µl). BezpoÅ›rednio przed ćwiczeniami rozcieÅ„czyć
MN-azÄ™ 240-krotnie (1 µl roztworu MN-azy dodać do 239 µl H2O). Uzyskuje siÄ™
koÅ„cowe stężenie 1,25 U/µl
8. 100 mM EDTA
9. 10% SDS
18
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
10. Pronaza E  roztwór w H2O o stężeniu 25 mg/ml
11. Fenol, pH 7,5- 8,0
12. Chloroform
13. 5 M NaCl
14. 96% etanol (oziębiony)
15. 70% etanol (oziębiony)
16. Jałowe probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 i 2 ml oraz końcówki do pipet.
Przed przystąpieniem do wykonania ćwiczenia przygotować blok grzejny o temp. 370C
oraz schłodzić wirówkę do temp. 40C
Uwaga! Jeśli nie zaznaczono inaczej, poniższe czynności należy wykonywać
w temp. +40C
Otrzymywanie jąder z fibroblastów mysich NIH 3T3 lub komórek HeLa
1. Trzy płytki Petriego z komórkami fibroblastów mysich o gęstości ok. 90% przenieść
na lód i ściągnąć pipetą płyn hodowlany.
2. Przepłukać komórki na każdej płytce 5 ml oziębionego PBS.
3. Po usunięciu PBSu, zeskrobać komórki fibroblastów z płytek za pomocą specjalnego
zdrapywacza do komórek. Zawiesinę komórek spłukać ze wszystkich płytek 3 ml
oziębionego PBS i przenieść do dwóch probówek Eppendorfa o poj. 2 ml.
4. Komórki odwirować przy prędkości 2000 rpm przez 5 min. Supernatant odrzucić,
a osad z obu probówek zawiesić łącznie w 2 ml buforu do izolacji jąder i inkubować
20 min. w lodzie.
5. Przenieść zawiesinę komórek do homogenizatora szklano-teflonowego
i dezintegrować wykonując 40 ruchów teflonowym tłoczkiem (stopień dezintegracji
można zweryfikować przy użyciu mikroskopu świetlnego).
6. Uzyskany dezintegrat komórek przenieść do probówki Eppendorfa o poj. 2 ml
i odwirować przy prędkości 2000 rpm przez 10 min.
7. Po odwirowaniu usunąć z probówki supernatant przy pomocy pipety, a do osadu jąder
dodać 1 ml buforu do cięcia MN-azą i dokładnie wymieszać ( za pomocą pipety).
19
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
Trawienie DNA chromatyny MN-azÄ…
Uwaga! Wszystkie czynności należy wykonywać z zachowaniem warunków
jałowych. Pracę z fenolem wykonywać w rękawicach ochronnych
1. Zawiesinę jąder komórkowych odwirować przy prędkości 2000 rpm przez 10 min.
Supernatant odrzucić, a osad jąder zawiesić ponownie w 1 ml buforu do cięcia
MN-azÄ…
2. Dodać 5 µl przygotowanego roztworu MN-azy (6,25u) i wymieszać dokÅ‚adnie
zawartość probówki.
3. BezpoÅ›rednio po dodaniu enzymu przenieść 300 µl mieszaniny do nowej probówki
Eppendorfa o poj. 1,5 zawierajÄ…cej 30 µl oziÄ™bionego 100 mM EDTA (czas
trawienia 0).
4. Pozostałą część mieszaniny inkubować w temp. 37oC. Po upływie 5 i 10 min. (licząc
od czasu 0) inkubacji, przenosić po 300 µl mieszaniny do nowych probówek
Eppendorfa zawierajÄ…cych po 30 µl oziÄ™bionego 100 mM EDTA.
5. Do tak otrzymanych próbek dodać po 5 µl 10% SDS i 3 µl roztworu pronazy.
6. Inkubować próbki przez 30 min. w temp. 37oC (trawienie białek jądrowych). Reakcję
zatrzymać przez dodanie 34 µl 10% SDS.
7. Do każdej probówki dodać po 400 µl fenolu i wytrzÄ…sać caÅ‚ość przez 10 min.
(ekstrakcja DNA) po czym odwirować przez 5 min. (jeśli nie zaznaczono inaczej
wszystkie wirowania wykonywać przy 10000 rpm w 40C) w celu rozdzielenia faz.
8. Górne fazy wodne przenieść do nowych probówek Eppendorfa, dodać po 400 l
chloroformu i wytrząsać przez 5 min. (usuwanie resztek fenolu), a potem odwirować
przez 5 min.
9. Górne fazy wodne przenieść do nowych probówek Eppendorfa i dodać po 6 l 5M
NaCl oraz 800 l oziębionego 96% etanolu. Próbki pozostawić w temp. -20oC, w celu
precypitacji DNA, do kolejnych ćwiczeń.
20
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
Elektroforetyczna analiza DNA po trawieniu nukleazÄ…
ze Staphylococcus aureus
Ćwiczenie ma na celu dokonanie analizy otrzymanych na poprzednich ćwiczeniach
preparatów DNA techniką elektroforezy w żelu agarozowym.
Materiały i odczynniki
1. Odczynniki i zestaw do elektroforezy kwasów nukleinowych (patrz załącznik do
ćwiczeń)
2. Preparaty DNA otrzymane w trakcie poprzednich ćwiczeń.
Wykonanie ćwiczenia
1. Wytrącony na poprzednich ćwiczeniach DNA odwirować przy prędkości 10000 rpm
przez 15 min. w 40C. Uzyskany osad DNA przemyć 1 ml oziębionego 70% etanolu,
po czym odwirować przy 10000 rpm przez 5 min. i wysuszyć na powietrzu.
2. Osad DNA rozpuścić w 20 l buforu próbkowego do elektroforezy DNA.
3. Przygotować 80 ml 1% roztworu agarozy w buforze TAE według przepisu
zamieszczonego w załączniku do ćwiczeń
4. Na żel agarozowy nanieść otrzymane próbki DNA. Rozdział fragmentów DNA
prowadzić przy napięciu 100V dopóki czoło barwnika nie dotrze do 3/4 długości żelu.
Po zakończonej elektroforezie obserwować rozdzielone fragmenty DNA pod lampą
UV. Obrazem trawienia powinna być  drabinka prążków, które odpowiadają
fragmentom DNA stanowiącym wielokrotność około 200 par zasad.
Interpretacja wyników
1. Porównać obraz elektroforetyczny DNA przed i po trawieniu MN-azą.
2. Określić wielkość fragmentów DNA otrzymanych w wyniku działania MN-azy.
21
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
Transkrypcja w warunkach in vivo w komórkach bakteryjnych
i drożdżowych
W procesie transkrypcji, katalizowanej przez polimerazy RNA zależne od DNA,
informacja genetyczna zawarta w DNA zostaje przepisana na RNA. Celem ćwiczenia jest
zbadanie wpływu ryfampicyny i aktynomycyny D na transkrypcję w warunkach in vivo
w komórkach bakterii E. coli i drożdży S. cerevisiae. Ryfampicyna, półsyntetyczna pochodna
ryfamycyn, oddziaÅ‚uje z podjednostkÄ… ² bakteryjnej polimerazy RNA i blokuje inicjacjÄ™
transkrypcji nowych łańcuchów RNA nie wpływając na transkrypcję łańcuchów, których
synteza już się rozpoczęła. Aktynomycyna D wiążąc się z dwuniciowym DNA, uniemożliwia
wykorzystanie takiego DNA jako matrycy w syntezie RNA.
Materiały i odczynniki
1. 18 godzinna hodowla bakterii E. coli w podłożu LB (20 ml)
2. 18 godzinna hodowla drożdży S. cerevisiae w podłożu SD (20 ml)
3. Podłoże LB i SD
4. Ryfampicyna (20 mg/ml w metanolu)
5. Aktynomycyna D (5 mg/ml w 96% etanolu)
6. [3H]-urydyna
7. Wysuszone krążki bibuły Whatman 3MM o średnicy 2,0 cm, moczone uprzednio
przez dobÄ™ w roztworze 0,5M NaCl z dodatkiem 1 mg/ml nie znakowanej urydyny
8. TCA 5% i 10%
9. PÅ‚yn scyntylacyjny
Przed przystąpieniem do wykonania ćwiczenia przygotować dwie łaz
nie wodne:
jednÄ… o temp. 300C, a drugÄ… o temp. 370C
Wykonanie ćwiczenia
1. Zmierzyć gęstość optyczną całonocnych hodowli komórek drożdży przy długości fali
600 nm (OD600). Pomiar wykonać względem próby kontrolnej (pożywka SD). Jeśli
zaistnieje konieczność, (tzn. wielkość OD przekracza 1), należy próbkę hodowli
rozcieńczyć pożywką, a następnie uwzględnić to przy obliczaniu jej gęstości.
22
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
2. Znając gęstość optyczną hodowli drożdży, przygotować 5 ml hodowli rozcieńczonej
pożywką SD, do OD600=0,4.
3. Tak przygotowaną hodowlę rozlać, po 1 ml, do trzech probówek. Następnie do jednej
z probówek dodać 100 µg aktynomycyny D, do drugiej 100 µg ryfampicyny, a trzeciÄ…
pozostawić jako kontrolę. Zawartość probówek dokładnie wymieszać
i inkubować w temp. 300C przez 15 min.
4. Do wszystkich probówek dodać znakowanÄ… trytem urydynÄ™ w iloÅ›ci 10 µCi/ml
i wymieszać. NastÄ™pnie pobrać z probówek po 50 µl hodowli i nanieść na
przygotowane wcześniej krążki bibuły Whatman 3MM moczone
w roztworze nie znakowanej urydyny (czas 0). Identyczne próbki hodowli pobierać
po 15, 30, 45 i 60 minutach inkubacji.
5. Krążki wysuszyć pod lampą, przenieść do 10% TCA (ok. 100 ml) i pozostawić przy
stałym mieszaniu na 10 min.
6. Przenieść krążki do naczynia z 5% TCA (ok. 100 ml) i ponownie mieszać przez
10 min, po czym wysuszyć pod lampą.
7. Suche krążki umieścić w naczynkach scyntylacyjnych zawierających po 5 ml płynu
scyntylacyjnego i zliczyć radioaktywne piętno pochodzące od wbudowanej do RNA
[3H]-urydyny w liczniku scyntylacyjnym.
8. Identyczne doświadczenie wykonać z bakteriami E. coli, zachowując temperaturę
inkubacji 370C.
Interpretacja wyników
1. Porównać poziom inkorporacji [3H]-urydyny w hodowli bakteryjnej i drożdżowej
w zależności od czasu inkubacji i obecności antybiotyków. Wyniki przedstawić
w formie wykresu, odkładając na osi X czas inkubacji, a na osi Y poziom
inkorporacji (w imp/min.) [3H]-urydyny.
23
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
Izolacja i elektroforetyczna analiza RNA z komórek drożdży
Uzyskanie wysokiej jakości RNA jest pierwszym i często krytycznym etapem
eksperymentów w biologii molekularnej m. in. analizy  Northern , RT-PCR, badaniu
ochrony przed nukleazami, translacji in vitro, mapowania RNA, konstrukcji bibliotek cDNA.
W izolacji RNA duże znaczenie ma szybkość przeprowadzania procedury oczyszczania i
kontrolowanie aktywności rybonukleaz komórkowych, które mogą doprowadzić do szybkiej
degradacji RNA. Dlatego też podczas izolacji RNA wszystkie odczynniki należy
przygotowywać z użyciem wody traktowanej 0,1% pirowęglanem dietylu (DEPC), który jest
silnym inhibitorem RNaz. Ponadto trzeba stosować jednorazowy sterylny sprzęt laboratoryjny
wykonany z tworzyw sztucznych, który jest wolny od RNaz, a sprzęt wielokrotnego użytku
umieszczać w 3% roztworze H2O2, po czym przepłukać wodą traktowaną DEPC.
Opracowano szereg metod pozwalajÄ…cych na wyizolowanie czystych
i niezdegradowanych preparatów kwasów nukleinowych o pełnej aktywności biologicznej.
Jedną z nich jest ekstrakcja fenolowa. W podanej procedurze, całe nienaruszone komórki
drożdży poddawane są ekstrakcji fenolowej podczas, której RNA  przechodzi do tzw. fazy
wodnej. DNA jako substancja wielkocząsteczkowa pozostaje w fazie fenolowej, w której
obok DNA znajdują się inne składniki komórkowe stanowiące nierozpuszczalną frakcję
komórkową.
Materiały i odczynniki
Uwaga! Wszystkie roztwory należy przygotować z użyciem wody traktowanej DEPC.
1. Hodowla S. cerevisiae OD600 = 2 (100 ml)
2. H2O (DEPC, oziębiona)
3. Bufor do zawieszania komórek drożdży ( bufor AE):
50mM CH3COONa, pH 5,3
10 mM EDTA
4. 10% SDS
5. Kwaśny fenol (stały fenol nasycony wodą a następnie buforem AE )
z 0,1% hydroksychinoliną. Przechowywać w ciemności w 40C.
6. Mieszanina chloroform  alkohol izoamylowy (24:1)
7. 3 M CH3COONa, pH 5,3
8. 100% etanol (oziębiony)
24
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
9. 70% etanol (oziębiony)
10. 2M LiCl  0,1M CH3COONa, pH 5,3
11. Jałowe probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 ml i 2 ml oraz końcówki do pipet.
12. Odczynniki i zestaw do elektroforezy kwasów nukleinowych (patrz załącznik do
ćwiczeń)
Przed przystąpieniem do wykonania ćwiczenia schłodzić wirówkę do temp. +40C
oraz przygotować blok grzejny o temp. 650C
Izolacja RNA z komórek drożdży
Wykonanie ćwiczenia
Uwaga! Wszystkie czynności należy wykonywać z zachowaniem warunków
jałowych. Pracę z fenolem wykonywać w rękawicach ochronnych
1. Hodowlę drożdży odwirować w probówkach Eppendorfa o poj. 2 ml przez 5 min. przy
1500 rpm w 40C tak, aby w każdej probówce otrzymać osad komórek drożdży
pochodzący z 4 ml hodowli. Supernatant odrzucić, a osad komórek drożdży zawiesić
w 1 ml oziębionej H2O, po czym odwirować przez 5 min. przy 1500 rpm w 40C (na
tym etapie osad komórek drożdży można zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać
w  800C). Na wykonanie poniższej procedury potrzebny jest osad komórek
drożdży w dwóch probówkach.
2. Osad komórek drożdży w każdej probówce zawiesić w 400 l buforu AE, dodać po
40 l 10% SDS i wytrząsać przez 1 min.
3. Dodać do każdej probówki po 440 l kwaśnego fenolu i wytrząsać całość przez 5 min.
a następnie inkubować przez 15 min. w 650C (wytrząsając co 5 min.).
4. Po inkubacji probówki oziębić przez 5 min. w lodzie, a następnie odwirować przez
5 min. (jeśli nie zaznaczono inaczej wszystkie wirowania wykonywać przy
10000 rpm w 40C) w celu rozdzielenia fazy fenolowej i wodnej
5. Górne fazy wodne przenieść do nowych probówek Eppendorfa o poj. 1,5 ml,
ponownie dodać po 400 l kwaśnego fenolu i wytrząsać przez 5 min. a następnie
odwirować przez 5 min.
6. Górne fazy wodne przenieść do nowych probówek Eppendorfa o poj. 1,5 ml, dodać po
400 l mieszaniny chloroform : alkohol izoamylowy (usuwanie resztek fenolu)
i wytrząsać przez 5 min. a potem odwirować przez 5 min.
25
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
7. Górne fazy wodne przenieść do nowych probówek Eppendorfa o poj. 1,5 ml, dodać po
40 l 3M octanu sodu, pH 5,3 oraz 1 ml oziębionego 100% etanolu.
8. Próbki pozostawić w temp.  200C na 30 min. lub na noc w celu precypitacji RNA.
Następnie, precypitat RNA odwirować przez 15 min. Uzyskany osad przemyć 1 ml
oziębionego 70% etanolu i powtórnie odwirować przez 5 min.
9. Osad z jednej probówki wysuszyć na powietrzu (kilka minut do odparowania etanolu,
nie dopuszczając do całkowitego wyschnięcia osadu), a następnie rozpuścić w 20 l
wody i pozostawić w temp.  700C do analizy elektroforetycznej (surowy preparat
RNA).
10. Osad z drugiej probówki rozpuścić w 1 ml roztworu 2M chlorku litu z 0,1M octanem
sodu o pH 5,3 i mieszać przez 15 min.
11. Odwirować próbkę przez 15 min. i delikatnie usunąć, przy pomocy pipety,
supernatant. Uzyskany po wirowaniu osad to rRNA, który należy wysuszyć,
a następnie zawiesić w 15 l wody i pozostawić w temp.  700C do analizy
elektroforetycznej.
Elektroforetyczna analiza RNA
1. Przygotować 80 ml 1% roztworu agarozy w buforze TAE według przepisu
zamieszczonego w załączniku do ćwiczeń.
2. Do próbek RNA zawieszonych w wodzie dodać równą objętość buforu próbkowego
do elektroforezy RNA.
3. Nanieść przygotowane próbki RNA na żel.
4. Rozdział prowadzić przy napięciu 100V dopóki czoło barwnika nie dotrze do 3/4
długości żelu.
5. Po zakończonej elektroforezie obserwować rozdzielone RNA pod lampą UV.
Interpretacja wyników
1. Porównać skład preparatów poddawanych elektroforezie.
2. Określić masy cząsteczkowe rozdzielonych cząsteczek RNA.
26
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
Translacja w warunkach in vivo w komórkach bakteryjnych
i drożdżowych
Zdolność precyzyjnej translacji mRNA na białko jest jedną z podstawowych cech
życia na Ziemi. Chociaż aparat translacyjny wykazuje znaczne podobieństwa między
organizmami to jednak w toku ewolucji wykształciły się subtelne różnice w mechanizmie
biosyntezy białka u prokariontów i eukariontów. Te różnice wykorzystano w medycynie,
gdyż wiele związków selektywnie hamujących proces translacji u bakterii należy do
najbardziej skutecznych antybiotyków stosowanych przez człowieka.
Celem ćwiczenia jest zbadanie wpływu chloramfenikolu, cykloheksimidu
i puromycyny na biosyntezę białka w warunkach in vivo w komórkach bakterii E. coli
i drożdży S. cerevisiae. Chloramfenikol i cykloheksimid są inhibitorami aktywności
peptydylotransferazy, odpowiednio rybosomów bakteryjnych i eukariotycznych, zaś
puromycyna jest strukturalnym analogiem aminoacylo-tRNA i powoduje przedwczesnÄ…
terminację syntezy białka.
Materiały i odczynniki
1. 18 godzinna hodowla bakterii E. coli w podłożu M9 (20 ml)
2. 18 godzinna hodowla drożdży S. cerevisiae w podłożu SD (20 ml)
3. Podłoże M9 i SD
4. Chloramfenikol (10 mg/ml w 96% etanolu)
5. Cykloheksimid (10 mg/ml w H2O)
6. Puromycyna (10 mg/ml w H2O)
7. [35S]-metionina
8. Wysuszone krążki bibuły Whatman 3MM o średnicy 2,0 cm, moczone uprzednio
przez dobÄ™ w roztworze 0,5M NaCl z dodatkiem 1 mg/ml nie znakowanej metioniny
9. TCA 5% i 10%
10. PÅ‚yn scyntylacyjny
Przed przystąpieniem do wykonania ćwiczenia przygotować dwie łaz
nie wodne:
jednÄ… o temp. 300C, a drugÄ… o temp. 370C
27
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
Wykonanie ćwiczenia
1. Zmierzyć gęstość optyczną całonocnych hodowli drożdży przy długości fali 600 nm
(OD600). Pomiar wykonać względem próby kontrolnej (pożywka SD). Jeśli zaistnieje
konieczność, (tzn. wielkość OD przekracza 1), należy próbkę hodowli rozcieńczyć,
a następnie uwzględnić to przy obliczaniu jej gęstości. Znając gęstość optyczną
hodowli drożdży, przygotować 5 ml hodowli rozcieńczonej pożywką SD,
do OD600 = 0,4.
2. Tak przygotowaną hodowlę rozlać, po 1 ml, do czterech probówek. Następnie do
jednej z probówek hodowli dodać 200 µg cykloheksimidu, do drugiej 200 µg
puromycyny, do trzeciej 200 µg chloramfenikolu, a czwartÄ… pozostawić jako kontrolÄ™.
Zawartość probówek dokładnie wymieszać i inkubować w temp. 300C przez
20 min.
3. Do wszystkich probówek dodać znakowanÄ… metioninÄ™ w iloÅ›ci 10 µCi/ml
i wymieszać. BezpoÅ›rednio po dodaniu metioniny z probówek pobrać po 50 µl
hodowli i nanieść na przygotowane wcześniej krążki bibuły Whatman 3MM moczone
w roztworze metioniny (czas 0). Identyczne próbki hodowli pobierać po 15, 30, 45
i 60 min. inkubacji.
4. Krążki wysuszyć pod lampą, przenieść do 10% TCA (ok. 100 ml) i ogrzewać w temp.
850C przez 20 min.
5. Przenieść krążki do naczynia z 5% TCA (ok. 100 ml) i mieszać przez 15 min, po czym
wysuszyć pod lampą.
6. Suche krążki umieścić w naczynkach scyntylacyjnych zawierających po 5 ml płynu
scyntylacyjnego i liczyć radioaktywne piętno pochodzące od wbudowanej do białek
[35S]-metioniny przy użyciu licznika scyntylacyjnego.
7. Identyczne doświadczenie wykonać z bakteriami E. coli, zachowując temperaturę
inkubacji 370C.
Interpretacja wyników
1. Porównać poziom inkorporacji [35S]-metioniny w hodowli bakteryjnej i drożdżowej
w zależności od czasu inkubacji i obecności antybiotyków. Wyniki przedstawić
w formie wykresu, odkładając na osi X czas inkubacji, a na osi Y poziom
inkorporacji [35S]-metioniny (w imp/min.)
28
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
Badanie wpływu inhibitorów translacji na wzrost komórek
drożdżowych
Rybosom jest miejscem działania wielu chemicznie zróżnicowanych antybiotyków,
które wiążą się ze specyficznymi fragmentami tego rybonukleoproteinowego kompleksu,
wpływając w ten sposób na syntezę białka i wzrost komórek. Mutacje w niektórych białkach
rybosomowych mogą powodować zmianę wrażliwości komórek na inhibitory translacji.
Celem ćwiczenia jest przebadanie wpływu cykloheksimidu, anizomycyny,
higromycyny B i paromomycyny na wzrost komórek mutantów drożdżowych pozbawionych
różnych białek rybosomowych.
Anizomycyna i cykloheksimid są inhibitorami aktywności peptydylotransferazy
w podjednostce 60S rybosomów eukariotycznych. Z kolei higromycyna B i paromomycyna
należą do antybiotyków aminoglikozydowych, działających zarówno na komórki bakteryjne
jak i eukariotyczne, które wiążą się z rRNA małej podjednostki rybosomowej. Poprzez
oddziaływanie z miejscem A na rybosomie aminoglikozydy zwiększają częstotliwość błędów
w odczytywaniu mRNA. Ponadto higromycyna B hamuje etap translokacji podczas
biosyntezy białka.
Materiały i odczynniki
1. Całonocne hodowle drożdży S. cerevisiae  po 20 ml
(cztery szczepy wskazane przez prowadzącego ćwiczenia)
2. Podłoże YPD oraz YPD z 2% agarem
3. Roztwór higromycyny B (15 mg/ml w H2O)
4. Roztwór paromomycyny (250 mg/ml w H2O)
5. Roztwór anizomycyny (3 mg/ml w roztworze wodnym o pH d" 5)
6. Roztwór cykloheksimidu (0,25 mg/ml w H2O)
7. Jałowe płytki Petriego
8. Jałowe probówki Eppendorfa o poj. 1,5 ml i końcówki do pipet
9. Jałowe krążki bibuły Whatman 3MM o średnicy 6 mm i pęsety.
29
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
Wykonanie ćwiczenia
Uwaga! Wszystkie czynności należy wykonywać z zachowaniem warunków jałowych
1. Na cztery jałowe płytki Petriego wylać po 20 ml podłoża YPD z agarem i pozostawić
do zastygnięcia.
2. Zmierzyć gęstość optyczną całonocnych hodowli drożdży przy długości fali 600 nm
(OD600). Pomiar wykonać względem próby kontrolnej (podłoże YPD). Jeśli zaistnieje
konieczność, (tzn. wielkość OD przekracza 1), należy próbkę hodowli rozcieńczyć,
a następnie uwzględnić to przy obliczaniu jej gęstości. Znając gęstość optyczną
hodowli drożdży przygotować 1 ml hodowli rozcieńczonej pożywką YPD,
do OD600 = 1,0.
3. Rozprowadzić po 100 źl tak rozcieńczonych hodowli na przygotowane wcześniej
płytki Petriego ze stałym podłożem YPD.
4. Na płytki nanieść po cztery jałowe krążki bibuły Whatman 3MM i nakroplić na nie
po 10 źl roztworów paromomycyny, higromycyny B, anizomycyny i cykloheksimidu.
Po dwóch dniach inkubacji w temperaturze 300C zmierzyć średnice stref
zahamowania wzrostu komórek drożdży wokół krążków bibuły nasączonych
roztworami antybiotyków.
Interpretacja wyników
Porównać wpływ antybiotyków na wzrost poszczególnych szczepów drożdżowych
30
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
Otrzymywanie rybosomów i frakcji cytoplazmatycznej drożdży
Saccharomyces cerevisiae
Frakcjonowanie komórek to metoda rozdzielania struktur subkomórkowych
polegająca na wstępnej dezintegracji oraz poddaniu homogenatu wirowaniu różnicowemu
(kilkukrotnemu wirowaniu ze stopniowo wzrastającą siłą odśrodkową) albo wirowaniu
w gradiencie sacharozy czy chlorku cezu (poszczególne struktury subkomórkowe osadzają się
w roztworze o różnej gęstości).
Celem ćwiczenia jest izolacja mikrosomów i frakcji cytoplazmatycznej oraz
oczyszczenie rybosomów z drożdży S. cerevisiae techniką wirowania różnicowego.
Mikrosomy są pęcherzykami, powstającymi z samozasklepiających się fragmentów gładkiego
lub szorstkiego retikulum endoplazmatycznego. W celu uwolnienia rybosomów od błon
retikulum endoplazmatycznego stosuje siÄ™ bufor z dodatkem 1% niejonowego detergentu
jakim jest Triton X-100. Tak traktowane rybosomy (tzw. rybosomy surowe) zawierajÄ…
zasocjowane z nimi białka cytoplazmatyczne, które można usunąć z powierzchni rybosomów
za pomocą zbuforowanych roztworów o wysokim stężeniu soli.
Materiały i odczynniki
1. Osad zamrożonych komórek drożdży S. cerevisiae
2. Korund
3. 2 M Tris
4. 10% roztwór Tritonu X-100 w buforze A
5. Bufor A (do dezintegracji)
50 mM Tris-HCl, pH 7,5
80 mM KCl
12,5 mM MgCl2
0,5 mM EDTA
1 mM PMSF
6 mM ²- MET
6. Bufor B (do zawieszania rybosomów)
50% glicerol
50 mM Tris-HCl, pH 7,5
80 mM KCl
31
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
10 mM MgCl2
0,5 mM EDTA
5 mM DTT
7. Bufor A z dodatkiem 0,5 M KCl
8. 30% sacharoza w buforze A z dodatkiem 0,5 M KCl
9. Stały siarczan amonu
10. Bufor C (do preparatyki kinaz białkowych)
50 mM Tris  HCl, pH 7,5
0,5 mM EDTA
6 mM ²- MET
0,5 mM PMSF
11. Bufor C z dodatkiem 50% glicerolu
12. Wąż dializacyjny
Wykonanie ćwiczenia
Uwaga! Poniższe czynności należy wykonywać w temp. 40C
Dezintegracja komórek drożdży i otrzymywanie ekstraktu bezkomórkowego
1. Komórki drożdżowe dezintegrować, ucierając je z korundem w moz
dzierzu
porcelanowym przez około 20 min. Korund dodawać stopniowo w ilości wagowej
3 -krotnie większej od masy komórek. Podczas dezintegracji utrzymywać wartość pH
w zakresie 7,2  7,5 poprzez dodawanie 2 M Trisu (niebuforowanego).
2. Uzyskany dezintegrat drożdży zawiesić w buforze A i wirować przy 3000 rpm przez
10 min. celem osadzenia korundu i resztek komórek.
3. Uzyskany supernatant wirować przy 30000 x g w ciągu 15 min. aby osadzić struktury
subkomórkowe (mitochondria, jądra, ściany komórkowe).
4. Tak otrzymany ekstrakt komórkowy (tzw. frakcja S30) podzielić na dwie części. Do
jednej części, przy stałym mieszaniu, dodać 10% Tritonu X-100 tak, aby jego
końcowe stężenie wynosiło 1%, po czym ekstrakt mieszać jeszcze przez 15 min.
Drugą część ekstraktu przechowywać w tym czasie w temp. 40C.
5. Obie części wirować przy 400000 x g przez 35 min. W wyniku wirowania otrzymuje
siÄ™ frakcjÄ™ cytoplazmatycznÄ…, tzw. frakcjÄ™ S100 i frakcjÄ™ mikrosomalnÄ…
32
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
(z części nietraktowanej Tritonem X-100) oraz rybosomy surowe (z części
traktowanej Tritonem X-100).
6. Osad stanowiący frakcję mikrosomalną oraz połowę osadu rybosomów surowych
zawiesić w buforze B (za pomocą homogenizatora szklano-teflonowego), oznaczyć
stężenie rybosomów (przepis  patrz załącznik do ćwiczeń) i przechowywać do
kolejnych ćwiczeń w temp.  200 C.
Oczyszczanie rybosomów
1. Pozostałą część osadu rybosomów surowych zawiesić w buforze A z dodatkiem 0,5 M
KCl i mieszać w homogenizatorze szklanym przez 15 min. i ponownie osadzić przez
wirowanie przy 100000 x g przez 1,5 godz. Czynność tę wykonać dwukrotnie.
2. Uzyskany preparat rybosomów ponownie zawiesić w buforze A z 0,5 M KCl
i wirować przez 1cm warstwę zbuforowanego roztworu sacharozy (30% sacharoza
w buforze A z dodatkiem 0,5 M KCl) przy 100000 x g przez 3 godz. Po osadzeniu,
rybosomy zawiesić w buforze B, oznaczyć ich stężenie (przepis  patrz załącznik do
ćwiczeń) i przechowywać do kolejnych ćwiczeń w temp.  200 C.
Wysalanie białek z frakcji cytoplazmatycznej
1. Białka z frakcji cytoplazmatycznej wytrącać stałym siarczanem amonu przy
wysyceniu 0-55% (tabela frakcjonowania siarczanem amonu  patrz załącznik do
ćwiczeń). Siarczan amonu dodawać stopniowo mieszając przez 1 godzinę. Zawiesinę
odwirować przy 12000 rpm przez 20 min.
2. Osad wytrąconych białek rozpuścić w buforze C i poddać dializie (przepis  strona 84)
wobec buforu C z dodatkiem 50% glicerolu. Po zakończeniu dializy roztwór białek
cytoplazmatycznych przechowywać w temp.  200 C.
33
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
Izolacja kwaśnych białek rybosomowych z drożdży
Większość białek rybosomowych stanowią małe białka o charakterze zasadowym,
których punkt izoelektryczny oscyluje w pobliżu pH 8,5 lub wyższym. Duża podjednostka
rybosomów zawiera jednak grupę powierzchniowych białek kwaśnych, tworzących
charakterystyczną strukturę zwaną  kciukiem , który oddziałuje z czynnikami translacyjnymi
podczas syntezy białka. U bakterii kwaśne białka rybosomowe tworzą pentameryczny lub
heptameryczny kompleks, złożony, odpowiednio, z dwóch lub trzech dimerów białka L12
oraz pojedynczej cząsteczki białka L10. U Escherichia coli białko L12 nazywane jest L7/L12.
Różnica między L7 i L12 polega na potranslacyjnej acetylacji na N-końcu polipeptydu L7.
Białko L7/L12 E. coli złożone ze 120 aminokwasów i posiada masę cząsteczkową 12,2 kDa.
Eukariotyczne białka kwaśne noszą nazwę białek P, ze względu na ich fosforylacyjną
modyfikację. Białka te podzielono na dwie grupy. Jedną z nich stanowią dwa małe białka P1
i P2 o masie 11 kDa i pI równym 3,0-3,5, będące funkcjonalnymi odpowiednikami
bakteryjnego białka L12. U niższych eukariontów takich jak drożdże stwierdzono obecność
czterech białek P1/P2. Kwaśne białka drożdży S. cerevisiae nazwano P1A, P1B, P2A i P2B.
Ponadto u roślin zidentyfikowano dodatkowo białko P3. Drugą grupę białek P stanowi
pojedyncze białko P0 o masie ok. 34 kDa, będące odpowiednikiem bakteryjnego białka L10.
Na rybosomie białka P tworzą pentameryczny kompleks P0-(P1-P2)2, który wiąże się,
poprzez N-końcowy fragment białka P0, do wysoce konserwatywnego regionu 25S/28S
rRNA, zwanego centrum GTPazowym. U S. cerevisiae białka z grupy P1/P2 tworzą
preferencyjnie dwa heterodimery P1A-P2B i P1B-P2A w których N-końcowe fragmenty
białek są odpowiedzialne za dimeryzację i interakcje z białkiem P0, zaś karboksylowe końce
są wolne i oddziałują z czynnikami translacyjnymi takimi jak EF-2.
Białka z grupy P1/P2 nie są niezbędne dla aktywności translacyjnej rybosomu,
natomiast białko P0 jest stabilnym białkiem rdzenia rybosomowego i jest konieczne dla jego
funkcjonowania. Delecja genu dla P0 prowadzi do śmierci komórki. Wszystkie białka P
charakteryzują się niezwykle konserwatywną C-końcową domeną, zawierającą resztę seryny
ulegającą fosforylacyjnej modyfikacji oraz stanowiącą antygen, przeciwko któremu
skierowane są przeciwciała u ludzi cierpiących na niektóre choroby autoimmunologiczne
(układowy toczeń trzewny) i infekcyjne (choroba serca Chagasa, leiszmanioza).
W odróżnieniu od pozostałych składników rybosomu kwaśne białka rybosomowe,
zarówno bakteryjne jak i eukariotyczne, występują w postaci wolnej w cytoplazmie.
34
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
U organizmów eukariotycznych, w przeciwieństwie do bakterii, odbywa się ponadto wymiana
tych białek między rybosomem a pulą cytoplazmatyczną.
Materiały i odczynniki
1. Oczyszczone rybosomy drożdżowe o stężeniu 20 mg/ml
2. Bufor do ekstrakcji kwaśnych białek rybosomowych
20 mM Tris-HCl, pH 7,5
40 mM MgCl2
6 mM ²- MET
1 M NH4Cl
3. 96% etanol (oziębiony)
4. Aceton (oziębiony)
5. 25 mM Tris-HCl, pH 7,5
6. Odczynnik Bradford
Wykonanie ćwiczenia
1. Kwaśne białka rybosomowe ekstrahować z 2 mg rybosomów oczyszczonych
S. cerevisiae o stężeniu 20 mg/ml. Do zawiesiny rybosomów (1 objętość) dodać
1 objętość buforu do ekstrakcji białek kwaśnych i pozostawić na 5 min. w lodzie.
2. Dodać 1 objętość 96% etanolu (oziębionego) i pozostawić na 10 min. w lodzie.
3. Powtórzyć punkt 2.
4. Odwirować przy 10000 rpm przez 15 min. w celu osadzenia cząstek rdzeniowych
rybosomów ( tj. rybosomów zawierających białka, które nie zostały wyekstrahowane).
5. Supernatant zawierający kwaśne białka rybosomowe przenieść do nowej probówki
Eppendorfa, dodać trzykrotną objętość oziębionego acetonu (w celu wytrącenia białek
z supernatantu) i pozostawić w temp.  200 C przez co najmniej 24 godz.
6. Wytrącone białka osadzić drogą wirowania przy 10000 rpm przez 15 min., po czym
supernatant odrzucić, a osad kwaśnych białek rybosomowych wysuszyć na powietrzu
i zawiesić w 50 µl 25 mM Trisu  HCl, pH 7,5.
7. Oznaczyć stężenie białka metodą Bradford (przepis w załączniku do ćwiczeń)
35
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
Analiza elektroforetyczna białek rybosomowych
Ćwiczenie ma na celu dokonanie analizy białek rybosomowych techniką elektroforezy
jednokierunkowej w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących SDS-PAGE.
Materiały i odczynniki
1. Odczynniki i zestaw do elektroforezy SDS-PAGE (patrz załącznik do ćwiczeń)
2. Preparaty mikrosomów, rybosomów surowych i oczyszczonych oraz białek P
otrzymane na poprzednich ćwiczeniach
Wykonanie ćwiczenia
1. Przygotować 12,5 % żel poliakrylamidowy do elektroforezy białek w warunkach
denaturujących według przepisu w załączniku do ćwiczeń.
2. Przygotować po dwie próbki zawierające: a) 25 źg mikrosomów, b) 25 źg rybosomów
surowych, c) 25 źg rybosomów oczyszczonych, d) 10źg białek P, e) wzorce
białkowe, według przepisu w załączniku do ćwiczeń.
3. Próbki białkowe zawieszone w buforze próbkowym SDS/PAGE nanieść na żel
poliakrylamidowy. Rozdział prowadzić pod napięciem 150V tak długo, aż barwnik
przesunie się do końca żelu separującego. Po rozdziale, żel poliakrylamidowy
przeciąć na pół. Jedną część żelu wybarwić błękitem Coomassie,
a drugą srebrem (przepis w załączniku do ćwiczeń).
Interpretacja wyników
1. Porównać skład białkowy preparatów poddawanych elektroforezie.
2. Określić masy cząsteczkowe białek P.
3. Porównać czułość obu metod barwienia białek w żelu poliakrylamidowym.
36
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
Izolacja kinaz białkowych z drożdży Saccharomyces cerevisiae
Kinazy białkowe uczestniczą w regulacji wielu procesów metabolicznych, biorą udział
w transmisji sygnałów przez błony, regulują procesy wzrostu i różnicowania się komórek.
Oczyszczanie enzymów jest stosowane w badaniach ich struktury i funkcji. W tym
celu stosuje siÄ™ metody chromatografii jonowymiennej, chromatografii powinowactwa
i sączenia molekularnego, w których wykorzystuje się takie cechy białek enzymatycznych
jak: ładunek, powinowactwo wiązania do nośników, wielkość. Poniżej podana jest jedna
z metod oczyszczania białek przez rozdział w procesie chromatografii jonowymiennej (ang.
ion exchange chromatography  IEC). Rozdział białek w technice IEC polega na odwracalnej
adsorpcji obdarzonych ładunkiem elektrycznym makromolekuł na nośniku jonowymiennym
(jonowymieniaczu). Jonowymieniacz to złoże chromatograficzne z unieruchomionymi na
powierzchni polarnymi cząsteczkami posiadającymi ładunek elektryczny określonego znaku.
W zależności od tego jakie jony wiąże jonowymieniacz, mówimy o anionowymieniaczu
(anionicie)  wiążącym aniony lub o kationowymieniaczu (kationicie)  wiążącym kationy.
Celem ćwiczenia jest oczyszczenie kinaz białkowych PKA i CK2 z frakcji
cytoplazmatycznej komórek drożdży na DEAE-celulozie (anionit) i P-11 celulozie (kationit).
Materiały i odczynniki
1. Supernatant postrybosomalny z drożdży S. cerevisiae
2. DEAE-celuloza (DE-52) i P-11 celuloza wyrównoważone w buforze do preparatyki
kinaz białkowych
3. Bufor C (do preparatyki kinaz białkowych)
4. 0,2 M NaCl w buforze C
5. 0,4 M NaCl w buforze C
6. 0,7 M NaCl w buforze C
7. Bufor C z dodatkiem 50% glicerolu
8. Wąż dializacyjny
Wykonanie ćwiczenia
Chromatografia na DEAE-celulozie
1. Do 5 ml celulozy dodać odpowiednią ilość frakcji cytoplazmatycznej, przyjmując, że 1
ml DE-52 wiąże 5 mg białka.
37
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
2. Delikatnie mieszać przez 10 min., a następnie dodać 5 ml buforu C, zamieszać,
odwirować (jeśli nie zaznaczono inaczej wszystkie wirowania wykonywać przy
3000 rpm przez 5 min. w 40C) i zebrać supernatant (frakcja 1  zawierająca białka
niewiążące się do DE-52),
3. Do DE-52 dodać 50 ml 0,2 M NaCl w buforze C, zamieszać, odwirować i odrzucić
supernatant.
4. Powtórzyć pkt 3.
5. Do DE-52 dodać 5 ml 0,4 M NaCl (w celu elucji białek związanych z DE-52), mieszać
przez 10 min. i po odwirowaniu zebrać supernatant (frakcja 2).
Oczyszczanie PKA na P-11 celulozie
1. Supernatant zawierający białka niewiążące się do DE-52 (frakcja 1) dodać do 5 ml P-
11 celulozy, delikatnie mieszać przez 10 min. po czym odwirować i supernatant
odrzucić.
2. Do P-11 celulozy dodać 50 ml buforu C, zamieszać, odwirować i odrzucić
supernatant.
3. Powtórzyć pkt 2.
4. Następnie do P-11 celulozy dodać 5 ml 0,2 M NaCl w buforze C, mieszać przez 10
min. po czym odwirować i zebrać supernatant zawierający aktywność kinazy
białkowej A.
5. Zebrany supernatant poddać dializie (przepis  patrz załącznik do ćwiczeń) wobec
buforu C z dodatkiem 50% glicerolu. Po zakończeniu dializy roztwór przechowywać
w temp.  200 C.
Oczyszczanie CK2 na P-11 celulozie
1. Supernatant ulegający elucji przy 0,4 M NaCl (frakcja 2) rozcieńczyć dwukrotnie
buforem C i dodać do 5 ml P-11 celulozy, delikatnie mieszać przez 10 min. po czym
odwirować i supernatant odrzucić.
2. Do P-11 celulozy dodać 50 ml 0,2 M NaCl w buforze C, zamieszać, odwirować
i odrzucić supernatant.
3. Powtórzyć pkt 2.
38
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
4. Następnie do P-11 celulozy dodać 5 ml 0,7 M NaCl w buforze C, mieszać przez 10
min. po czym odwirować i zebrać supernatant zawierający aktywność kinazy
białkowej CKII.
5. Zebrany supernatant poddać dializie (przepis  patrz załącznik do ćwiczeń) wobec
buforu C z dodatkiem 50% glicerolu. Po zakończeniu dializy roztwór przechowywać
w temp.  200 C.
Lokalizacja i regulacja aktywności kinazy białkowej CK2
Kinaza białkowa CK2 (dawniej nazywana kinazą kazeinową II) jest tradycyjnie
klasyfikowana jako kinaza serynowo-treoninowa, niezależna od wtórnych przekaz
ników.
Niemniej pojawiły się doniesienia o zdolności CK2 do fosforylacji białek w resztach
tyrozynowych. Wykazano m.in., że jądrowe białko immunofilina FPR3 u drożdży
Saccharomyces cerevisiae jest fosforylowane w reszcie tyrozyny w pozycji 183 przez CK2,
co czyni ją kinazą o podwójnej specyficzności. Lista przypuszczalnych fizjologicznych
substratów tego enzymu zawiera ponad 300 białek, wśród których znajdują się syntaza
glikogenu, receptor insuliny, białka c-Myc i c-Myb czy topoizomerazy DNA I i II. Kinaza
białkowa CK2 jest szeroko rozpowszechniona w organizmach eukariotycznych. W
większości z nich występuje jako tetrameryczny kompleks składający się z dwóch
podjednostek katalitycznych (Ä… i/lub Ä… ) i dwóch podjednostek regulatorowych ².
W fosforylowanym białku CK2 rozpoznaje resztę seryny lub treoniny w sekwencji Ser/Thr 
X  X - Asp/Glu/pSer/pThr/pTyr, gdzie X oznacza dowolny aminokwas.
Celem ćwiczenia jest wykazanie obecności CK2 w formie zasocjowanej
z rybosomami i wolnej w cytoplazmie komórki drożdżowej oraz określenie specyficzności
substratowej i wpływu efektorów na aktywność tej kinazy.
Materiały i odczynniki
1. Preparat enzymatyczny kinazy CK2 po oczyszczeniu na DE-52 celulozie i P-celulozie
2. Frakcja mikrosomalna i rybosomy surowe o stężeniu 15 mg/ml
3. Bufor do oznaczania aktywności kinaz  10 x stężony:
200 mM Tris-HCl, pH 7,5
150 mM MgCl2
60 mM ²-MET
39
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
4. Substraty dla kinaz białkowych  10 x stężone:
fosfityna (30 mg/ml)
kazeina defosforylowana (30 mg/ml)
histon IIA (3 mg/ml)
protamina (3 mg/ml)
rybosomalne białka P (3 mg/ml)
5. 0,5 mM polilizyna
6. Heparyna  50 µg/ml
7. 2 mM spermina
8. 3 mM GTP
9. [Å‚32P]ATP
10. Kwas octowy 30% i 15%
11. Kwas trójchlorooctowy 10% i 5%
12. Krążki z bibuły szklanej i P-81
13. PÅ‚yn scyntylacyjny
14. Odczynniki i zestaw do elektroforezy SDS-PAGE (patrz załącznik do ćwiczeń)
Wykonanie ćwiczenia
Ustalenie optymalnej ilości enzymu
Optymalną dla przebiegu reakcji ilość enzymu ustalić badając aktywność kinazy
białkowej CK2 wobec kazeiny jako substratu. Mieszanina reakcyjna w końcowej objętości 50
µl zawiera:
20 mM Tris-HCl, pH 7,5
15 mM MgCl2
6 mM ²-MET
30µM [Å‚32P] ATP
150 µg kazeiny
2 - 10 µl frakcji enzymatycznej
40
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
Składniki mieszaniny reakcyjnej dodawać według kolejności przedstawionej
w poniższej tabeli (w µl):
Probówka nr
Składniki mieszaniny reakcyjnej 1 2 3 4 5 6
H2O uzupeÅ‚nić do objÄ™toÅ›ci 50 µl
Bufor do oznaczania aktywności kinaz 5 5 5 5 5 5
Kazeina - 5 - 5 - 5
[Å‚32P] ATP 5 5 5 5 5 5
Frakcja enzymatyczna - 2 - 5 - 10
InkubacjÄ™ prowadzić 20 min. w temp. 300C. ReakcjÄ™ zatrzymać przez dodanie 100 µl
10% TCA w celu precypitacji białek a następnie przesączyć na filtrach z bibuły szklanej,
przemywając dwa razy po 5 ml roztworu 5% TCA. Krążki wysuszyć i umieścić w płynie
scyntylacyjnym. Zliczyć radioaktywność.
Określenie specyficzności substratowej kinazy białkowej CK2
Zbadać aktywność kinazy białkowej CK2, uwzględniając optymalną ilość enzymu, z
wykorzystaniem poniżej podanych substratów. Składniki mieszaniny reakcyjnej dodawać
według schematu podanego dla ustalenia optymalnej ilości enzymu.
Lp. Substrat Wyjściowe stężenie substratu Końcowe stężenie substratu
(w mieszaninie inkubacyjnej)
1. fosfityna 30 mg/ml 3 mg/ml
2. kazeina 30 mg/ml 3 mg/ml
3. histon IIA 3 mg/ml 0,3 mg/ml
4. protamina 3 mg/ml 0,3 mg/ml
5. rybosomalne białka P 3 mg/ml 0,3 mg/ml
Inkubację prowadzić 20 min. w temp. 300C. Reakcję w probówkach zawierających
fosfitynÄ™, kazeinÄ™ i rybosomalne biaÅ‚ka P zatrzymać przez dodanie 100 µl 10% TCA,
a następnie przesączyć na filtrach z bibuły szklanej, przemywając dwa razy po 5 ml 5%
roztworem TCA po czym wysuszyć i umieścić w płynie scyntylacyjnym. Zliczyć
radioaktywność. W przypadku próbek zawierających protaminę i histon IIA bezpośrednio po
41
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
inkubacji nanosić po 40 µl mieszaniny inkubacyjnej na krążki z bibuÅ‚y P-81. Krążki pÅ‚ukać
przez 10 min. kolejno w 30% i 15% kwasie octowym a następnie wysuszyć i umieścić
w płynie scyntylacyjnym. Zliczyć radioaktywność.
Badanie wpływu efektorów na aktywność CK2
Zbadać wpływ polilizyny i heparyny na aktywność kinazy białkowej CK2,
(uwzględniając optymalną ilość enzymu), wobec kazeiny jako substratu. Końcowe stężenie
polilizyny w mieszaninie inkubacyjnej powinno wynosić 0,05 mM, 0,1 mM i 0,2 mM, zaś
heparynÄ™ należy dodawać do koÅ„cowego stężenia równego 5 µg/ml oraz 10 µg/ml. SkÅ‚adniki
mieszaniny reakcyjnej dodawać i inkubację prowadzić według schematu podanego dla
ustalenia optymalnej ilości enzymu.
Lokalizacja CK2 w formie zasocjowanej z rybosomami
Występowanie kinazy CK2 w formie zasocjowanej z rybosomami można wykazać
inkubujÄ…c rybosomy ze z
ródłem reszty fosforanowej, np. [ł32P] ATP, w obecności efektorów
aktywności CK2, bez dodawania preparatu egzogennej kinazy.
Składniki mieszaniny reakcyjnej dodawać według kolejności przedstawionej
w poniższej tabeli (w µl):
Probówka nr
Składniki mieszaniny reakcyjnej 1 2 3 4 5 6
H2O uzupeÅ‚nić do objÄ™toÅ›ci 50 µl
Bufor do oznaczania aktywności kinaz 5 5 5 5 5 5
Mikrosomy 10 - - - - -
Rybosomy surowe - 10 10 10 10 10
Heparyna - - 5 10 - -
Spermina - - - - 5 -
GTP - - - - - 5
[Å‚32P] ATP 10 10 10 10 10 10
1. Mieszaninę inkubować 30 min. w temp. 300C, po czym dodać 20 źl buforu
próbkowego do elektroforezy białek w warunkach denaturujących (SDS-PAGE)
w celu zatrzymania reakcji.
42
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
2. Przygotować 13,8 % żel poliakrylamidowy do elektroforezy białek w warunkach
denaturujących (SDS-PAGE) według przepisu w załączniku do ćwiczeń.
3. Próbki zawieszone w buforze próbkowym ogrzewać przez 3 minuty w temperaturze
900C. Bezpośrednio po ogrzaniu nanosić na żel po 20 źl przygotowanych próbek.
Rozdział prowadzić pod napięciem 150V tak długo, aż barwnik przesunie się do końca
żelu separującego. Po rozdziale białka wybarwić błękitem Coomassie (patrz załącznik
do ćwiczeń), wysuszyć, a następnie poddać autoradiografii.
Interpretacja wyników
1. Określić jakie substraty są fosforylowane przez kinazę białkową CK2.
2. Porównać wpływ poszczególnych efektorów na aktywność kinazy CK2.
3. Porównać poziom fosforylacji mikrosomów i rybosomów surowych przez
kinazę białkową CK2 zasocjowaną z rybosomami.
Aktywacja i specyficzność substratowa kinazy zależnej od cAMP
Kinaza białkowa zależna od cAMP, zwana także kinazą A (PKA) należy do najlepiej
poznanych wielofunkcyjnych kinaz serynowo-treoninowych. Substratami dla tej kinazy sÄ…
m.in. białka histonowe, białko S6 podjednostki rybosomowej 40S, syntaza glikogenu. PKA
jest holoenzymem składającym się z dwóch podjednostek regulatorowych (R) i dwóch
podjednostek katalitycznych (C). W obecności cAMP w komórce następuje aktywacja kinazy
w wyniku dysocjacji nieaktywnego holoenzymu na dimer podjednostek regulatorowych i dwa
aktywne monomery podjednostki katalitycznej według wzoru:
R2C2 + 4cAMP R2(cAMP)4 + 2C
W warunkach in vitro, aktywację kinazy A można przeprowadzić drogą kontrolowanej
proteolizy przy użyciu trypsyny, która odcina w podjednostce regulatorowej kinazy A
domenę wiążącą cykliczne nukleotydy, co prowadzi do aktywacji kinazy. Podjednostki
regulatorowe są istotne dla lokalizacji PKA w komórce. Przy udziale białek AKAP (ang. A-
kinase anchoring protein) wiążących się z jednej strony do podjednostek regulatorowych
PKA a z drugiej do białek cytoszkieletu czy membran organelli kinaza A jest kierowana do
określonych miejsc w komórce.
Celem ćwiczenia jest określenie specyficzności substratowej kinazy A oraz sposobów
jej aktywacji.
43
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
Materiały i odczynniki
1. Preparat enzymatyczny kinazy A po oczyszczeniu na DE-52 celulozie i P-celulozie
2. Bufor do oznaczania aktywności kinaz  10 x stężony
3. Substraty dla kinaz białkowych  10 x stężone (patrz str. 39)
4. 20 µM cAMP
5. 20 µM cGMP
6. [Å‚32P]ATP
7. Bufor T  10 x stężony:
100 mM Tris-HCl pH 8,0
100 mM ²-MET
8. BSA 6 mg/ml
9. Trypsyna 40 µg/ml w 1 mM HCl
10. 1 mM HCl
11. Inhibitor trypsyny 0,4 mg/ml
12. Kwas octowy 30% i 15%
13. Kwas trójchlorooctowy 10% i 5%
14. Krążki z bibuły szklanej oraz P-81
15. PÅ‚yn scyntylacyjny
Wykonanie ćwiczenia
Ustalenie optymalnej ilości enzymu
Optymalną dla przebiegu reakcji ilość enzymu ustalić badając aktywność kinazy PKA
wobec protaminy jako substratu. Mieszanina reakcyjna w koÅ„cowej objÄ™toÅ›ci 50 µl zawiera:
20 mM Tris-HCl, pH 7,5
15 mM MgCl2
6 mM ²-MET
30µM [Å‚32P] ATP
15 µg protaminy
2 µM cAMP
2 - 10 µl frakcji enzymatycznej
44
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
Składniki mieszaniny reakcyjnej dodawać według kolejności przedstawionej
w poniższej tabeli (w µl):
Probówka nr
Składniki mieszaniny reakcyjnej 1 2 3 4 5 6
H2O uzupeÅ‚nić do objÄ™toÅ›ci 50 µl
Bufor do oznaczania aktywności kinaz 5 5 5 5 5 5
Protamina - 5 - 5 - 5
cAMP - 5 - 5 - 5
[Å‚32P] ATP 5 5 5 5 5 5
Frakcja enzymatyczna - 2 - 5 - 10
InkubacjÄ™ prowadzić 20 min. w temp. 300C. BezpoÅ›rednio po inkubacji nanosić po 40 µl
mieszaniny inkubacyjnej na krążki z bibuły P-81. Krążki płukać przez 10 min. kolejno w 30%
i 15% kwasie octowym a następnie wysuszyć i umieścić w płynie scyntylacyjnym. Zliczyć
radioaktywność.
Określenie specyficzności substratowej kinazy A
Zbadać aktywność kinazy A, uwzględniając optymalną ilość enzymu, z
wykorzystaniem poniżej podanych substratów. Składniki mieszaniny reakcyjnej dodawać
według schematu podanego dla ustalenia optymalnej ilości enzymu (zamiast protaminy
dodawać podane poniżej substraty).
Lp. Substrat Wyjściowe stężenie substratu Końcowe stężenie substratu
(w mieszaninie inkubacyjnej)
1. fosfityna 30 mg/ml 3 mg/ml
2. kazeina 30 mg/ml 3 mg/ml
3. histon IIA 3 mg/ml 0,3 mg/ml
4. protamina 3 mg/ml 0,3 mg/ml
5. rybosomalne białka P 3 mg/ml 0,3 mg/ml
Inkubację prowadzić 20 min. w temp. 300C. W probówkach zawierających fosfitynę,
kazeinÄ™ i rybosomalne biaÅ‚ka P, reakcjÄ™ zatrzymać przez dodanie 100 µl 10% TCA,
a następnie przesączyć na filtrach z bibuły szklanej, przemywając, dwa razy po 5 ml,
5% roztworem TCA, po czym wysuszyć i umieścić w płynie scyntylacyjnym. Zliczyć
45
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
radioaktywność. W przypadku próbek zawierających protaminę i histon IIA bezpośrednio po
inkubacji nanosić po 40 µl mieszaniny inkubacyjnej na krążki z bibuÅ‚y P-81. Krążki pÅ‚ukać
przez 10 min. kolejno w 30% i 15% kwasie octowym, a następnie wysuszyć i umieścić
w płynie scyntylacyjnym. Zliczyć radioaktywność.
Badanie wpływu cGMP na aktywność kinazy A
Zbadać wpływ cGMP na aktywność kinazy A (uwzględniając optymalną ilość
enzymu), wobec protaminy jako substratu. Końcowe stężenie cGMP w mieszaninie
inkubacyjnej powinno wynosić 2 µM i 4 µM. SkÅ‚adniki mieszaniny reakcyjnej dodawać,
a także inkubację prowadzić według schematu podanego dla ustalenia optymalnej ilości
enzymu (zamiast cAMP dodawać cGMP).
Aktywacja kinazy A drogÄ… kontrolowanej proteolizy
Preparat kinazy A poddać inkubacji z trypsyną i bez trypsyny. Składniki mieszaniny
reakcyjnej dodawać wedÅ‚ug kolejnoÅ›ci przedstawionej w poniższej tabeli (w µl):
Probówka nr
Składniki mieszaniny reakcyjnej 1 2
H2O uzupeÅ‚nić do objÄ™toÅ›ci 50 µl
Bufor T  10x stężony 5 5
BSA  6 mg/ml 5 5
HCl  1 mM 5 -
Trypsyna  40 µg/ml - 5
Preparat kinazy A 20 20
InkubacjÄ™ prowadzić 15 min. w temp. 300C, po czym dodać 5 µl sojowego inhibitora
trypsyny w celu zatrzymania reakcji. Następnie w obu preparatach enzymatycznych
sprawdzić aktywność kinazy A wobec protaminy jako substratu w obecności cAMP i bez
cAMP według schematu podanego dla ustalenia optymalnej ilości enzymu.
Interpretacja wyników
1. Określić jakie substraty są fosforylowane przez kinazę A.
2. Wymienić sposoby aktywacji kinazy A.
46
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
Wykrywanie inhibitorów proteaz serynowych
Proteazy (proteinazy, peptydazy) to duża grupa enzymów należących do klasy hydrolaz,
przeprowadzających hydrolizę wiązań peptydowych. Ze względu na mechanizm katalizy
proteazy podzielone zostały na następujące grupy:
proteazy serynowe,
proteazy treoninowe,
proteazy cysteinowe,
proteazy aspartylowe
metaloproteazy
proteazy glutamylowe
Niektóre proteazy odcinają końcowe aminokwasy od łańcucha peptydowego
(egzopeptydazy, np. aminopeptydaza N, karboksypeptydaza A), a inne hydrolizujÄ…
wewnętrzne wiązania peptydowe (endopeptydazy, np. trypsyna, chymotrypsyna, pepsyna,
trombina). Proteazy występują w komórkach wszystkich organizmów. Aktywność proteaz jest
hamowana przez specyficzne inhibitory.
Ponad jedną trzecią wszystkich znanych enzymów proteolitycznych stanowią proteazy
serynowe. Są one zaangażowane w różnorodne reakcje w organizmie poczynając od prostego
trawienia białek w przewodzie pokarmowym po precyzyjnie regulowane kaskady np. kaskada
krzepnięcia krwi. Centrum aktywne wszystkich proteaz serynowych zawiera trzy, położone
blisko siebie, reszty aminokwasowe: histydynÄ™, serynÄ™ i kwas aspartylowy, tworzÄ…ce tzw.
triadę katalityczną biorącą bezpośredni udział w hydrolizie wiązania peptydowego.
Trombina ( EC 3.4.21.5) to enzym osocza należący do proteaz serynowych. Produkowana
jest z protrombiny osocza pod wpływem tromboplastyny i aktywatorów. Trombina umożliwia
powstanie nierozpuszczalnej fibryny z rozpuszczalnego fibrynogenu umożliwiając
krzepnięcie krwi. Trombina rozpoznaje sekwencję Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser i przecina
wiązanie peptydowe pomiędzy resztami Arg i Gly. Enzym wykazuje aktywność w pH 5,0-
10,0 (optimum to pH 8,3) i nie wymaga obecności dwuwartościowych jonów metali ani
kofaktorów.
W ćwiczeniu badane białko, zawierające sekwencję aminokwasową rozpoznawaną przez
trombinę, jest inkubowane z trombiną w obecności i bez inhibitorów proteaz. Po zakończeniu
inkubacji przeprowadza się elektroforezę badanego białka w żelu poliakrylamidowym
w warunkach denaturujących (SDS-PAGE) w celu identyfikacji inhibitorów hamujących
aktywność proteolityczną trombiny.
47
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
Materiały i odczynniki
1. Roztwór badanego białka w PBS (wg zaleceń prowadzącego ćwiczenia)
2. Trombina (2U/źl  bezpośrednio przed ćwiczeniami rozcieńczyć 50-krotnie w PBS)
3. EDTA (80 mM roztwór w H2O pH 8,0)
4. PMSF (16 mM roztwór w etanolu)
5. Pepstatyna A (16 źM roztwór w metanolu)
6. Bufor PBS:
137 mM NaCl
2,7 mM KCl
10 mM Na2HPO4
2 mM KH2PO4 pH 7,5
7. Odczynnik Bradford
8. Termoblok
9. Odczynniki i zestaw do elektroforezy SDS-PAGE (patrz załącznik do ćwiczeń)
Wykonanie ćwiczenia
1. Oznaczyć stężenie badanego białka metodą Bradford (przepis strona 80).
2. Badane białko poddać inkubacji z trombiną w obecności i bez inhibitorów proteaz
według poniższego schematu (na podstawie podanych stężeń substancji używanych
w doświadczeniu, należy samodzielnie obliczyć objętość tych substancji, którą trzeba
dodać do probówki):
Uwaga! Składniki mieszaniny reakcyjnej dodawać wg przedstawionej kolejności
Składniki mieszaniny Probówka nr
reakcyjnej 1 2 3 4 5 6 7
PBS uzupełnić do objętości 40 źl
Trombina (0,04 U/ źl) 0,4 U - 0,08U 0,4 U 0,4 U 0,4 U 0,4 U
EDTA 80 mM - - - - 10 mM - -
PMSF 16 mM - - - - - 2 mM -
Pepstatyna A 16 źM - - - - - - 2 źM
Zawartość probówek dokładnie wymieszać i inkubować 10 min. w temperaturze pokojowej,
a następnie dodać badane białko
Badane białko - 10 źg 10 źg 10 źg 10 źg 10 źg 10 źg
48
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
3. Mieszaninę inkubować 30 min. w temp. 370C, po czym dodać 15 źl buforu
próbkowego do elektroforezy białek w warunkach denaturujących (SDS-PAGE)
w celu zatrzymania reakcji (jeśli zachodzi taka potrzeba, próbki można pozostawić do
kolejnych ćwiczeń w temperaturze -200C).
4. Przygotować 13,8 % żel poliakrylamidowy do elektroforezy białek w warunkach
denaturujących (SDS-PAGE) według przepisu w załączniku do ćwiczeń.
5. Próbki zawieszone w buforze próbkowym ogrzewać przez 3 minuty w temperaturze
900C. Bezpośrednio po ogrzaniu nanosić na żel po 30 źl przygotowanych próbek.
Rozdział prowadzić pod napięciem 150V tak długo, aż barwnik przesunie się do końca
żelu separującego. Po rozdziale białka wybarwić błękitem Coomassie (patrz załącznik
do ćwiczeń ).
Interpretacja wyników
Określić, które z badanych inhibitorów hamują aktywność proteolityczną trombiny.
49
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
Identyfikacja inhibitora trypsyny metodÄ… elektroforezy
w warunkach niedenaturujÄ…cych
Elektroforeza w warunkach niedenaturujÄ…cych (PAGE) pozwala na analizÄ™
elektroforetyczną białek w formie natywnej i umożliwia identyfikację aktywności
badanych enzymów bądz
ich inhibitorów.
Celem ćwiczenia jest wykrycie specyficznego inhibitora trypsyny pochodzącego
z nasion soi. Trypsyna (EC 3.4.21.4) to enzym soku trzustkowego należący do grupy
proteaz serynowych. Trypsyna syntetyzowana jest w postaci nieaktywnego prekursora
(zymogenu) trypsynogenu. W dwunastnicy pod wpływem niewielkich nawet ilości innego
enzymu - enterokinazy dochodzi do aktywacji trypsynogenu. Dzięki autokatalitycznej
zdolności trypsyny szybko dochodzi do pełnego uczynnienia wydzielonego trypsynogenu.
Enzym ten hydrolizuje wiązania peptydowe, w których uczestniczą grupy karboksylowe
należące do lizyny lub argininy. W wyniku działania trypsyny powstają peptydy
zawierające na C-końcu resztę lizyny lub argininy. Optymalne pH dla aktywności
trypsyny wynosi 8,0. Aby zapobiec autolizie trypsynę należy przechowywać
w temperaturze poniżej -200C lub w pH równym 3,0. Aktywność trypsyny może zostać
zahamowana przez związanie specyficznego inhibitora. W poniższym ćwiczeniu inhibitor
trypsyny poddaje się elektroforezie w natywnym żelu poliakrylamidowym (PAGE)
zawierającym edestynę (białko z nasion konopi) będącą substratem dla trypsyny. Edestyna
nadaje żelowi mleczne zabarwienie. Po zakończeniu elektroforezy, żel inkubuje się
z roztworem trypsyny. W wyniku hydrolizy edestyny przez trypsynę w żelu powstają
przejaśnienia. Jedynie strefy żelu, w których zlokalizowany jest inhibitor trypsyny
pozostajÄ… mleczne.
Materiały i odczynniki
1. Edestyna (1 % roztwór w 0,05 M kwasie octowym)
2. Trypsyna ( 20 - 100 źg/ml w 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0  przygotować bezpośrednio
przed użyciem)
3. Inhibitor trypsyny (0,25 mg/ml w H2O)
4. 30% sacharoza
5. 1% błękit bromofenolowy
6. 5% roztwór TCA
50
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
7. Odczynniki i zestaw do elektroforezy PAGE (patrz załącznik do ćwiczeń)
Wykonanie ćwiczenia
1. Przygotować 10% żel poliakrylamidowy do elektroforezy białek w warunkach
niedenaturujących (PAGE) zawierający edestynę, według przepisu w załączniku do
ćwiczeń.
2. Przygotować próbki zawierające różne ilości inhibitora trypsyny: 1,25 źg; 2,5 źg; 5 źg
i 7,5źg w objętości 30 źl.
3. Do każdej probówki zawierającej inhibitor trypsyny dodać po 10 l 30% sacharozy
i 1 l 1% błękitu bromofenolowego. Dokładnie wymieszać i nanieść do studzienek
w żelu zagęszczającym.
4. Rozdział elektroforetyczny prowadzić pod napięciem 120 V tak długo, aż barwnik
przesunie się do końca żelu separującego.
5. Po zakończeniu elektroforezy żel inkubować w temperaturze 370C w roztworze
trypsyny o stężeniu 20 - 100 źg/ml w 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0 do momentu
zaobserwowania przejaśnień w żelu. Reakcję hydrolizy edestyny w żelu zatrzymać
przez dodanie 5% roztworu TCA.
51
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
Badanie aktywności enzymatycznej w żelu poliakrylamidowym
na przykładzie inwertazy
Badanie aktywności enzymów w żelu poliakrylamidowym jest często skuteczną
metodą identyfikacji enzymów w nieoczyszczonych preparatach białkowych. Badanie
aktywności enzymatycznej można przeprowadzać zarówno po rozdziale białek w żelu
poliakrylamidowym w warunkach denaturujÄ…cych jak i po elektroforezie w warunkach
natywnych. Wybór metody zależy w dużej mierze od wrażliwości badanego enzymu na
obecność SDS. W przypadku niektórych białek, które nie zachowują aktywności
enzymatycznej w obecności SDS, można przeprowadzić ich renaturację poprzez usunięcie
SDS (np. płucząc żel w roztworze 2,5% tritonu X-100). Jednakże nie ma jednej
uniwersalnej, efektywnej metody renaturacji enzymów, toteż aktywność enzymatyczną
niektórych białek bada się po przeprowadzeniu elektroforezy w warunkach natywnych.
Inwertaza, albo sacharaza (EC 3.2.1.26) katalizuje hydrolizę sacharozy będącej
disacharydem zÅ‚ożonym z czÄ…steczki Ä…-D-glukozy i czÄ…steczki ²-D-fruktozy poÅ‚Ä…czonych
wiÄ…zaniem Ä…1-²2 glikozydowym. Po rozerwaniu wiÄ…zania powstaje równomolarna
mieszanina czÄ…steczek glukozy i fruktozy. Inwertaza jest syntetyzowana przez wiele
szczepów drożdży i bakterii. Ilość enzymu produkowana przez mikroorganizm waha się
znacznie w zależności od gatunku, szczepu, czy dostępnego z
ródła węgla. Drożdże
Saccharomyces cerevisiae wytwarzają zarówno wewnątrz- jak i zewnątrzkomórkową
inwertazę. Zewnątrzkomórkowa inwertaza występuje w formie wysoce glikozylowanego
homodimeru wydzielanego do przestrzeni periplazmatycznej. Wewnątrzkomórkowa
inwertaza również tworzy homodimer ale nie ulega glikozylacji. Inwertaza jest
powszechnie stosowana w przemyśle spożywczym do produkcji fruktozy czy
w biosensorach do stałego monitorowania poziomu sacharozy.
Celem ćwiczenia jest identyfikacja aktywności enzymatycznej inwertazy z drożdży
S. cerevisiae po rozdziale w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących.
Materiały i odczynniki
1. 20-godzinna hodowla drożdży S cerevisiae, szczep W303 (50 ml na zespół studentów)
2. (NH4)SO4 cz. d. a. w postaci stałej
3. 10 mM bufor fosforanowy pH 7,0
4. 10 mM bufor fosforanowy pH 7,0 z dodatkiem 30% glicerolu
52
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
5. 10 mM bufor fosforanowy pH 5,8
6. 0,1 M r-r sacharozy w 10 mM buforze fosforanowym pH 5,8 (przygotować
bezpośrednio przed użyciem)
7. Chlorek tetrazolu w postaci stałej (chronić przed światłem!!!)
8. 1M NaOH
9. Inwertaza - preparat handlowy (1 mg/ml w 10 mM buforze fosforanowym pH 5,8) 
przygotować w dniu poprzedzającym ćwiczenia, przechowywać w temp. 40C.
10. Celulozowe  węże do dializy
11. Papierki wskaz
nikowe pH 5,4  7,0
12. 10% roztwór kwasu octowego
13. Odczynniki i zestaw do elektroforezy białek SDS/PAGE
Wykonanie ćwiczenia
Wysalanie i dializa białek z płynu pohodowlanego
1. Po ok. 20 godzinach hodowli, gdy OD600 równa się ok. 9-10 (faza stacjonarna)
odwirować komórki przy 3000 rpm przez 10 min.
2. Płyn pohodowlany zlać do cylindra (z
ródło inwertazy) a osad komórek odrzucić.
3. Zmierzyć objętość płynu pohodowlanego, przelać go do zlewki i pozostawić w lodzie
na mieszadle magnetycznym.
4. Białka wytrącać stałym siarczanem amonu przy wysyceniu 0-90% (tabela
frakcjonowania siarczanem amonu  załącznik do ćwiczeń). Siarczan amonu dodawać
stopniowo mieszając przez 1 godz. w temp. 40 C. Następnie zawiesinę odwirować
przy 10000 rpm przez 20 min.
5. Osad wytrÄ…conych biaÅ‚ek rozpuÅ›cić w 200-300 µl 10 mM buforu fosforanowego, pH
7,0 i poddać dializie (przepis  załącznik do ćwiczeń) wobec 10 mM buforu
fosforanowego, pH 7,0 z dodatkiem 30% glicerolu. Po zakończeniu dializy roztwór
białek przechowywać w temp.  200 C.
53
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
Oznaczanie aktywności inwertazy w żelu
1. Oznaczyć stężenie białka metodą Bradford (przepis  załącznik do ćwiczeń).
2. Przygotować 10% żel poliakrylamidowy do elektroforezy białek w warunkach
denaturujących (SDS/PAGE) według przepisu w załączniku do ćwiczeń.
3. Przygotować trzy próbki zawierajÄ…ce: 100 µg, 150µg i 200 µg biaÅ‚ka w objÄ™toÅ›ci 30 µl
i dodać do nich po 10 µl buforu próbkowego do elektroforezy biaÅ‚ek w warunkach
denaturujących (bezpośrednio przed naniesieniem na żel). Jako wzorzec przygotować
dwie próbki zawierajÄ…ce 10 µg i 20µg inwertazy handlowej w objÄ™toÅ›ci 30 µl i dodać
do nich po 10 µl buforu próbkowego. DokÅ‚adnie wymieszać (uwaga! nie ogrzewać
próbek w temperaturze 900C) i nanieść do studzienek w żelu zagęszczającym.
4. Rozdział elektroforetyczny prowadzić pod napięciem 150 V tak długo, aż barwnik
przesunie się do końca żelu separującego.
5. Po zakończeniu elektroforezy żel przenieść do małego pojemnika, przepłukać 30 ml
wody destylowanej, a następnie 30 ml 10 mM buforu fosforanowego pH 5,8.
6. Następnie żel zalać 30 ml 0,1 M roztworu sacharozy w 10 mM buforze fosforanowym
pH 5,8 i inkubować w łaz
ni wodnej w temp. 450C przez 45 min. Uwaga! Podczas
inkubacji należy kontrolować, za pomocą papierków wskaz
nikowych, pH r-ru
(pH r-ru wzrasta, zwłaszcza w ciągu pierwszych 15 min. inkubacji). W przypadku
zmiany pH, zlać roztwór sacharozy i zalać żel kolejną porcją.
7. Po zakończeniu inkubacji, zlać roztwór sacharozy, a żel przepłukać trzy razy wodą
destylowanÄ….
8. Ok. 10 min przed zakończeniem inkubacji przygotować wrzącą łaz
niÄ™ wodnÄ….
Naważyć 50 mg chlorku tetrazolu i rozpuścić w 50 ml 1M NaOH.
9. Gdy roztwór chlorku tetrazolu zaczyna zmieniać barwę (z bezbarwnej na różową),
wlać barwnik do naczynia z żelem i umieścić we wrzącej łaz
ni wodnej.
10. Żel barwić do pojawienia się czerwonych prążków białkowych.
11. Reakcję przerwać przez przeniesienie żelu do roztworu 10 % kwasu octowego.
54
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
Cykl życiowy drożdży Saccharomyces cerevisiae
Komórki drożdży mogą występować w dwóch formach: haploidalnej i diploidalnej.
Zarówno forma haploidalna jak i diploidalna może się rozmnażać na drodze podziałów
wegetatywnych (pączkowanie) i stabilnie rosnąć w hodowlach. Haploidalne komórki
drożdżowe mogą występować w dwóch typach płciowych  a i ą. Poprzez zlanie się dwóch
haploidalnych komórek o przeciwnych typach płciowych (koniugacja) powstaje komórka
diploidalna a/ą. Komórka w fazie diploidalnej może przechodzić normalne wegetatywne
podziały, lecz nie może się krzyżować z innymi komórkami. W niekorzystnych warunkach
środowiskowych komórka diploidalna może wejść na szlak sporulacji, wytwarzając po
podziałach mejotycznych, worek z czterema haploidalnymi zarodnikami (askosporami):
dwoma typu a i dwoma Ä… .
Cykl życiowy drożdży S. cerevisiae przedstawiono schematycznie na poniższym rysunku.
55
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
Koniugacja drożdży S. cerevisiae
Techniki koniugacji i sporulacji od lat sÄ… wykorzystywane w laboratoriach
zajmujących się drożdżami, gdyż pozwalają na połączenie haploidalnych klonów
o odmiennych cechach genetycznych. Po wytworzeniu zarodników przez pokolenie
diploidalne możliwa jest izolacja klonów pochodzących z jednego zarodnika o pożądanych
cechach genetycznych wprowadzonych przez oba szczepy haploidalne użyte do koniugacji.
Aby ułatwić takie manipulacje utworzono na drodze mutagenezy liczne tandemy szczepów
haploidalnych a i ą różniące się posiadanymi markerami auksotroficznymi, co pozwala na
swobodne krzyżowanie i łatwą selekcję pokolenia diploidalnego. Przykładem, który to
ilustruje jest często wykorzystywany tandem szczepów drożdżowych BY4741 i BY4742
o cechach genotypowych ujętych w tabeli:
Nazwa Typ markery auksotroficzne
szczepu płciowy
BY4741 a his3"1; leu2"0; ura3"0; met15"0
BY4742 Ä… his3"1; leu2"0; ura3"0; lys2"0
W obu szczepach obecne sÄ… delecje inaktywujÄ…ce geny zwiÄ…zane z biosyntezÄ…
histydyny, leucyny i uracylu, co pozwala na dowolne wprowadzanie: (1) mutacji kierowanych
(ang. site directed) na chromosomie za pomocą aktywnych kopii genów (HIS3, LEU2
i URA3), (2) plazmidów posiadających wymienione geny w celu selekcji. Pozostałe markery
służą do przeprowadzenia procesu koniugacji pomiędzy tymi szczepami. Po zmieszaniu
hodowli obu szczepów haploidalnych i przeniesieniu mieszaniny na podłoże pozbawione
metioniny i lizyny, nie zaobserwujemy wzrostu haploidalnych pokoleń rodzicielskich a i ą,
natomiast uzyskamy wzrost szczepu diploidalnego, powstałego w wyniku koniugacji obu
szczepów haploidalnych, który będzie zawierał zarówno po nieaktywnej kopii genów
met15"0 i lys2"0 jak i ich aktywne kopie wprowadzone przez przeciwny typ płciowy.
Materiały i odczynniki
1. Nocna hodowla wzorcowych szczepów drożdży BY4741(a) i BY4742(ą)  po 5 ml
2. Nocna hodowla badanych szczepów drożdży (wybranych przez prowadzącego
ćwiczenia  po 5 ml, oznaczonych jako x i y)
3. Podłoże SD z 3% agarem -50 ml
4. 40% glukoza
5. Mieszanina aminokwasów pozbawiona metioniny i lizyny (10 x stężona)
56
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
6. Jałowa woda dejonizowana
7. Jałowe płytki Petriego
8. Jałowe probówki Eppendorfa o poj. 1,5 ml i końcówki do pipet
Wykonanie ćwiczenia
Uwaga! Wszystkie czynności należy wykonywać z zachowaniem warunków jałowych.
1. Przygotować podłoże SD z agarem  w tym celu rozpuścić podłoże SD z agarem (42,5
ml) ,wskazane przez prowadzącego ćwiczenia, w gorącej łaz
ni wodnej lub kuchence
mikrofalowej, a następnie dodać 5 ml roztworu aminokwasów pozbawionych lizyny
i metioniny oraz 2,5 ml roztworu 40% glukozy, wymieszać i wylać na dwie jałowe
płytki Petriego
2. Pozostawić uchylone płytki do osuszenia przez 15 minut.
3. Odwirować przy 10000 rpm przez 1 min. po 200 µl caÅ‚onocnych hodowli szczepów
wzorcowych i szczepów badanych.
4. Osad komórek zawiesić w 1000 µl jaÅ‚owej wody i ponownie odwirować w celu
usunięcia resztek podłoża.
5. Osad komórek zawiesić w 500 µl jaÅ‚owej wody.
6. Wykonać koniugację badanych szczepów z wzorcami typu płciowego a i ą
wg zaÅ‚Ä…czonego schematu, nanoszÄ…c na pÅ‚ytkÄ™ z podÅ‚ożem po 8 µl zawiesiny komórek
(górny panel w schemacie to testowa koniugacja szczepów wzorcowych wykonywana
w celu sprawdzenia poprawności procedury)
7. Płytki inkubować w temp. 300C do pojawienia się wzrostu koniugantów (3-4 dni).
a a+Ä… Ä…
Schemat wykonania koniugacji
Ä…
dla szczepu x
a a+x x
x x+ Ä… Ä…
Interpretacja wyników
Określić typ płciowy badanych szczepów drożdży.
57
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
Sporulacja drożdży S. cerevisiae
Wytworzenie zarodników (spor) poprzedzone podziałem mejotycznym jest jedną
ze strategii przetrwania komórek drożdży w czasie pogorszenia się warunków wzrostu
w środowisku. Spory ze względu na odmienną budowę ścian komórkowych i kondensację
cytoplazmy są bardziej odporne niż komórki wegetatywne na szkodliwe czynniki takie jak
wysuszenie czy wysoka temperatura.
W warunkach laboratoryjnych proces wytwarzania zarodników możemy indukować
dobierając odpowiednio podłoża. W pierwszym pasażu komórki drożdżowe hoduje się na
podłożu stałym bogatym w z
ródła azotu i aminokwasy (pepton, ekstrakt drożdżowy) oraz
w obecności niefermentowalnych z
ródeł węgla takich jak etanol czy gliceryna, w czasie
wzrostu metabolizm drożdży przestawiony zostaje na oddychanie tlenowe. Z takiego podłoża
komórki drożdży przenosi się na podłoże minimalne pozbawione z
ródeł azotu oraz
z ograniczonym dostępem do substancji mogących stanowić z
ródła energii. Standardowo
wykorzystujemy w tym celu podłoże agarowe zawierające jedynie octan potasu. Gwałtowne
pogorszenie warunków wzrostu, połączone z obniżeniem temperatury inkubacji z 300C do
250C, indukuje procesy prowadzące do podziału mejotycznego i wytworzenia zarodników.
Materiały i odczynniki
1. Płytka Petriego z podłożem presporulacyjnym YPGlic (2% pepton, 1% ekstrakt
drożdżowy, 2% glicerol, 2% agar) z rosnącymi komórkami drożdży pokolenia
diploidalnego  przygotować trzy dni przed zajęciami
2. Podłoże sporulacyjne (1% octan potasu, 2 % agar)
3. Jałowe płytki Petriego
4. Eza
5. Parafilm
Wykonanie ćwiczenia
Uwaga! Wszystkie czynności należy wykonywać z zachowaniem warunków jałowych.
1. Przygotować jałowe płytki Petriego z podłożem sporulacyjnym.
2. Za pomocą ezy przenieść komórki drożdży z podłoża presporulacyjnego na podłoże
sporulacyjne rozprowadzając je grubą warstwą w postaci kwadratów o powierzchni
1 cm kw.
3. Płytki Petriego szczelnie zabezpieczyć parafilmem przed wysychaniem.
58
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
4. Inkubować płytki Petriego w temp. 250C lub w temp. pokojowej do następnych
ćwiczeń (min. 7 dni).
Otrzymanie pokolenia haploidalnego drożdży po sporulacji
Poprawa warunków środowiska prowadzi do kiełkowania zarodników. Pokolenie
haploidalne najczęściej jeszcze w zarodni wchodzi w proces koniugacji prowadzący do
odtworzenia pokolenia diploidalnego. W warunkach laboratoryjnych istotne jest oddzielenie
zarodników od komórek wegetatywnych oraz rozbicie zarodni (worków) celem separacji
zarodników, aby nie dopuścić do przypadkowych koniugacji.
W tym celu najczęściej dokonujemy mechanicznego rozerwania ścian zarodni poprzez
np. wytrzÄ…sanie z kulkami szklanymi, bÄ…dz
prowadzimy enzymatyczną degradację ściany za
pomocÄ… enzymów rozkÅ‚adajÄ…cych wiÄ…zanie ²(1-3) glikozydowe, np. zymoliazy (Å›ciana
zarodnika, ze względu na odmienną budowę, jest na trawienie takimi enzymami odporna). Po
uwolnieniu zarodników przeprowadzamy ich izolację wykorzystując różnice w masie
zarodników i komórek wegetatywnych lub doprowadzamy do zabicia komórek
wegetatywnych działając na nie wysoką temperaturą.
Materiały i odczynniki
1. Podłoże sporulacyjne z komórkami drożdży przygotowanymi na poprzednich
zajęciach
2. Nocna hodowla drożdży BY 4741 na płynnym podłożu YPD  5 ml
3. Podłoże YPD (2% pepton, 1% ekstrakt drożdżowy 2% glukoza, 2% agar)  200 ml
4. Jałowy bufor PBS
5. Jałowe płytki Petriego
6. Eza
7. GÅ‚aszczka
8. Jałowe probówki Eppendorfa o poj. 1,5 ml oraz końcówki do pipet
9. Termoblok
10. Mikroskop świetlny oraz szkiełka podstawowe i nakrywkowe
Wykonanie ćwiczenia
Uwaga! Wszystkie czynności należy wykonywać z zachowaniem warunków jałowych.
59
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
1. Przygotować 8 płytek Petriego z podłożem YPD z 2% agarem.
2. Za pomocą ezy pobrać komórki z płytek z podłożem sporulacyjnym i zawiesić je
w 1 ml buforu PBS, utrzymując komórki w lodzie.
3. Zwirować 1 ml komórek nocnej hodowli drożdży i osad zawiesić w 1 ml buforu PBS.
4. Zmierzyć gęstość optyczną zawiesiny komórek pobranych z podłoża sporulacyjnego
oraz zawiesiny komórek pobranych z nocnej hodowli drożdży przy długości fali 600
nm (OD600). Zachować zawiesiny drożdży do przygotowania preparatów
mikroskopowych na póz
niejszym etapie ćwiczeń.
5. Dla obu próbek przygotować, w probówkach Eppendorfa o poj. 1,5 ml, po 1 ml
rozcieńczonej zawiesiny komórek o gęstości OD600 = 0,1 w buforze PBS.
6. Pobrać do osobnych probówek Eppendorfa po 0,1 ml zawiesiny (czas 0)
7. Pozostałą część zawiesiny umieścić w termobloku w temperaturze 500C i pobierać po
0,1 ml zawiesiny w odstępach 15 minutowych (czas 15, 30 i 45 min). Ze względu na
szybką sedymentację komórek drożdży, przed pobraniem zawartość probówek
wymieszać.
8. W czasie inkubacji przygotować preparaty mikroskopowe komórek drożdży z płytek
z podłożem sporulacyjnym i nocnej hodowli drożdży, nanosząc na szkiełko
podstawowe po 5 µl zawiesiny drożdży. Zanotować różnice w wyglÄ…dzie komórek
zwracając uwagę na: liczbę pączkujących komórek, ich wielkość oraz obecność tetrad
zarodników.
9. Pobrane w czasie 0, 15, 30 i 45 min. zawiesiny komórek rozprowadzić głaszczką na
płytkach Petriego z podłożem YPD z 2% agarem.
10. Płytki Petriego szczelnie zabezpieczyć parafilmem przed wysychaniem.
11. Inkubować w temperaturze 300C do czasu pojawienia się kolonii drożdży (3-5 dni).
12. Policzyć ilość kolonii na każdej płytce i zanotować wynik.
60
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
Transfer genów do komórek ssaczych  transfekcja
Wykorzystanie hodowli komórkowych w badaniach naukowych umożliwiło poznanie
licznych szlaków metabolicznych, a możliwość ekspresji genów w komórkach ssaczych
stwarza obecnie szansÄ™ na uzyskanie odpowiedzi na kluczowe problemy biologii. JednÄ… z
metod wykorzystywanych podczas analizy wielu istotnych procesów zachodzących w żywych
komórkach jest transfekcja, która umożliwia wprowadzenie genów (głównie DNA, ale
również RNA, a nawet białek) do komórek ssaczych.
Prowadzenie hodowli komórkowych
Hodowla komórek jest metodą umożliwiającą utrzymywanie poza organizmem, czyli in
vitro, żywych komórek, fragmentów tkanek lub narządów. Jest to termin o szerokim
wachlarzu znaczeń, obejmujący hodowle wycinków tkankowych, hodowle narządowe,
hodowle komórkowe pierwotne i hodowle linii oraz szczepów komórkowych, jak również
kokultury organotypowe i hodowle przestrzenne. Pod pojęciem  hodowle komórek należy
rozumieć hodowle zdyspergowanych komórek w hodowlach pierwotnych i w hodowlach
komórek linii komórkowych, rosnące w systemie jednowarstwowym (hodowle adherentne)
lub w zawiesinie (hodowle zawiesinowe). Hodowla pierwotna jest zakładana z materiału
pobranego bezpośrednio z organizmu. Wyprowadza się ją z eksplantów tkanki/narządu lub z
zawiesiny powstałej po ich enzymatycznym rozproszeniu. Linia komórkowa jest populacją
komórek powstającą z hodowli pierwotnej po pierwszym pasażu. Pasażowaniem nazywa się
przeniesienie komórek ze starego naczynia hodowlanego do nowych naczyń, zawierających
świeżą pożywkę. Pasażowaniu poddaje się komórki przed osiągnięciem konfluencji czyli
stanu, kiedy komórki w hodowli pokrywają ścisłą warstwą całą powierzchnię dna naczynia
hodowlanego. Podczas pasażowania komórki rozcieńcza się w odpowiednim stosunku i
przenosi do nowych naczyń, namnażając w ten sposób populację komórek i zapewniając
jednocześnie ciągłość jednolitego materiału do badań.
Hodowla komórek in vitro wymaga zachowania sterylnych warunków, zapewnienia
środowiska wzrostu o optymalnej temperaturze i wilgotności oraz dostarczenia komórkom
wszystkich niezbędnych do życia i proliferacji składników odżywczych i wzrostowych.
W laboratoriach, w których prowadzi się badania w układach komórkowych in vitro,
zachodzi potrzeba ograniczenia ilości pasaży hodowli oraz ilości hodowli komórkowych
 znajdujących się w danym momencie w hodowli . Dodatkowo, niektóre linie komórkowe
61
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
charakteryzuje ograniczona liczba podziałów i czas w jakim mogą być utrzymywane w
hodowli. Między innymi z tego powodu powszechnie praktykowane jest zamrażanie linii
komórkowych i przechowywanie zamrożonych komórek w tzw. bankach komórek.
Podstawową zasadą tej praktyki jest powolne zamrażanie i szybkie rozmrażanie komórek.
Przyjmuje się, że w czasie zamrażania komórek temperatura powinna spadać z szybkością
1  3 °C/min., natomiast rozmrażanie należy prowadzić przez 3 - 5 min. w temperaturze
37 °C. Ponadto, podczas zamrażania komórek należy postÄ™pować wg Å›ciÅ›le okreÅ›lonych
reguł. Procedurę należy rozpocząć od makroskopowej i mikroskopowej analizy stanu
hodowli. Komórki w hodowli powinny być w dobrej kondycji, bez mikrobiologicznych
zakażeń oraz znajdować się w logarytmicznej fazie wzrostu. Proces zamrażania może być
zabójczy dla komórek ze względu na towarzyszące mu efekty uboczne tj.: uszkodzenia
wywołane powstającymi w komórce kryształkami lodu, zmiany stężenia elektrolitów,
dehydratację czy zmiany pH, dlatego żeby zminimalizować ich negatywny wpływ stosuje się
określone środki ostrożności. Przede wszystkim do pożywki dodaje się tzw. związki
krioprotekcyjne (najczęściej DMSO lub glicerol) obniżające punkt zamarzania. Ponadto,
zwiększa się zawartość surowicy w pożywce do zamrażania komórek w stosunku do pożywki
wzrostowej używanej standardowo do hodowli tych samych komórek (zazwyczaj powyżej
20%, wyjątkowo nawet 90%). Zamrożone komórki przechowuje się w temperaturze poniżej -
135°C, w ciekÅ‚ym azocie (-196ºC) lub w jego oparach (-178ºC).
Celem ćwiczenia jest pasaż linii komórkowej HeLa, zaszczepienie jej do naczyń
hodowlanych oraz zamrożenie komórek w celu dalszego ich przechowywania.
Materiały i odczynniki:
1. Hodowle komórkowe (adherentne) w naczyniach hodowlanych
2. Podłoże hodowlane MEM (MEM, 10% płodowa surowica bydlęca, 2 mM glutamina,
0,1 mM aminokwasy wzbogacajÄ…ce, antybiotyki: penicylina (100 U/ml)
i streptomycyna (100 źg/ml))
3. Roztwór 0,25% trypsyny z EDTA
4. PBS
5. Pożywka do zamrażania hodowli komórkowych
6. Naczynia hodowlane (płaskodenne butelki hodowlane/płytki Petriego)
7. Jałowe pipety pasteurowskie
8. Pipety serologiczne
62
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
9. Probówki wirówkowe o pojemności 15 ml
10. Probówki do zamrażania hodowli komórkowych
11. Jałowe końcówki do pipet
Wykonanie ćwiczenia
Uwaga! Wszystkie czynności należy wykonywać z zachowaniem warunków jałowych,
odpowiednich do pracy z hodowlami komórkowymi.
Pasażowanie adherentnej linii komórkowej
Przed przystąpieniem do pasażowania, należy przeprowadzić obserwację mikroskopową
hodowli komórkowej w celu sprawdzenia właściwego wzrostu hodowli oraz skontrolowania
prawidłowej morfologii komórek. W momencie, gdy hodowla wykazuje prawidłowy wzrost,
posiada określoną gęstość i nie jest zainfekowana przez drobnoustroje (wykluczenie
kontaminacji bakteryjnej i drożdżowej) można przystąpić do pasażowania. W tym celu
należy:
1. Usunąć pożywkę znad hodowli komórkowej za pomocą ssawki i jałowej pipety
pasterowskiej.
2. Przepłukać hodowlę 1 ml buforu PBS.
3. Nanieść na powierzchnię hodowli i dokładnie rozprowadzić 1 ml roztworu 0,25%
trypsyny z EDTA. Naczynie z hodowlÄ… inkubować w 37 ºC do momentu
enzymatycznego odklejenia się komórek (tzw. trypsynizacja). Stopień odklejenia się
komórek można monitorować pod mikroskopem.
4. Odklejone komórki (zaokrąglone i swobodnie pływające w pożywce) zebrać do
jałowej probówki wirówkowej, wykorzystując 3 ml hodowlanego podłoża
wzrostowego MEM i wirować 5 minut przy 1000 x g w 20 ºC.
5. Supernatant usunąć, komórki zawiesić w 3 ml podłoża wzrostowego MEM i wirować
jw.
6. Supernatant ponownie odrzucić, a pelet komórek ponownie zawiesić w medium
wzrostowym MEM i przenieść w równych ilościach na 3 płytki Petriego.
7. Do każdej płytki dodać po 9 ml świeżego podłoża wzrostowego MEM, a komórki
równomiernie rozprowadzić w naczyniu hodowlanym poprzez delikatne mieszanie.
o
8. Hodowle komórkowe inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 C w
atmosferze 5% CO2.
63
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
Po kilku, kilkunastu godzinach (w zależności od typu komórek) komórki zaczynają przyklejać
siÄ™ do powierzchni naczynia hodowlanego, a po kilku dniach tworzÄ… jednorodnÄ… warstwÄ™
komórek (tzw. z ang. monolayer). Wzrost komórek monitoruje się przy pomocy
odwróconego mikroskopu świetlnego.
Zamrażanie hodowli komórkowych
1. Komórki na trzech płytkach hodowlanych trypsynizować tj. opisano w ćw. 1.
2. Zwirowane po trypsynizacji komórki zawiesić w 1 ml podłoża wzrostowego MEM,
i policzyć w hemocytometrze wg instrukcji prowadzącego.
3. Ponownie zwirować komórki, odrzucić supernatant, a pelet zawiesić w 1 ml pożywki
do zamrażania.
4. Następnie zwirować komórki, zawiesić w pożywce do zamrażania, tak aby otrzymać
106-107 kom/ml.
5. Zawiesinę komórek rozpipetować po 0,5 ml do probówek do zamrażania i schładzać
w kolejnych etapach: 30 minut w 4ºC, przez noc w -80ºC, a nastÄ™pnie przenieść do
ciekłego azotu.
Rozmrażanie hodowli komórkowych
1. Wyciągnięte z ciekłego azotu komórki przenieść do łaz
ni wodnej o temperaturze
37 ºC, w jak najkrótszym czasie i rozmrażać przez Å‚agodne mieszanie.
2. Zaraz po rozmrożeniu, zawiesinę komórek przenieść kroplami do naczynia
hodowlanego z ogrzanym do temperatury pokojowej podłożem wzrostowym i
delikatnie wymieszać.
3. Hodowlę inkubować 24 godziny w temperaturze 37 oC, w atmosferze 5% CO2.
4. Podłoże hodowlane wymienić na świeże, celem pozbycia się DMSO i zapewnienia
hodowli optymalnych warunków do wzrostu.
Transfekcja
Badanie funkcji pojedynczych genów jest związane z klonowaniem odpowiedniej
sekwencji DNA, a następnie wprowadzeniem jej różnymi technikami do komórek, w których
może podlegać ekspresji. Wprowadzając do komórek DNA w postaci wektora plazmidowego
64
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
(konstruktu genetycznego) służącego ekspresji zawartych w nim genów kodujących
konkretne białka, można w tych komórkach uzyskać nadekspresję pożądanego genu, a w
konsekwencji natywne białko o modyfikacjach posttranslacyjnych typu ssaczego. Taki układ
eksperymentalny umożliwia przyżyciową analizę wielu procesów komórkowych w tym np.
monitorowanie regulacji transkrypcji genu, określenie subkomórkowej lokalizacji
eksprymowanego białka bądz
ustalanie interakcji między biomolekułami.
Celem ćwiczenia jest wprowadzenie do komórek ssaczych HeLa konstruktu
genetycznego kodującego białko hMrt4 w fuzji z markerem fluorescencyjnym DsRed
(DsRed-hMrt4) i analiza jego subkomórkowej lokalizacji w warunkach fizjologicznych oraz
w obecności aktynomycyny D i leptomycyny B. Ludzkie białko hMrt4 jest jednym z tzw.
czynników wspomagających proces biogenezy rybosomów. Aktynomycyna D to antybiotyk
peptydowy, który specyficznie wiąże się do DNA i hamuje proces transkrypcji. Jednym
z efektów jego działania na komórkę jest stres jąderkowy. Niskie dawki ActD (50 ng/ml)
selektywnie hamują tylko polimerazę RNA I, odpowiedzialną za transkrypcję genów dla 18S,
5,8S oraz 25/28S rRNA, podczas gdy wyższe jej stężenia hamują zarówno polimerazę RNA I,
jak również polimerazę RNA II i III, ale już w sposób niespecyficzny. Leptomycyna B, to
wysoce specyficzny inhibitor eksportyny Crm1, odgrywajÄ…cej kluczowÄ… rolÄ™ w eksporcie
jądrowym, a w szczególności w transporcie dojrzewających podjednostek rybosomalnych
z jÄ…dra do cytoplazmy. Aktynomycyna D hamuje zatem dojrzewanie podjednostek
rybosomalnych już na bardzo wczesnych etapach biogenezy, podczas gdy leptomycyna B
działa dużo póz
niej, dopiero na końcowym etapie jądrowego dojrzewania pre-rybosomów.
Materiały i odczynniki:
1. Linia komórkowa HeLa o odpowiedniej gęstości
2. Podłoże hodowlane MEM (MEM, 10% płodowa surowica bydlęca, 2 mM glutamina,
0,1 mM aminokwasy wzbogacajÄ…ce, antybiotyki: penicylina (100 U/ml)
i streptomycyna (100 źg/ml))
3. PBS
4. Odczynnik do transfekcji
5. 150 mM NaCl
6. Konstrukt genetyczny o znanym stężeniu DNA (np. pDsRedC2-hMrt4)
7. Aktynomycyna D (10 źg/ml w etanolu)
8. Leptomycyna B (2,5 źM w 70% metanolu)
9. PÅ‚ytki Petriego 35 x 10
65
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
10. Odpowiednio wytrawione, jałowe szkiełka nakrywkowe 18 x 18 mm
11. Jałowe probówki Eppendorfa
12. Jałowe końcówki do pipet
Wykonanie ćwiczenia:
Uwaga! Wszystkie czynności należy wykonywać z zachowaniem warunków jałowych,
odpowiednich do pracy z hodowlami komórkowymi.
Przygotowanie komórek do transfekcji
Postępować według procedury do pasażu hodowli komórkowych.
1. Strypsynizowane komórki zwirować, supernatant odrzucić, a pelet zawiesić w 1ml
podłoża wzrostowego MEM.
2. Policzyć komórki w hemocytometrze wg instrukcji prowadzacego.
3. Do 6-ciu płytek Petriego 35 x 10, pojedynczo przenieść jałowe, wcześniej wytrawione
szkiełka nakrywkowe i 2 ml podłoża wzrostowego. Szkiełka nakrywkowe dobrze
przycisnąć do płytki, żeby komórki mogły przykleić się tylko do górnej strony
szkiełka.
4. Do płytek z podłożem wprowadzić 5 x 104 komórek i delikatnie mieszając
równomiernie rozprowadzić w obrębie naczynia.
5. Hodowle komórkowe inkubować ok. 24 godzin w temperaturze 37 oC, w atmosferze
5% CO2, do momentu osiągnięcia 60%-70% konfluencji.
Transfekcja konstruktu genetycznego pDsRedC2-hMrt4
do komórek ssaczych HeLa
Dla pięciu płytek z hodowlą komórkową o odpowiedniej gęstości przygotować
kompleksy DNA : odczynnik do transfekcji i przeprowadzić transfekcję wg poniższej
procedury:
1. Do dwóch probówek Eppendorfa o pojemności 1,5 ml wprowadzić po 100 źl 150 mM
NaCl.
2. Do jednej z nich dodać 3 źg DNA (konstrukt genetyczny pDsRedC2-hMrt4) i
delikatnie wymieszać, stukając palcem w dno probówki.
3. Do drugiej probówki, bezpośrednio do roztworu NaCl, wprowadzić 6 ul odczynnika
do transfekcji i całość delikatnie wymieszać.
66
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
4. Roztwór zawierający odczynnik do transfekcji przenieść do probówki z roztworem
DNA i bardzo dokładnie wymieszać. W ten sposób powstaną kompleksy odczynnika
do transfekcji i DNA. Całość inkubować 15 minut w temperaturze pokojowej.
5. Mieszaninę po inkubacji dodawać do 24-godzinnej hodowli komórkowej kroplami.
6. HodowlÄ™ inkubować 24 godziny w 37 ºC, w atmosferze 5% CO2.
7. Subkomórkową lokalizację białka fuzyjnego obserwować w mikroskopie, po
wzbudzeniu fluorescencji białka DsRed falą o długości =588 nm.
Badanie wpływu aktynomycyny D i Leptomycyny B na subkomórkową
lokalizację białka fuzyjnego DsRed-hMrt4
1. 24 godziny po transfekcji komórek konstruktem genetycznym do hodowli rosnących
na płytkach od 1-5 dodać kolejno:
Płytka 1: aktynomycynę D: stężenie końcowe 50 ng/ml (określenie wpływu
ActD);
Płytka 2: leptomycynę B: stężenie końcowe 2,5 nM (określenie wpływu
LMB);
Płytka 3: rozpuszczalnik dla ActD, w objętości równej objętości dodanej
aktynomycyny (etanol, kontrola dla ActD);
Płytka 4: rozpuszczalnik dla LMB, w objętości równej objętości dodanej
leptomycyny B (metanol, kontrola dla LMB);
Płytka 5: nic nie dodawać (kontrola);
Płytka nr 6 stanowi kontrolę wzrostu tkanki w warunkach fizjologicznych bez obecności
jakichkolwiek efektorów.
2. Hodowle inkubować 24 godziny w 37 ºC, w atmosferze 5% CO2, a nastÄ™pnie
prowadzić mikroskopową obserwację subkomórkowej lokalizacji białek fuzyjnych
(wzbudzenie fluorescencji falą o długości =588 nm).
67
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
Interpretacja wyników:
1. Określić subkomórkową lokalizację białek fuzyjnych ulegających ekspresji w hodowli
komórek ssaczych HeLa, w warunkach fizjologicznych oraz w obecności inhibitorów
biogenezy rybosomów.
1. Wyjaśnić różnice między lokalizacją poszczególnych białek fuzyjnych w hodowlach
komórkowych prowadzonych w obecności ActD i LMB i w hodowlach bez dodatku tych
antybiotyków.
Wykorzystanie metod immunocytochemicznych
w diagnostyce nowotworów
Immunocytochemia (ICC, ang. immunocytochemistry) jest laboratoryjnÄ… technikÄ…
mikroskopowÄ… powszechnie wykorzystywanÄ… w badaniach podstawowych takich dziedzin
nauki jak np. biologia komórki czy biologia molekularna. Jednocześnie stanowi ona również
potężne narzędzie diagnostyczne stosowane szeroko w medycynie.
Zasada metody ICC polega na wykrywaniu in situ w komórce, tkance
(immunohistochemia, IHC) konkretnych antygenów (najczęściej są to białka, ale również
kwasy nukleinowe i polisacharydy) oraz definiowaniu ich subkomórkowej lokalizacji w
oparciu o zastosowanie przeciwciał specyficznie rozpoznających charakterystyczne dla
danego antygenu regiony określane jako epitopy. Wysoka specyficzność wiązania antygenu
przez przeciwciało jest determinowana unikalną strukturą epitopów danego antygenu
rozpoznawaną przez konkretne przeciwciało na zasadzie dopasowania przestrzennego.
Wizualizacja powstałych w komórce immunokompleksów (kompleksy przeciwciało-antygen)
jest możliwa dzięki znacznikom przyłączonym do przeciwciał. Generalnie wyróżnia się trzy
grupy znaczników:
1) enzymy (immunocytochemia właściwa), które przekształcają rozpuszczalny w
wodzie substrat w barwny i nierozpuszczalny w wodzie produkt np. peroksydaza chrzanowa
(HRP) czy alkaliczna fosfataza (AP) (Rys. 1),
68
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
Rys. 1 Analiza IHC chromograniny A pokazujÄ…ca rekcjÄ™ pozytywnÄ… w materiale pobranym z trzustki
(prawy panel) oraz reakcję negatywną w kontroli bez użycia przeciwciał anty-chromogranina A (lewy panel).
IHC pośrednia z wykorzystaniem pierwszorzędowych monoklonalnych przeciwciał anty-chromogranina A i
przeciwciał drugorzędowych wyznakowanych HRP (Fot. Thermo Scientific. Pierce Antibody Products).
2) fluorofory (immunocytofluorescencja IF) charakteryzujące się emisją światła o
innej długości fali niż światło wykorzystane do jego wzbudzenia np. FITC, barwniki z
rodziny Alexa Fluor, czy znaczniki nowej generacji tj. kropki kwantowe QDs (ang. qantum
dots) (Rys. 2) oraz
Rys. 2 Analiza ICC/IF białka HER2 pokazująca rekcję pozytywną w komórkach linii SK-BR-3 (prawy
panel) oraz reakcję negatywną w kontroli bez użycia przeciwciał anty-HER2 (lewy panel). ICC/IF pośrednia z
wykorzystaniem pierwszorzędowych monoklonalnych przeciwciał anty-HER2 i przeciwciał drugorzędowych
wyznakowanych fluoroforem DyLight 488. Jądra komórkowe wyznakowano barwnikiem DAPI. (Fot. Thermo
Scientific. Pierce Antibody Products).
3) białka zawierające metale ciężkie np. ferrytyna czy też same cząsteczki metali
ciężkich tj. np. koloidalne złoto w przypadku analiz ultrastrukturalnych w mikroskopii
elektronowej.
DetekcjÄ™ antygenu w analizowanym materiale przeprowadza siÄ™ stosujÄ…c obserwacje
mikroskopowe w określonym typie mikroskopu (świetlny, fluorescencyjny, konfokalny,
69
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
elektronowy), co warunkowane jest rodzajem znacznika przyłączonego do przeciwciała
specyficznie wiążącego badany antygen.
Wśród metod immunocytochemicznych wyróżnia się metody bezpośrednie i
pośrednie. Immunocytochemia bezpośrednia polega na detekcji analizowanego antygenu w
komórce za pomocą wyznakowanego przeciwciała pierwszorzędowego specyficznie
wykrywającego dany antygen. Ze względu na zwiększoną czułość częściej stosuje się jednak
nieco bardziej skomplikowaną i czasochłonną immunocytochemię pośrednią. W tym
przepadku przeciwciało pierwszorzędowe skierowane przeciwko analizowanemu antygenowi
jest niewyznakowane i dopiero zastosowanie wyznakowanego przeciwciała drugorzędowego
specyficznie rozpoznającego przeciwciało pierwszorzędowe umożliwia wizualizację reakcji
(schemat poniżej).
Ze względu na szeroki wachlarz możliwości jakie stwarzają metody immunocyto- i
histochemiczne z powodzeniem stosuje siÄ™ je w medycznych laboratoriach naukowych jak
również w diagnostyce klinicznej. Wykorzystuje się je m.in. do potwierdzenia infekcji
wirusowych (np. CMV, HBV, HCV), diagnostyki wrodzonych chorób genetycznych (tj. np.
dystrofie mięśniowe, choroby mitochondrialne) i chorób metabolicznych (np. miażdżyca).
Immunocytochemia odgrywa również bardzo ważną rolę w diagnostyce nowotworów.
Analizując obecność lub poziom ekspresji markerów nowotworowych możliwe jest wstępne
określenie typu nowotworu (np. antygen CA 125 - rak jajnika, PSA - rak gruczołu
krokowego, CEA - rak jelita grubego, ale również żołądka, płuc, S-100  czerniak, ale i
diagnostyka nowotworów pochodzenia nerwowego) i różnicowanie nowotworów (np.
antygen LCA w różnicowaniu raków i chłoniaków w nowotworach płuc), zdefiniowanie czy
nowotwór jest złośliwy czy łagodny (np. ekspresja E-kadheryny, kalretyniny), określenie
70
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
stadium rozwoju nowotworu, identyfikacja typu komórek w przerzutach i odnalezienie z
ródła
przerzutowania czyli nowotworu pierwotnego (identyfikacja białek filamentów pośrednich FP
tj. np. cytokeratyna, wimentyna, nestyna), jak również przewidywanie odpowiedzi na
zastosowaną terapię czyli identyfikacja markerów predykcyjnych (np. lek trastuzumab, nazwa
handlowa: Herceptin, jest skuteczny w leczeniu raka piersi z przerzutami jedynie przy
nadekspresji białka HER2) jak również markerów prognostycznych. IHC wykorzystuje się
również przy opracowywaniu leków do testowania ich skuteczności poprzez wykrywanie
aktywności lub zmian w poziomie ekspresji molekularnego celu leku w chorobowo
zmienionej komórce.
Jakkolwiek pojęcie immunohistochemia jest często stosowane zamienne z
immunocytochemią warto zdawać sobie sprawę z istniejących między nimi różnic. Zasada
obu metod jest taka sama natomiast różnice dotyczą pochodzenia i histologiczno-
cytologicznej charakterystyki analizowanej próbki (w przypadku ICH mamy do czynienia z
materiałem biopsyjnym, pobraną od pacjenta tkanką, natomiast ICC umożliwia analizę
komórek pochodzących z płynów ustrojowych lub laboratoryjnych hodowli komórkowych)
oraz odpowiedniego przygotowania próbek przed zastosowaniem przeciwciał.
Celem ćwiczenia jest praktyczne zapoznanie się z techniką immunocytochemii
pośredniej oraz z metodami różnicowego barwienia fluorescencyjnego składników komórek.
Materiały i odczynniki
1. Hodowla komórek nowotworowych i prawidłowych na szkiełkach nakrywkowych w
oddzielnych małych szalkach Petriego 35 x 10 mm, o gęstości komórek ok. 80% (dwie
szalki z komórkami jednego typu na zespół studentów)
2. Bufor PBS:
137 mM NaCl
2,7 mM KCl
10 mM Na2HPO4
2 mM KH2PO4, pH 7,5
3. 36,5-38% formaldehyd
4. Utrwalacz: 4% formaldehyd (przygotowywany na świeżo w buforze PBS)
5. Odczynnik do permeabilizacji: aceton schÅ‚odzony do temp. - 20° C
6. Bufor blokujÄ…cy I:
2% BSA w buforze PBS
71
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
7. Bufor blokujÄ…cy II:
6% BSA w buforze PBS
8. Surowica rozpoznająca ludzkie białko uL10
9. Roztwór króliczych przeciwciał pierwszorzędowych rozpoznających ludzkie białko
uL10, rozcieńczenie: 1:50 (przygotowywane na świeżo z surowicy w buforze
blokujÄ…cym I)
10. Roztwór przeciwciał drugorzędowych skoniugowanych z fluoroforem Alexa fluor
488, rozpoznajÄ…cych przeciwciaÅ‚a pierwszorzÄ™dowe, stężenie 1 µg/ml w buforze
blokujÄ…cym II
11. Barwnik fluorescencyjny Hoechst 33342, stężenie 2 µg/ml w H2O
12. Woda MiliQ
13. Roztwór do zatapiania komórek: komercyjny (Fluka), przed użyciem konieczne
ogrzanie w termobloku lub 20 % glicerol w H2O
14. Jałowe probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 i 2 ml i jałowe końcówki do pipet.
15. Jałowe probówki typu Falcon o poj. 15 ml
16. Pęsety
17. Małe szalki Petriego (35 x 10 mm) do hodowli komórkowych
18. Komory wilgotne (duże szalki Petriego 100 x 15 mm wyłożone bibułą filtracyjną
nasÄ…czonÄ… w wodzie destylowanej)
19. Szkiełka podstawowe do obserwacji mikroskopowych
20. Termoblok
Wykonanie ćwiczenia
Wszystkie etapy wykonywać w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.
Przy pracy z formaldehydem i barwnikiem Hoechst 33342 używać rękawiczek
ochronnych.
1. Usunąć pożywkę znad hodowli i przepłukać komórki 1 ml buforu PBS ogrzanym do
temp. 37° C.
2. Komórki w szalkach utrwalić na szkiełkach nakrywkowych za pomocą 1 ml 4%
roztworu formaldehydu, inkubować w utrwalaczu 10 min.
3. Po usunięciu 4% formaldehydu komórki przepłukać 3 x za pomocą 1 ml buforu PBS.
4. Usunąć bufor PBS i permeabilizować komórki przez 10 min. w 1 ml acetonu
schÅ‚odzonym do temp. -20° C (plastikowe szalki ulegnÄ… zmÄ™tnieniu).
5. Po usunięciu acetonu komórki przepłukać 3 x za pomocą 1 ml buforu PBS.
72
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
6. Szkiełka nakrywkowe z utrwalonymi i spermeabilizowanymi komórkami przenieść za
pomocą pęsety do nowych szalek Petriego.
7. Szalki z komórkami na szkiełkach umieścić w komorach wilgotnych.
8. Na komórki delikatnie nakroplić 50 - 100 µl roztworu przeciwciaÅ‚ pierwszorzÄ™dowych
(anty uL10) i inkubować prze 30 min. w zamkniętych komorach wilgotnych (próba
badana). W przypadku preparatów kontrolnych zamiast roztworu przeciwciał
pierwszorzędowych użyć buforu blokującego I (kontrola negatywna).
9. Usunąć roztwór przeciwciał i przepłukać komórki 3 x za pomocą 1 ml buforu PBS.
10. Na komórki delikatnie nakroplić 50 - 100 µl roztworu przeciwciaÅ‚ drugorzÄ™dowych
sprzęgniętych z markerem fluorescencyjnym Alexa fluor 488 i inkubować przez 30
min. w zamkniętych komorach wilgotnych.
11. Usunąć roztwór przeciwciał i przepłukać komórki 3 x za pomocą 1 ml buforu PBS.
12. Komórki przepłukać jednokrotnie wodą MiliQ (1 ml) i wybarwić jądra komórkowe
nanoszÄ…c na komórki 50-100 µl roztworu barwnika Hoechst 33342, inkubować 2 min.
13. Roztwór barwnika usunąć a komórki przepłukać buforem PBS.
14. Na szkieÅ‚ko podstawowe nanieść 10 µl roztworu do zatapiania komórek. Na powstaÅ‚ej
kropli umieścić szkiełko nakrywkowe z wybarwionymi komórkami tak, aby strona z
komórkami była zwrócona do roztworu.
15. Przygotowane preparaty oglądać w mikroskopie konfokalnym przy określonej
długości fali:
Alexa-Fluor 488:
światło wzbudzające: niebieskie (max 488 nm), emisja  światło zielone.
Hoechst 33324:
światło wzbudzające: UV (max 352 nm), emisja  światło niebieskie
16. Zdefiniować obszary komórki wyznakowane fluorescencyjnie i porównać profil
intensywności fluorescencji komórek nowotworowych i prawidłowych.
Interpretacja wyników
Ocena subkomórkowej lokalizacji analizowanego antygenu na podstawie obserwacji
mikroskopowych fluorescencyjnie wyznakowanych immunokompleksów. Porównanie
intensywności sygnału fluorescencyjnego dla komórek nowotworowych i prawidłowych.
Literatura:
1. Immunocytochemia, Zabel A. Wydawnictwo Naukowe PWN
73
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2013
74