1

Ćwiczenie 8

Podstawy diagnostyki ziarenkowców Gram-dodatnich

I. Część teoretyczna

Spośród tlenowych ziarniaków Gram-dodatnich, z klinicznego punktu widzenia, największe znaczenie mają

rodzaje: Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus. Rodzaj Micrococcus należy do drobnoustrojów

saprofitycznych. Jednakże ze względu na powszechne występowanie często izolowany jest ze środowiska

stanowi, a także może stanowić zanieczyszczenie materiału diagnostycznego.

Klasyfikacja rodzajów Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus i Micrococcus wg Bergey’s Manual of

Systematic Bacteriology z roku 2005 roku:

Typ BXIII. Firmicutes

Klasa III. Bacilli

Rząd I. Bacillales

Rząd II. Lactobacillales

Rodzina VIII. Staphylococcaceae

Rodzina IV. Enterococcaceae

- Rodzaj I. Staphylococcus

- Rodzaj I. Enterococcus

Rodzina VI. Streptococcaceae

-

Rodzaj I. Streptococcus

Typ BXIV Actinobacteria

Klasa I. Actinobacteria

Podklasa V. Actinobacteridae

Rząd I. Actinomycetales

Podrząd II. Micrococcineae

Rodzina I. Micrococcaceae

- Rodzaj I. Micrococcus

Rodzaj Staphylococcus

Do rodzaju Staphylococcus należy 41 gatunków lub podgatunków, które mogą być podzielone na dwie

podstawowe grupy tj.:

• gronkowce koagulazo-dodatnie: S. aureus, S. intermedius (jak dotąd chorobotwórczy tylko dla zwierząt, rzadko

spotykany u ludzi) i niektóre szczepy S. hyicus

• gronkowce koagulazo-ujemne

Najważniejszy i najbardziej wirulentny gatunek to S. aureus. Liczne zewnątrzkomórkowe substancje jakie

wytwarzają gronkowce złociste (hemolizyny, leukocydyna, koagulaza, stafylokinaza, hialuronidaza, nukleazy,

proteazy, lipazy, toksyna epidermolityczna, enterotoksyny, toksyna wstrząsu toksycznego, toksyna pirogenna) oraz

szereg składników ich powierzchni (białko A, otoczka, peptydoglikan, kwasy tejchojowe) są czynnikami różnorodnej

chorobotwórczości tych bakterii. Gronkowce nie posiadają jednego wyraźnie zdefiniowanego czynnika zjadliwości.

Za chorobotwórczość jest odpowiedzialny zespół cech.

Pierwotne infekcje wywoływane przez S.aureus to przede wszystkim choroby skóry takie jak czyraki, ropnie,

pęcherzyce, zespół oparzonej skóry, trądzik. Zakażenia wewnętrznych narządów i tkanek nie są powszechne,

jakkolwiek S. aureus może być przyczyną chorób układu oddechowego, zapalenia wsierdzia, zakażeń układu

moczowego, przewodu pokarmowego, zatruć pokarmowych, posocznicy i innych.

Stałą cechą S. aureus jest wytwarzanie koagulazy i ciepłostałej DNAzy, co jest wykorzystane w diagnostyce tych

drobnoustrojów.

Gronkowce koagulazo-ujemne (CNS - ang. Coagulase Negative Staphylocicci) stanowią komensalną i fizjologiczną

florę skóry i błon śluzowych człowieka. Są to drobnoustroje typowo oportunistyczne - mogą być przyczyna zakażeń

jeżeli mechanizmy obronne gospodarza ulegną osłabieniu lub gdy dostaną się do tkanek (uszkodzona skóra i

błony śluzowe mogą stanowić wrota zakażenia dla tych drobnoustrojów). Gatunkiem najczęściej izolowanym z

zakażeń jest S. epidermidis (zakażone zastawki sercowe, różne protezy, cewniki śródnaczyniowe i inne tzw.

biomateriały), może on być przyczyną zakażeń skóry i endocarditis., S. saprophyticus jest przyczyną infekcji dróg

moczowych (dominuje u młodych kobiet), S. haemolyticus, S. lugdunensis, S. schleiferi mogą wywoływać infekcje

zbliżone do infekcji wywoływanych przez S. epidermidis.

Diagnostyka Staphylococcus sp.

Podłoża:

• agar wzbogacony

• bulion wzbogacony

2

• podłoże agarowe z krwią (agar wzbogacony krwia baranią) - krwinki są hemolizowane przez α i β hemolizyny

(obserwacja hemolizy po 24h inkubacji); gronkowce tworzą kolonie białe, szare lub złocistopomarańczowe,

gładkie, okrągłe, wilgotne, kopulaste

• podłoże Chapmana z mannitolem i NaCl (wybiórczo-różnicujące); wysokie stężenie NaCl (7,5%) jest czynnikiem

wybiórczym, który hamuje wzrost większości Gram-ujemnych i Gram-dodatnich, oprócz gronkowców mogą na

tym podłożu wzrastać bakterie wykazujące tolerancję na NaCl takie jak Bacillus i Corynebacterium,

Micrococcus, Enterococcus, grzyby drożdżopodobne;

różnicująca właściwość tego podłoża jest wynikiem obecności mannitolu, niektóre gatunki gronkowców np. S.

aureus fermentują mannitol tworząc żółte kolonie otoczone żółtą obwódką, drobnoustroje nie fermentujące

mannitolu np. S epidermidis w większości przypadków są małe i otoczone czerwoną lub purpurową obwódką

• podłoże Baird-Parkera (wybiórczo-różnicujące) służy do namnażania szczepów Staphylococcus aureus

szczególnie izolowanych z produktów żywnościowych i leków. Jest bogate w składniki odżywcze : trzy peptony,

glicynę i pirogronian sodu, który pobudza wzrost szczepów zmienionych podczas produkcji żywności.

Wybiórczość podłoża w stosunku do Staphylococcus aureus zapewnia chlorek litu. Teluryn potasu (czynnik

różnicujący) ulega redukcji, powodując czarne zabarwienie kolonii. Obecność żółtka jaja kurzego pozwala

wykryć lipazę wytwarzaną przez niektóre szczepy Staphylococcus aureus, wokół nich pojawia się przejaśnienie

a niekiedy drobna precypitacja. Na tym podłożu mogą się rozwijać również drobnoustroje inne niż gronkowce

np. Enterococcus, Listeria, Proteus, Pseudomonas, grzyby drożdżopodobne, lecz żaden z tych drobnoustrojów

nie wytwarza jaśniejszej otoczki

Testy różnicujące gronkowce od innych ziarniaków Gram-dodatnich

• Test na wytwarzanie katalazy - dla odróżnienia od enterokoków, które są katalazo-ujemne.

∗ w podłożu płynnym do 5ml hodowli bulionowej dodajemy 1ml 3% H2O2. Szczepy katalazo (+) powodują

uwolnienie tlenu z H2O2 co objawia się burzeniem hodowli. Oznaczanie kontrolne polega na dodaniu H2O2

do niezaszczepionego podłoża.

∗ w podłożu stałym : nakropienie na kolonię 3% H2O2 . Kontrola - nakropienie samego podłoża (nie wykonuje

się na podłożach z krwią).

• Tolerancja tlenu - posiew na podłoża tlenowe i beztlenowe do odróżnienia od mikrokoków, które są wyłącznie

tlenowe

• Test na oznaczanie zdolności do wykorzystania cukrów z wytworzeniem kwasu w warunkach tlenowych i

beztlenowych - odczyn O-F (oxidation-fermentation test)

Wykorzystuje się w tym celu zmodyfikowane podłoże Hugh - Leifsona z glukozą [ inne niż przy Gram (-) ]. Do

dwóch probówek z podłożem posiewamy oczko hodowli aż do dna probówek. Jedną z probówek pokrywamy

następnie warstwą jałowej parafiny (w tym przypadku przed posiewem podłoże należy zregenerować ).

Inkubacja 5 dni, odczyt codziennie.

Jeśli cukier jest wykorzystywany z wytworzeniem kwasu - następuje zmiana zabarwienia z ciemno- fioletowego

na żółty. Brak zmiany zabarwienia świadczy o niewykorzystaniu cukru

Gronkowce cechują się beztlenowym rozkładem glukozy (zmiana zabarwienia podłoża na żółte w otwartej i

pokrytej parafiną probówce) w odróżnieniu od mikrokoków, które utleniają glukozę (zmiana zabarwienia podłoża

na żółte w „otwartej” probówce) lub są asacharolityczne (brak zmiany zabarwienia w obu probówkach).

• Oznaczenie wrażliwości na furazolidon - odróżnienie wrażliwych na furazolidon gronkowców od opornych

mikrokoków.

Test wykonuje się metodą dyfuzyjno-krążkową.. Zawiesinę drobnoustrojów o gęstości 0,5 wg skali MacFarlanda

posiewa się wymazówką na podłoże Mueller-Hintona (grubość 3,5 - 4 mm), nakłada się krążek wysycony

furazolidonem, preinkubacja w temp. pokojowej 15 min, inkubacja w 35-37oC 18-24h.

• Oznaczanie oksydazy cytochromowej. Oksydaza cytochromowa katalizuje w obecności tlenu utlenianie

zredukowanych cytochromów, występuje u drobnoustrojów bezwzględnie tlenowych np. Micrococcus sp.

Wykrywanie oksydazy cytochromowej oparte jest na zastosowaniu odczynników, które sa bezbarwne lecz po

utlenieniu staja się barwne.

Odczynniki: 1 - α-naftol (1% r-ór w C2H5OH 96 %), 2 - chlorowodorek p-aminodwumetyloaniliny (1% r-ór w

wodzie). Oznaczenie można wykonać dodając odczynniki do zawiesiny bakterii w wodzie lub poprzez

naniesienie bakterii z hodowli stałej na krążek bibuły wysycony odczynnikami. W obecności oksydazy z

dodawanych odczynników powstaje błękit indofenolu, co objawia się wystąpieniem intensywnie niebieskiego

zabarwienia w ciągu 30s - 2 min.

Testy różnicujące gronkowce wewnątrzrodzajowo

• Oznaczanie wytwarzania koagulazy - test ten służy do różnicowania S. aureus od innych gronkowców (poza S.

aureus koagulazę wytwarza kilka innych gatunków lecz występują one głównie u zwierząt).

Koagulaza jest to enzym, który ścina osocze. Występuje ona w dwóch formach. Pierwsza to koagulaza związana

clumping factor) - związana ze scianą komórkową, wykrywana jest testem szkiełkowym. Koagulaza związana

działa bezpośrednio na fibrynogen tworząc nierozpuszczalny skrzep fibryny (grudki). Druga forma to wolna

koagulaza, która jest wydzielana przez komórki i wykrywana jest w teście probówkowym. Koagulaza

zewnątrzkomórkowa reaguje z „coagulase-reacting factor (CRF) tworząc coagulase-CRF complex, substancje,

która jest klinicznie nie do odróżnienia od trombiny. Ten kompleks następnie działa na fibrynogen i powstaje nierozpuszczalny skrzep fibryny.

3

∗ Test szkiełkowy. Przeprowadza się z zastosowaniem osocza króliczego (odpowiednio przygotowane z

cytrynianem sodu lub preparat gotowy w formie liofilizowanej). Na szkiełku podstawowym umieścić obok

siebie dwie krople roztworu soli fizjologicznej, w obu kroplach zawiesić badane bakterie (gestość

homogennej zawiesiny powinna w przybliżeniu odpowiadać wyglądowi mleka - gęsta zawiesina). Do jednej

kropli dodać oczko ezy osocza i delikatnie wymieszać. W ciągu kilkunastu sekund powinny pojawic się

wyraźne kłaczki - wynik dodatni. Zawiesina bakterii bez dodanego osocza powinna pozostać homogenna.

Pojawienie się kłaczków w zawiesinie bez osocza świadczy o autoaglutynacji bakterii i nie może być

podstawą do przyjęcia wyniku ani dodatniego ani ujemnego.

∗ Test probówkowy. Stosuje się osocze królicze (odpowiednio przygotowane z cytrynianem sodu lub preparat

gotowy w formie liofilizowanej). Do 0,5 ml zawiesiny badanych gronkowców dodać 0,5 ml osocza. W

identyczny sposób przygotować kontrole ze szczepami koagulazo-ujemnym i koagulazo-dodatnim.

Inkubować w temp. 37oC. Wynik testu należy odczytywać po 1, 3 , 6, 24 h. Wynik dodatni - wyraźny skrzep.

∗ Slidex Staph Kit - zestaw do diagnostyki gronkowców in vitro (szybka identyfikacja S. aureus). Test ten jest

połączeniem testu lateksowego z testem hemaglutynacji i służy do wykrywania obecności czynnika zlepnego

(clumping factor), białka A i innych antygenów swoistych dla S. aureus.

Odczynniki: R1 - odczynnik przeciw S. aureus (anti S. aureus reagent), krwinki czerwone uczulone

fibrynogenem i lateks uczulony IgG (Anti-S. aureus, monoklonalna), mertiolat sodu, azydek sodu. Odczynnik

R2 - odczynnik kontrolny, nieuczulone krwinki czerwone i nieuczulony lateks, mertiolat sodu, azydek sodu.

Wymieszać odczynnik testowy R1 i kontrolny R2. Na czyste szkiełko podstawowe nanieść kroplę odczynnika

R1 i R2, do każdej kropli dodać po kilka kolonii bakterii, wymieszać każdą kroplę (ok. 10 s), poruszać

delikatnie ruchem kolistym (ok. 20 s). Wynik dodatni - aglutynacja w ciągu 30 s wykazujaca widoczny zlep

uczulonych krwinek czerwonych i/lub lateksu przy ujemnej kontroli (z odczynnikiem R2). Wynik ujemny -

jednorodna zawiesina zarówno w kropli z odczynnikiem R1 jak i z R2

• Oznaczenie wrażliwości na nowobiocynę. Badanie wykonuje się w celu odróżnienia gatunków CNS wrażliwych

na nowobiocynę (np.: S. epidermidis) od opornych na ten antybiotyk (np.; S. saprophyticus).

Badanie wykonuje się identycznie jak oznaczanie wrażliwości na furazolidon. Stosuje się krążki zawierające 5

µg nowobiocyny. Strefa zahamowania wzrostu o średnicy ≤ 16 mm wskazuje na drobnoustrój oporny na

nowobiocynę, natomiast większa niż 16 mm na wrażliwy.

• Oznaczanie DNAzy. Badanie przeprowadza się z użyciem podłóż zawierających kwas dezoksyrybonukleinowy

(DNA). Jeżeli drobnoustrój wytwarza DNAzę z obecnego w podłożu kwasu powstają oligonukleotydy.

Aktywności DNAzy może być wykrywana za pomoca kwasu solnego lub błękitu toluidyny lub zieleni metylowej.

W metodzie z HCl wykorzystuje się fakt, że DNA nie jest w nim rozpuszczalne, natomiast oligonukleotydy są

rozpuszczalne - hodowlę bakterii na podłożu z DNA zalewa się HCI, jeżeli DNA nie zostało rozłożone powstaje

opalizująca strefa precypitacji.; jeżeli DNA zostało rozłożone wokół kolonii widoczna jest strefa przejaśnienia. Z

kolei błęki toluidyny i zieleń metylowa są to barwniki metachromatyczne. Błękit toluidyny po połączeniu z DNA

tworzy niebieskie zabarwienie, jeżeli natomiast DNA zostało rozłożone powstaje różowe zabarwienie podłoża w

miejscu gdzie nastąpiła degradacja. Podobnie, w obecności DNA zieleń metylowa pozostaje zielona, natomiast

przy braku DNA zieleń zostaje uwolniona i jest bezbarwna.

Mikrotesty - systemy, zestawy

API STAPH jest biochemicznym systemem identyfikacji gronkowców i mikrokoków w oparciu o 19 testów

różnicujących (wytwarzanie kwasu z 14 węglowodanów, redukcja azotanów do azotynów, wytwarzanie fosfatazy

zasadowej, wytwarzanie acety-metylo-karbinolu, dihydrolaza argininy, ureaza). API STAPH składa się z pasków

zawierających odwodnione substraty testowe w pojedynczych probówkach. Substraty rozpuszcza się przez

dodanie do każdej mikrobrobówki zawiesiny testowanego szczepu. Następnie inkubuje się 18 h (w niektórych

przypadkach 48h) w temperaturze 30-37OC. Odczyt i interpretacja zgodnie z informacjami podanymi przez

producenta.

ATB - ID 32 STAPH jest systemem umożliwiającym identyfikację rodzajów Staphylococcus, Micrococcus,

Stomatococcus, Aerococcus składającym się ze standaryzowanych testów biochemicznych. Szereg biochemiczny

ID 32 STAPH składa się z 32 zagłębień, z których 26 służy do wykonywania testów, każde zagłębienie zawiera suche substraty. Po 24 h inkubacji zachodzące reakcje odczytuje się w automacie ATB lub wizualnie. Identyfikację

przeprowadza się przy pomocy tabeli identyfikacyjnej, Książki Kodów lub odpowiedniego oprogramowania.

Inne: RAPID ATB STAPH, System SCEPTOR G+, Staph-track, Minitek Gram-Positive System, Microscan G+

System, Vitek GPI card, Auto Microbic System.

Diagnostyka Streptococcus sp. i Enterococcus sp.

Drobnoustroje z rodzaju Streptococcus sp. i Enterococcus sp. należą do ziarniaków Gram-dodatnich, katalazo-ujemnych. Ziarniaki Gram-dodatnie katalazo-ujemne występują powszechnie w środowisku naturalnym

(gleba, woda, rośliny, powietrze), w produktach żywnościowych pochodzenia roślinnego i zwierzęcego. Mogą

kolonizować skórę i/lub błony śluzowe człowieka i uczestniczyć w zakażeniach z różną lokalizacją.

Rosną na podłożach stosowanych w diagnostyce laboratoryjnej. Należą do drobnoustrojów mezofilnych, optymalna

temperatura wzrostu - 30 - 44oC. Rosną w obecności tlenu, w warunkach mikroaerofilnych , jak i beztlenowych. Nie

4

wytwarzają przetrwalników, wiele jest opornych na wysychanie i przeżywają w powietrzu, glebie i innych

składnikach środowiska.

W preparatach barwionych układaja się w dwoinki, tetrady, łańcuszki, mogą występować także pojedyńczo lub

tworzyć nieregularne skupiska.

Do ziarniaków Gram-dodatnich katalazo-ujemnych należą m.inn. następujące rodzaje:

• Streptococcus - mikroflora górnych dróg oddechowych; duże znaczenie kliniczne

• Enterococcus - mikroflora przewodu pokarmowego; duże znaczenie kliniczne

• Gemella - mikroflora górnych dróg oddechowych; rzadko izolowane z materiałów klinicznych

• Aerococcus - środowisko naturalne, produkty zwierzęce; rzadko izolowane z materiałów klinicznych

• Leuconostoc - środowisko naturalne, znaczenie w przemyśle mleczarskim, przy produkcji marynat, win; rzadko

izolowane z materiałów klinicznych

• Pediococcus - środowisko naturalne, wykorzystywane w przemyśle browarniczym i spożywczym (piwo, wino,

sery, kiełbasy, produkty warzywne); bakterie kwasu mlekowego; rzadko izolowane z materiałów klinicznych

• Lactococcus - występują w żywności, przewodzie pokarmowym u ludzi, wykorzystywane w przemyśle

spożywczym; bakterie kwasu mlekowego; rzadko izolowane z materiałów klinicznych

Drobnoustroje te charakteryzują się zróżnicowaną wrażliwością na antybiotyki. Wszystkie są naturalnie oporne

na amidynopenicyliny, monobaktamy i stare chinolony. Bakterie z rodzaju Streptococcus są naturalnie oporne na

aminoglikozydy, z rodzaju Enterococcus są naturalnie oporne na aminoglikozydy, penicyliny, cefalosporyny, polimyksyny, linkozamidy. Pediococcus i Leuconostoc wykazują naturalną oporność wysokiego stopnia na wankomycynę.Naturalna zmniejszona wrażliwość na penicyliny występuje wśród ziarniaków z rodzajów

Lactococcus, Leuconostoc i Aerococcus.

W diagnostyce Gram-dodatnich ziarniaków, katalazo-ujemnych wykorzystuje się następujące cychy:

• zdolność do wytwarzania hemolizy na podłożu agarowym z dodatkiem 5% krwi baraniej; hemoliza beta -

całkowita - całkowity rozkład krwinek czerwonych, strefa hemolozy wyraźnie odgraniczona od reszty

niezhemolizowanego podłoża, wielkośc strefy często przekracza parokrotnie średnicę kolonii, alfa - częściowa -

częściowe rozpuszczenie krwinek, zazielenienie podłoża, niewielka przejrzystość, wielkość strefy hemolizy alfa

jest zwykle mniejsza niż hemolizy beta, gamma - brak hemolizy

• wzrost w 45oC

• wzrost w bulionie z 6,5% NaCl

• wzrost w bulionie o pH 9,6

• hydroliza L-pirrolidonyl - beta- naftylamidu przez aminopeptydazę pyrolidonylową (PYR) w wyniku czego

powstaje naftylamid czerwonego koloru po dodaniu 0,01% odczynnika cinnamaldehydu

• hydroliza eskuliny - w wyniku rozkładu powstaje dekstroza i eskuletina, która reaguje z cytrynianem żelaza dając brązowo-brunatny produkt

• rozpuszczalność w żółci (identyfikacja S. pneumoniae) - sole żółci uczynniają enzymy autolityczne poprzez działanie na powierzchnię komórki w wyniku czego następuje liza komórki

• zdolność wzrostu w obecności żółci

• test CAMP (identyfikacja Streptococcus gr. B) - czynnik CAMP (Co-cytolizyna B) jest ciepłostałą wydzielaną zewnątrzkomórkowo proteiną, która działa synergistycznie z toksyną beta gronkowców. Po posiewie na podłożu

z krwią S. agalactiae i prostopadle do niego S. aureus wytwarzającego beta-hemolizynę wystąpi charakterystyczny trójkąt hemolizy

• wrażliwość na bacytracynę (identyfikacja S. pyogenes) - krążeë wysycony bacytracyną (substancja o działaniu

przeciwdrobnoustrojowym produkowana przez bakterie Gram-dodatnie) w stężeniu 0,04 j

• wrażliwość na optochinę (identyfikacją S. pneumoniae) - krążek wysycony optochiną w stężeniu 5 ug

• obecność antygenu grupowego (wielocukru C) - po ekstrakcji enzymatycznej antygeny polisacharydowe

znajdujące się w ścianie komórkowej paciorkowca uwidaczniają się w reakcji aglutynacji cząsteczek lateksu

uczulonych swoistymi, grupowymi immunoglobulinami króliczymi

Rodzaj Sreptococcus

Rodzaj Streptococcus skupia liczne gatunki charakteryzujące się odmiennymi właściwościami fenotypowymi i genotypowymi oraz różną chorobotwórczością.

Według ostatniej klasyfikacji dzielony jest na sześć grup filogenetycznych (I-VI) na podstawie różnic w sekwencji

podjednostki 16S rRNA.

Na przestrzeni lat wprowadzano różne schematy klasyfikacyjne streptokoków.

I - podział uwzględniający typy hemolizy na podłożu agarowym z 5% krwią baranią:

• paciorkowce beta-hemolizujące - wytwarzające hemolizyny, które całkowicie rozkładają krwini czerwone

• paciorkowce alfa-hemolizujące - wytwarzające hemolizyny, które częściowo rozkładają krwini czerwone

• paciorkowce niehemolizujące (gamma-hemolizujące) - nie wytwarzające hemolizyn

II - Klasyczny podział na grupy serologiczne wg Rebeki Lancefield (1933)

Podział ten uwzględnia różnice węglowodanów (immunologicznie czynny wielocukier C) wchodzących w skład

ściany komórkowej. Grupy serologiczne oznaczone są dużymi literami alfabetu od A do W. Jest szczególnie

przydatny dla klasyfikacji paciorkowców beta-hemolizujących.

III - Podział praktyczny

♦ paciorkowce ropotwórcze

5

• Grupa A - Streptococcus pyogenes. Na podłożu z krwią wywołują hemolizę typu beta

• Grupa B - Streptococcus agalactiae. Na podłożu z krwią wywołują hemolizę typu beta, mogą też

występować szczepy o typie hemolizy alfa lub gamma

• Grupa C - S. equi ssp. equi (hemoliza beta ), S. equi ssp zooepidermicus (hemoliza beta), S. equisimilis (hemoliza beta). S. dysgalactiae (hemoliza alfa).

• Streptococcus pneumoniae (hemoliza alfa). Szczepy tego rodzaju nie maja antygenu grupowego

(wielocukru C)

♦ paciorkowce jamy ustnej (do niedawna nazywane „grupa viridans” - zieleniące)

• Grupa S. mutans (hemoliza gamma)

• Grupa S. salivarius (hemoliza gamma)

• Streptococcus bovis (hemoliza gamma; grupa serologiczna D)

• Grupa S. milleri (lub S. anginosus); (hemoliza gamma, alfa, beta; grupa serologiczna A, C, F, G)

• Grupa S. sanguis (lub S. oralis); (hemoliza alfa; grupa serologiczna H, W)

• Streptococcus mitis (hemoliza alfa; grupa serologiczna O - biotyp 1 oraz K - biotyp 2)

• inne - S. acidominimus, S. uberis

♦ paciorkowce wybredne (wymagają do wzrostu witaminy B6 lub innych związków np.: L-cysteiny, glutationu,

tioglikolanu) - S. defektivus, S. adjacens

Podłoża

Paciorkowce należą do drobnoustrojów wybrednych. Rosną słabo lub nie rosną na podłożach zwykłych. Rosną

dobrze na podłożach wzbogaconych takich jak: podłoże tryptozowo sojowe (TSA), wyciąg mózgowo sercowy

(BHI), bulion Todd-Hewitt’a, Columbia agar/bulion z dodatkim krwi lub surowicy, agar wzbogacony z dodatkiem krwi, bulion cukrowy.

Podłoża wybiórcze

• agar z krwią i z fioletem krystalicznym; fiolet krystaliczny powoduje zahamowanie wzrostu innych niż

paciorkowce drobnoustrojów

• podłoża wybiórcze dla S. pyogenes - z dodatkiem neomycyny, trimetoprimu i sulfametoksazolu (STX), kolistyny

- dodanie antybiotyków hamuje wzrost innych niż S. pyogenes drobnoustrojów występujących w górnych

drogach oddechowych

Charakterystyka

Paciorkowce to Gram-dodatnie bakterie kształtu kulistego lub owalnego, w preparacie układaja się w pary lub tworzą łańcuszki. Nie wytwarzają przetrwalników i poza nielicznymi wyjątkami nie wykazują ruchu. Fermentują

glukozę do kwasu mlekowego. Są tlenowcami lub wzglednymi beztlenowcami. Na podłożu agarowym z krwią

tworzą kolonie małe (0,5 - 1 mm), najczęściej wypukłe, gładkie, błyszczące, matowe lub śluzowe, często otoczone

strefą hemolizy. Jednakże morfologia kolonii paciorkowców jest różnorodna. S. pyogenes tworzy kolonie małe, przeźroczyste, otoczone relatywnie dużą strefą beta-hemolizy. Kolonie S. agalactiae są większe, bardziej płaskie, kremowe, śluzowe i otoczone mniejszą strefą hemolizy, często możliwą do zaobserwowania po usunięciu kolonii.

Kolonie S. pneumoniae są początkowo wypukłe, starsze kolonie mają wklęsły środek powstający na skutek działania enzymów autolitycznych, strefa hemolizy alfa przybiera zabarwienie brązowo-zielone. Paciorkowce grupy

„viridans” tworzą kolonie małe, opalizujące, otoczone wyraźną strefą hemolizy alfa o zabarwieniu zielonym.

Diagnostyka paciorkowców oparta jest na ustaleniu typu hemolizy. Identyfikacja paciorkowców beta-

hemolizujących polega na przeprowadzeniu testów serologicznych i klasyfikacji do grup A, B, C, D, F, G.

Paciorkowce alfa lub gamma-hemolizujące identyfikuje się surowicami anty D i anty B. W celu dalszej identyfikacji

przeprowadza się testy fizjologiczne i biochemiczne. Najczęściej wykonywane testy przedstawiono w poniższych

tabelach.

W diagnostyce paciorkowców wykorzystywane są również zestawy komercyjne oparte na testach biochemicznych

np.: test API 20S (test 24 godzinny), Rapid STR (test 4 godzinny).

Do wykazania obecności paciorkowców (ich antygenów) bezpośrednio w materiale badanym wykorzystuje się

lateksowe testy aglutynacyjne ( S. pyogenes, S. agalactiae, Grupa C paciorkowców, S. pneumoniae), test koaglutynacji ( S. pyogenes) oraz testy immunoenzymatyczne ( S. pyogenes, S. agalactiae).

Różnicowanie paciorkowców beta-hemolizujących

Drobnoustrój

Wrażliwość na

Wrażliwość

Antygen

Test CAMP

PYR

bacytracynę

na STX

grupowy

S. pyogenes

wrażliwy

oporny

A

-

+

S. agalactiae

oporny

oporny

B

+

-

Różnicowanie S. pneumoniae i grupy „viridans”

Drobnoustrój

Wrażliwość na optochinę

Rozpuszczalność w żółci

S. pneumoniae

wrażliwy

+

Grupa „viridans”

oporne

-

6

Rodzaj Enterococcus

Do lat osiemdziesiątych enterokoki zaliczano do grupy D paciorkowców. Inne paciorkowce należące do grupy D

określano jako „nonenterococci” ( S. bovis, S. equinus). Przyczyną podziału paciorkowców grupy D na dwie kategorie była przede wszystkim ich różnica we wrażliwości na antybiotyki betalaktamowe (enterokoki wykazują wyższe wartości MIC). W połowie lat osiemdziesiątych na podstawie badań genetycznych utworzono nowy rodzaj

Enterococcus.

Aktualnie do rodzaju Enterococcus należy ponad 20 gatunków, z których u ludzi wykazano co najmniej 10.

Najczęściej izolowanym gatunkiem jest E. faecalis (>95% izolatów), drugim co do częstości występowania jest E.

faecium. Do rzadko izolowanych od ludzi należą następujące gatunki: E. avium, E. durans, E. gallinarum, E. hirae, E. raffinosus, E. casseliflavus, E. flavescens, E. dispar.

Charakterystyka

Do rodzaju Enterococcus należą ziarniaki Gram-dodatnie, katalazo-ujemne. W preparatach barwionych komórki układają się w pary lub łańcuszki. Są względnymi beztlenowcami. Rosną na podłożach zwykłych. Na podłożu

agarowym z krwią powoduję hemolizę alfa, niektóre szczepy mogą wytwarzać hemolizę gamma lub beta.

Wywołują one u ludzi zakażenia przewodu moczowego, szczególnie dotyczy to pacjentów hospitalizowanych,

zakażenia ran i tkanek miękkich, zakażenia wewnątrzbrzuszne, zakażenia w obrębie miednicy, zapalenie

wsierdzia, opon mózgowo-rdzeniowych, zakażenia wszczepów i protez.

Podłoża

Do hodowli drobnoustrojów z rodzaju Enterococcus stosowane są podłoża:

• agar wzbogacony z dodatkiem 5% krwi baraniej

• podłoże tryptozowo sojowe

• wyciąg mózgowo sercowy

• D-Coccosel agar - podłoże wybiórcze dla mikroorganizmów rosnących w obecności żółci (czynnik wybiórczy).

Na tym podłożu może rosnąć większość pałeczek Gram-ujemnych, Staphylococcus sp, grupa D Streptococcus i

Enterococcus sp. lecz jedynie grupa D Streptococcus i Enterococcus sp hydrolizują eskulinę (czynnik

różnicujący) do eskuletiny, która reaguje z zawartym w podłożu cytrynianem żelazowo-amonowym dając

brązowo-czarny produkt

Identyfikacja enterokoków do rodzaju uwzględnia następujące cechy:

• wygląd kolonii i rodzaj hemolizy na podłożu agarowym z krwią baranią

• wygląd drobnoustrojów w preparacie barwionym metodą Grama

• wytwarzanie katalazy

• wzrost w bulionie z 6,5% NaCl

• wzrost w podłożu płynnym o pH 9,6

• wzrost w 45oC

• wzrost na podłożu z żółcią

• hydroliza eskuliny

• hydroliza L-pyrrolidonyl-beta-naftylamidu (PYR)

• przynależność do grupy serelogicznej D

W celu identyfikacji enterokoków do gatunku wykorzystuje się następujące cechy:

• fermentacja cukrów i alkoholi (mannitol, sorbitol, sorboza, arabinoza, rafinoza, sacharoza, laktoza)

• hydroliza argininy

• tolerancja tellurynu potasu (0,04% w podłożu stałym)

• wykorzystanie pirogronianu

• ruch

• wytwarzanie barwnika

• wzrost w 10oC

Do identyfikacji bakterii z rodzaju Enterococcus stosowane są biochemiczne testy komercyjne wykorzystywane w

diagnostyce paciorkowców.

Różnicowanie Enterococcus spp. i paciorkowców grupy D

Testy

Enterococcus spp.

Paciorkowce grupy D

Wzrost w bulionie z 6,5% NaCl

+

-

Wzrost w podłożu płynnym o pH 9,6

+

-

Hydroliza eskuliny

+

+

Wzrost na podłożu z żółcią

+

+

Hydroliza L-pyrrolidonyl-beta-naftylamidu (PYR)

+

-

Antygen grupowy

D

D

Typ hemolizy

alfa, beta, gamma

alfa, gamma

7

II. Część praktyczna

1. Test na wytwarzanie katalazy

Test ten pozwala na odróżnienie drobnoustrojów z rodzajów Staphylococcus i Micrococcus od Streptococcus sp. i Enterococcus sp.. Stosowany w teście nadtlenek wodoru (3% H2O2) jest rozkładany przez katalazę do wody i tlenu, co objawia się powstawaniem pęcherzyków powietrza.

Uwaga! Nie przeprowadza się tego testu na podłożach z krwią (krwinki zawierają katalazę)

Nanieś na hodowle drobnoustrojów kroplę . Wynik testu wpisz do tabeli

Drobnoustrój

Staphylococcus sp.

Micrococcus sp.

Enterococcus sp.

Streptococcus sp.

Wynik

„+” - rozkład H2O2

„-” - brak rozkładu H2O2

2. Wrażliwość na furazolidon

Wrażliwość / oporność na niektóre substancje wykazujące działanie przeciwdrobnoustrojowe jest szeroko

wykorzystywana w diagnostyce. W teście tym odróżniamy gronkowce od mikrokoków. Stosuje się krążki bibułowe

wysycone furazolidonem (100µg).

Odczytaj wynik badania wrażliwości na furazolidon. Wynik testu wpisz do tabeli

S. aureus

S. epidermidis

M. luteus

Wynik

W - wrażliwość, O - oporność

3. Test utlenianie-fermentacja glukozy (OF - oxidation-fermentation)

Do różnicowania drobnoustrojów wykorzystuje się ich wybrane cechy metaboliczne. W identyfikacji wielu z nich, także i gronkowców, określa się zdolność do fermentacji glukozy

W teście tym odróżniamy gronkowce (fermentacja) od mikrokoków (utlenianie lub brak reakcji).

Odczytaj wynik badania i wpisz do tabeli

Podłoże

Interpretacja

pokryte parafiną

bez parafiny

S. aureus

M. luteus

„+” - zmiana barwy z fioletowej na żółtą;

„-” - brak zmiany barwy

4. Slidex Staph Kit

Jest to test służący do szybkiej identyfikacji S. aureus. Pozwala on na wykrycie obecności clumping factor (koagulazy związanej), białka A i innych antygenów swoistych dla S. aureus

Wykonaj test wg instrukcji. Wynik wpisz do tabeli

S. aureus

S. epidermidis

Wynik

„+” - aglutynacja;

„-” - zawiesina jednorodna

5. Wykrywanie koagulazy wolnej

Do wykrywania wolnej koagulazy wytwarzanej przez S. aureus stosowany jest test probówkowy

Odczytaj wynik testu i wpisz do tabeli

S. aureus

S. epidermidis

Wynik

„+” - skrzep;

„-” - zawiesina jednorodna

8

6. Różnicowanie paciorkowców - typy hemolizy

W diagnostyce wielu drobnoustrojów, przede wszystkim paciorkowców wykorzystuje się ich zdolność do

hemolizowania krwinek czerwonych

Obejrzyj hodowle paciorkowców i enterokoków na agarze krwawym.

Wpisz do tabeli jaki typ hemolizy jest charakterystyczny dla poszczególnych bakterii.

Typy hemolizy

α - częściowa

β - całkowita

γ - brak hemolizy

7. Wrażliwość na optochinę i bacytracynę

Podobnie jak w przypadku gronkowców, także i w diagnostyce paciorkowców wykorzystywana jest wrażliwość tych

drobnoustrojów na niektóre substancje wykazujące działanie przeciwdrobnoustrojowe. Do identyfikacji

paciorkowców α-hemolizujących stosuje się optochinę (5µg), natomiast β-hemolizujących bacytracynę (0,04j.).

Odczytaj testy wrażliwości na optochinę i bacytracynę, wyniki wpisz do tabeli drobnoustroje oporne i wrażliwe na

te substancje.

Optochina

Bacytracyna

Wrażliwość

Oporność

Wrażliwość

Oporność

8. Różnicowanie Enterococcus sp.

Zdolność enterokoków do wzrostu w niekorzystnych warunkach wykorzystuje się w różnicowaniu tych bakterii od

innych ziarniaków Gram-dodatnich katalazo-ujemnych.

Oceń wzrost enterokoków i paciorkowców w hodowlach w bulionie z 6,5% NaCl, o pH 9,6 oraz wzrost w

temperaturze 45oC. Wyniki wpisz do tabeli

Bulion z 6,5% NaCl

Bulion o pH 9,6

Wzrost w temp. 45oC

Enterococcus faecalis

Streptococcus pyogenes

„+” - wzrost

„-” - brak wzrostu