streszczenie

Różne parametry normy metodą szokową CaCl2/heat w sprawie przekształcenia

Escherichia coli szczepu DH5α-T1R z plazmidu pUC19 zostały zoptymalizowane. z

czterech różnych temperaturach, szok termiczny (32 ° C, 37 ° C, 42 ° C i 47 ° C)

badanych, 42 ° C leczenie wystawione maksymalną wydajność transformacji

objawione przez oporne na ampicylinę kolonie znajdujące się na LB Agar ampicylina

płyty. Z pięciu razy różnych szoku cieplnego ekspozycji, impuls 30 sekund

czas trwania w połączeniu z 42 ° C ciepła temperatura szok wystawione maksymalnie

wydajności. Stwierdzono, że chociaż transformacja komórek traktowanych CaCl2

Dzieje się tak nawet przed rozpoczęciem leczenia szoku termicznego, wydajność była około 15 razy większa

po szoku termicznego. Kiedy komórki dalej inkubowano na lodzie (po ciepło

wstrząs) przez 10 min, wydajność transformacji wzrosła o 24 razy

w porównaniu do braku szoku cieplnego i 1,6-krotnie w porównaniu do leczenia szoku

termicznego.

Nie było marginalny spadek transformacji, gdy komórki inkubowano w

temperaturze pokojowej zamiast lodu po szoku termicznego. Wyniki te sugerują, że

impuls szoku cieplnego 30 sek w 42 ° C, a następnie 10 min lodu etapie inkubacji

są idealne parametry w celu uzyskania maksymalnej wydajności przetwarzania w DH5α -

Szczep T1R. Wyniki sugerują również, że ciepło po szoku zimna etapie inkubacji jest

także ważnym czynnikiem i poprawia transformacji E. coli znacznie.

wprowadzenie

Możliwość wprowadzenia plazmidu cząsteczek DNA w komórkach została centralnego

znaczenie dla rozwoju biologii molekularnej. Kilka metod, które zostały opisane w literaturze do wprowadzenia plazmidu DNA do komórek. te metody

obejmują obróbkę chemiczną (1, 2), elektroporacji (3, 4), korzystanie z biolistic pistolet (5), glikol polietylenowy (6), USG (7), kuchenka mikrofalowa (8) i hydrożelu (9). Jednakże,

metody chemiczne osiągnęły wiele uwagi w większości laboratoriów, z powodu

ich dostępności i efektywności kosztowej.Stan fizjologiczny komórek, która umożliwia

ich wiązania i podjęcia dużej masie cząsteczkowej, egzogenny DNA nazywa

"Kompetencje". Wychwyt wolnego DNA przez komórki Escherichia coli, które stały się

przez właściwe leczenie chemiczne dostarczanie jonów Ca2 + po szoku cieplnego

impuls po raz pierwszy zgłoszone przez Mandel i Higa (10). Później, kilka

modyfikacje tej metody stały się dostępne do transformacji E. coli z

plazmidu DNA (1, 11-13).

Wśród wielu badanych kationów (Ca2 +, Mn2 +, Sr2 +, Ba2 +, Mg2 +,

Na + i Rb +), Ca2 + (100-200 mm Zakres) pod warunkiem, stosunkowo lepiej

transformacji E. coli (14). Fizjologiczne optymalnych warunków transformacji,

jednak różnić w zależności od szczepu do szczepu, ich tło genetyczne i typ

transformacji DNA (14). Transformacja częstotliwości uzyskanych za pomocą tych metod

zakresie około 105-107 transformantów / ug DNA.Częstotliwości są nadal

około dziesięciokrotnie niższe, gdy ligacji DNA mieszaniny reakcyjnej jest używany jako wejście DNA,

powoduje obniżenie rekombinowanych klonów na talerzu. Chociaż do klonowania i sub-

klonowanie

celów wysokiej wydajności transformacji nie jest krytyczna, takich jak

Budowa biblioteki genomowe i cDNA wymagają bardzo wysokiej wydajności

transformacji, aby mieć odpowiednią reprezentację sekwencji niskiej liczbie kopii.

Jest zatem ważne, aby zoptymalizować i poprawić częstotliwość transformacji

żądany szczep gospodarza w celu osiągnięcia klonowania niskiej liczbie kopii cząsteczek DNA.

Materiał i metody:

Szczepów bakteryjnych, pożywki i plazmidu DNA używane

Escherichia coli szczepu DH5α-T1R (genotyp: F-Φ80lacZΔM15 Δ (lacZYAargF)

U169 recA1 endA1 hsdR17 (rk

-, Mk

+) PhoA supE44 thi-1 gyrA96 relA1 tona)

był stosowany w tym badaniu (Invitrogen Inc.) Luria-Bertani (LB) medium (Sigma Aldrich

Inc) została rutynowo stosowane do kultury E. coli. Do tworzenia płyt średniej był zestalony

z 1,6% agaru. Antybiotyk płyty do selekcji transformantów zawarte na ampicylinę

(Sigma Aldrich Inc) w końcowym stężeniu 100 mg / ml. Super pUC19 zwinięte

plazmidu DNA (2686bp długo) był używany jako DNA transformacji.

Procedura transformacji

CaCl2 traktowane 50μl porcje komórek kompetentnych przechowywano w temperaturze -80 ° C

rozmrożono na lodzie

przez 30 min. Pięć uL z pUC19 plazmid zawierający łącznie 50pg DNA bezpośrednio

pipety na właściwe komórki. Komórki te delikatnie wymieszać naciskając 4-5 razy,

inkubowano na lodzie przez 30 min, po którym nastąpiło leczenie szoku termicznego. po

leczenie komórki rutynowo inkubowano w lodzie przez 2 min następnie dodano

250 uL SOC mediów do każdej fiolki. Fiolki w końcu w temperaturze 37 ° C przez 1 godzinę w

225 obrotów na minutę w inkubatorze trzęsie. Hodowle właściwie rozcieńczonego w LB

średnich i 50-100μl każdej kultury wysiano w trzech egzemplarzach na ampicylinę zawierające

mediów płyt. Te płytki inkubowano w temperaturze 37 ° C przez noc i

wynikające kolonie transformanta oceniano i analizowano.

Obliczanie sprawności przemiany

Sprawności przemiany (transformantów / DNA mg) została obliczona w następujący sposób:

Wyniki i dyskusja

Wpływ czasu trwania leczenia szoku cieplnego na plazmidu transformacji

Literatura pokazuje różne czasy obróbki cieplnej prądem w zakresie od 30 s do 2 min

w celu uzyskania transformacji E. coli. Nie ma spójnego sprawozdania, jak dużo ciepła

szok wyniki czasie w maksymalnej wydajności transformacji. W celu określenia optymalnej

czas leczenia szoku cieplnego dla DH5α-T1R komórkach, CaCl2 traktowanych komórek tego

szczepu

inkubowano w temperaturze 42 ° C w łaźni wodnej do pięciu różnych punktach czasowych tj. 1, 30, 60, 90

i 120 sekund, indywidualnie.Sprawności przemiany (x108) obserwowano po

tych zabiegów było 1,21 ± 0,23; 2,98 ± 0,16; 2,62 ± 0,22; 1,92 ± 0,23 i 0,96 ± 0,17 do

1, 30, 60, 90 i 120 sekund, odpowiednio (rys.1). Wyniki te wskazują, że 30

czas trwania sekundy jest optymalne dla uzyskania maksymalnej wydajności transformacji

DH5α-T1R szczep z pUC19 plazmidu DNA. Już ciepło zabiegi prądem

znacząco zmniejsza wydajność transformacji. Wiadomo, że żywotność komórek

zmniejsza się z dłuższej ekspozycji na wysokie temperatury i być może mogłoby to mieć

przyczyniły się do ograniczenia w wydajności transformacji obserwowane.

Rysunek 1: Wpływ szoku czas inkubacji ciepło na przemian: Komórki

leczonych z powodu różnych razy w 42 ° C. Dane stanowią średnie ± SD trzech powtórzeń. każdy

leczenia wysiano w trzech egzemplarzach.

Wpływ temperatury szoku termicznego w transformacji:

Czterech różnych temperaturach, tj. 32 ° C, 37 ° C, 42 ° C i 47 ° C było przetestowane w celu

ustalenia

Optymalna temperatura powoduje wyższą wydajność transformacji E. coli

DH5α.Określonym czasie inkubacji 30 sekund był używany do każdego zabiegu. jak pokazano

na rysunku. 2, obserwowaliśmy sprawności przemiany (x108) z 2,07 ± 0,08, 2,4 ± 0,13,

3,31 ± 0,44 i 1,32 ± 0,17 do 32 ° C, 37 ° C, 42 ° C i 47 ° C zabiegi szoku cieplnego,

odpowiednio. Wyniki te wskazują, że temperatura 42 ° C jest optymalna do uzyskania

Maksymalna transformacji CaCl2 traktowane E. coli DH5α komórek. transformacja

wydajność jest znacznie zmniejszony w podwyższonej temperaturze 47 ° C. Został on

wykazały, że szok termiczny powoduje pewne geny do wyrażania białek szoku termicznego (HSP)

które pomagają komórkom przetrwać w podwyższonej temperaturze, a tym samym wyższe

sprawności przemiany. Możliwe jest, że 42 ° C jest optymalna temperatura

tych genów być wyrażone na optymalnym poziomie.Temperatury wyższej niż 42 ° C może być

szkodliwe dla przeżycia komórek, a tym samym spadek wydajności transformacji. to

może być również możliwe, że inkubacji w niższej temperaturze przez dłuższy okres czasu

może osiągnąć takie same wyniki.

Rysunek 2: Wpływ temperatury szoku termicznego w transformacji: Komórki inkubowano przez 30

sekund w czterech różnych temperaturach indywidualnie. Dane przedstawiają średnią ± SD z

dwóch powtórzeń. Każdy zabieg wysiano w trzech egzemplarzach.

Wpływ zimna inkubacji ciepło szok komórki traktowane na przemian:

Jak sprawności przemiany wpływają na zimno inkubacji komórek bakteryjnych

po szoku cieplnego traktowania nie jest jasno określony. Aby przetestować działanie zimna

inkubacji

(po szoku cieplnego) na transformacji E. coli, eksperyment został zaprojektowany w sposób

pokazany na rysunku. 3A. Nasze wyniki wskazują, że transformacja odbywa się jeszcze przed

ciepła

terapia szokowa jest podana do CaCl2 traktowanych komórek (rys. 3, leczenia 1). Niemniej jednak, wydajność transformacji jest około 15 razy mniejsze w porównaniu do szoku termicznego

(Ryc. 3B, leczenie 1 vs 2). Wyniki te potwierdzają wcześniejsze obserwacje, że ciepło

szok znacznie zwiększa wydajność transformacji. Niemniej jednak,

mechanizm szoku wywołanego ciepła pobieranie DNA w komórkach traktowanych CaCl2 nadal nie

jest

dokładnie znane. Przypuszcza się, że dwuwartościowych kationów, takich jak Mg2 + i Ca2 +

odgrywają znaczącą rolę w interakcji z DNA z fosfolipidów błon. te

kationy są zobowiązane do fosfolipidów i dostarczyć ładunek dodatni do nich. ujemnie

opłata DNA wydaje się dołączyć do cząsteczki lipidów w drodze mediacji dwuwartościowych

kationy (15). Nagły wstrząs pod wpływem ciepła zmienia membrany i pomaga DNA

internalizacji w szybszym tempie być może wpuklenie powierzchni komórki niosącej

związany z błoną DNA do komórek. Założenia te są obsługiwane przez wcześniejsze

obserwacji, że E. coli, z których lipopolisacharydy (LPS) mają wypłukany pokazać

wysoką wydajność transformacji, gdy przekształciła z plazmidu-LPS kompleksów

zamiast plazmidowego DNA sam (16, 17).

Rys. 3: Wpływ zimna inkubacji na przemian po leczeniu szoku cieplnego

komórek: Panel-przedstawia doświadczenia podczas panelu-B pokazuje

sprawności przemiany po odpowiedniej terapii. Numery 1, 2, 3 i 4

cztery niezależne zabiegi, jak pokazano na panelu A. liczba Tube 1 nigdy nie otrzymał szoku

termicznego. Numer rury 2 został wyposażony w SOC media natychmiast po szoku termicznego.

Numer rury 3 inkubowano w temperaturze pokojowej (RT) do 10 min po szoku cieplnego

leczenie przed otrzymaniem SOC mediów. 4 liczba Tube inkubowano w lodzie przez 10

min przed otrzymaniem SOC mediów. 0 ° C wskazuje na etapie inkubacji lodu. dane przedstawiają

średnia ± SD z 3 powtórzeń. Każdy zabieg wysiano w trzech egzemplarzach. statystyczny

znaczenie między grupami była wykonywana przez studentów niesparowany t-test za pomocą

Oprogramowanie GraphPad. Wartości prawdopodobieństwa są przedstawione na wykresie. Jak

widać na wykresie

wartości są bardzo istotne statystycznie na poziomie <0,0002 wyjątkiem jednego

grupy (leczenie 2 vs 3), który jest nieznaczna.

Co ciekawe, inkubacji komórek na lód po kroku szoku termicznego dodatkowo

zwiększa wydajność przetwarzania przez około 1,6 krotnie (ryc. 3B, leczenie 2 vs 4). Kiedy

czterech różnych niskich temperaturach inkubacji (1, 15, 30 i 60 min) szoku cieplnego postu

były testowane, 15 min zimno inkubacji wykazała maksymalną wydajność transformacji

poza którym nie ma znaczny wzrost (dane nie pokazane). Podczas ciepła

okres szoku ruchu drobnych cząsteczek plazmidu DNA właściwe komórki

Mieszanina może wzrosnąć. Jest możliwe, że ciepło szoku po lodzie etapie inkubacji

zmniejsza ruch cieplny cząsteczek plazmidu DNA, a tym samym wspieranie dalszego wiązania

z lewej na (plazmid DNA nie wychwytywana przez komórki podczas szoku cieplnego) DNA do

komórki

powierzchni. Te dodatkowe cząsteczki DNA mogą być dalej wychwytywana przez komórki,

podczas gdy

inkubuje się w temperaturze 37 ° C przez godzinę w drżenie inkubatorze. Ten wysokiej

temperaturze 37 ° C

może służyć jako drugi etap szoku cieplnego, a tym samym zwiększa ogólną transformacji

efektywności E. coli. Wykazano, że konwersja z DNA do odporne DNazy

forma występuje podczas inkubacji lód po kroku szoku cieplnego (1). Jest możliwe, że DNazy

odporne postaci DNA zapewnić jej przetrwanie wewnątrz komórek, a tym samym spowodowały

wzrost

sprawności przemiany. Wydaje się, że indukcja kompetencji i wychwyt DNA

to dwa odrębne etapy, a szoku cieplnego w komórkach traktowane Ca2 + może grać

ważną rolę w absorpcji DNA. Wydaje się, że niewielki spadek

transformacji, gdy komórki są inkubowane w temperaturze pokojowej, a nie po lodzie

leczenia szoku cieplnego (ryc. 3B leczenia 3 vs 2). Być może ze względu na fakt, iż niektóre

komórek do ożywienia po ekspozycji bardzo delikatne CaCl2 komórki traktowane do temperatury

pokojowej.

Podsumowując, nasze wyniki sugerują, że impuls szoku cieplnego 30 sekund w temperaturze 42 °

C

następnie 10 min lodu etapie inkubacji są idealne parametry w celu uzyskania maksymalnego

sprawności przemiany w DH5α-T1R szczep z pUC19 plazmidu DNA. To

Badanie sugeruje również, że ciepło po szoku zimna etapie inkubacji jest również ważnym

czynnik i zwiększa częstotliwość transformacji znacząco.