Strona 1 z 4
Sprawozdanie 5.
Wydział Chemiczny
Data zajęć: 2008/10/28
Enzymologia (BTC4033l)
Grupa IV
Ćwiczenie 4.
laboratorium
Anna Dawiec
Trawienie króliczej aldolazy mięśniowej
mgr inż. Dominika Bystranowska
Mateusz Jędrzejewski
PT, 16:10-18:45, F-4/C3
za pomocą karboksypeptydazy A
Aleksandra Korkuś
Ćwiczenie 4. Wstęp
Karboksypeptydaza A (CPA) to enzym z grupy proteaz. Hydrolizuje pojedyncze wiązania peptydowe od C-końca. Działa mało specyficznie, ale łatwiej odłącza aminokwasy zawierające w bocznym łańcuchu pierścień aromatycznych lub rozbudowany łańcuch alifatyczny. W centrum katalitycznym zawiera jon cynku.
Aldolaza z mięśni królika to enzym z grupy liaz. Na C-końcu ma tryptofan. Bierze udział w jednej z reakcji glikolizy. Katalizuje reakcję rozszczepienia (oraz kondensacji aldolowej), tj. reakcję fruktozo-1,6-disfosforanu (FDP) do fosfodihydroksyacetonu (DHAP) oraz aldehydu 3-fosfoglicerynowego (GAP).
Test hydrozynowy służy do wyznaczania aktywności aldolazy. Polega na spektrofotometrycznym oznaczaniu zmiany stężenia hydrazonu aldehydu 3-fosfoglicerynowego (H) przy 240 nm. W reakcji charakterystycznej H powstaje z aldehydu 3-fosfoglicerynowego i siarczanu hydrazyny w stosunku 1:1.
Ćwiczenie 4. Cel
Zbadanie wpływu hydrolizy aldolazy przez CPA na zmianę aktywności aldolazy w czasie.
Ćwiczenie 4. Wykonanie
Przygotowano 4 próbówki chemiczne: „ald”, „A 1 mg/ml”, P, K. Do 8 probówek chemicznych: K1’, K50’, 5’, 15’, 20’, 25’, 35’, 45’; dodano po 500 μl buforu (100 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5).
Do kuwety pomiarowej dodano 2 ml buforu (10 mM Tris/HCl, pH 7,2) i 30 μl wyjściowego roztworu aldolazy (1). Zmierzono absorbancję przy 280 nm. Roztwór przelano do „ald” (2).
Do pustej kuwety pomiarowej (3) dodano 1,5 ml buforu (100 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, 2,6 mM
siarczan hydrazyny, pH 7,5), 200 μl 30 mM FDP. Kuwetę z odnośnikiem sporządzono analogicznie.
Wyzerowano spektrofotometr. Do kuwety pomiarowej (3) dodano 29 μl „ald” (2); do odnośnika 29 μl buforu (100 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5). Zmierzono absorbancję względem odnośnika przy 240 nm przez 3 minuty.
Do próbówki chemicznej „A 1 mg/ml” (4) dodano 2,28 ml buforu (10 mM Tris/HCl, pH 7,2) oraz 217 μl wyjściowego roztworu aldolazy (1). Do próbówek P i K dodano po 1 ml roztworu
„A 1 mg/ml” (4) oraz wstawiono je do łaźni wodnej o temperaturze 25°C.
Przygotowano stoper. Do probówki K dodano 54 μl 10% chlorku litu (LiCl) oraz do probówki P
dodano 54 μl CPA. Włączono stoper.
Po 1 minucie do probówki K1’ dodano 50 μl roztworu z probówki K. Roztwór K1’ wymieszano.
Do pustej kuwety pomiarowej (5) dodano 1,5 ml buforu (100 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, 2,6 mM
siarczan hydrazyny, pH 7,5), 200 μl 30 mM FDP. Kuwetę z odnośnikiem sporządzono analogicznie.
Wyzerowano spektrofotometr. Do kuwety pomiarowej (5) dodano 50 μl roztworu K1’; do odnośnika 50 μl buforu (100 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5). Zmierzono absorbancję
względem odnośnika przy 240 nm przez 3 minuty.
Po 5, 15, 20, 35 i 45 minutach postępowano analogicznie pobierając 50 μl roztworu z probówki P odpowiednio do probówek 5’, 15’, 20’, 25’, 35’, 45’. Dla każdego z roztworów zmierzono absorbancję względem odnośnika przy 240 nm przez 2 minuty.
Po 50 minutach do probówki K50’ dodano 50 μl roztworu z probówki K. Analogicznie zmierzono absorbancję względem odnośnika przy 240 nm przez 3 minuty.
Wyłączono stoper.
Strona 2 z 4
Sprawozdanie 5.
Wydział Chemiczny
Data zajęć: 2008/10/28
Enzymologia (BTC4033l)
Grupa IV
Ćwiczenie 4.
laboratorium
Anna Dawiec
Trawienie króliczej aldolazy mięśniowej
mgr inż. Dominika Bystranowska
Mateusz Jędrzejewski
PT, 16:10-18:45, F-4/C3
za pomocą karboksypeptydazy A
Aleksandra Korkuś
Ćwiczenie 4. Wyniki
Tabela 1. – Obliczenia dla roztworu aldolazy w probówce „ald” (2).
uwagi
0,1547 odczyt ze spektrofotometru
ald
0,170 ald
,%
mg/ml
·
Akt
ald
Akt
0,600
ald
· Aktald
U/ml
Akt
&
spec
3,53
Aktspec Aktald %·Aktald Aktspec
U/mg
&
$ald
%·$ald
gdzie: masowy współczynnik ekstynkcji dla aldolazy mięśniowej (przy 280 nm): ',(%
0,91 ml
mg·cm
długość drogi optycznej (szerokość kuwety): - 1 cm
patrz tabela 2.
Tabela 2. – Obliczenia dla roztworu aldolazy w kuwecie zawierającej mieszaninę testową do testu hydrazynowego (3) uwagi
./
/ 1/ald
µl
29
.
$ald
4
59,6
2test32
24
ald
2,85 ∙ 10–3
$ald
mg/ml
ald
%
Δt min
4
-
8
0,06
odczyt z wykresu 1. („III”)
9
0,17
odczyt z wykresu 1. („III”)
Δ
9
8
0,11
Δ :
Aktald
10,07 ∙ 10–3
Akt
;< · 10
U/ml
ald
=>··∆@
Akt
&
spec
3,53
Aktspec Aktald
U/mg
&
$ald
gdzie: masa aldolazy: ABald 5 µg
długość drogi optycznej (szerokość kuwety): - 1 cm molowy współczynnik ekstynkcji dla hydranazonu GAP (przy 240 nm): DE 2730 1
M·cm
objętość (do testu hydrazynowego): .test 1,5 ml J 200 µl 1700 µl Tabela 3. – Obliczenia dla roztworu aldolazy w preparacie wyjściowym (1) uwagi
(
(
ald
11,5
ald
( · ald
mg/ml
Akt(
(
ald
Akt
40,6
ald
( · Aktald
U/ml
Akt(
(
(
tot*
Akt
Akt
· .
40,6
tot
ald
(
U
Akt(
spec
(
3,53
Aktspec Aktald %·Aktald Aktspec
U/mg
$ald
%·$ald
gdzie: rozcieńczenie: ( µl3 µl 67,67
µl
* objętość wyjściowego preparatu aldolazy .( 1 ml.
Strona 3 z 4
Sprawozdanie 5.
Wydział Chemiczny
Data zajęć: 2008/10/28
Enzymologia (BTC4033l)
Grupa IV
Ćwiczenie 4.
laboratorium
Anna Dawiec
Trawienie króliczej aldolazy mięśniowej
mgr inż. Dominika Bystranowska
Mateusz Jędrzejewski
PT, 16:10-18:45, F-4/C3
za pomocą karboksypeptydazy A
Aleksandra Korkuś
Obliczenia 1.
Sporządzenie 2,5 ml roztworu aldolazy (4) o stężeniu 1 mg/ml z roztworu aldolazy (1).
.
.ald J .bufor 2,5 ml
A
( · .(
.
2,5
ald
ald
ald
(
ald 1 mg
Q .
217 µl Q .
2,28 ml
ml
.
ald
(
bufor
.
ald 11,5
Obliczenia 2.
Sporządzenie roztworu CPA i aldolazy (P) w stosunku molowym 1:2000 z roztworu aldolazy (4).
/
ald 1 mg
. 1 ml
S
S
ml
ald 160 kDa
CPA 0,002 mg
ml
CPA 34,4 kDa
1
X
A
S
· ./
CPA CPA · Sald CPA · .CPA · Sald
CPA · ald
54 µl
2000
X
/ Q .CPA
ald
SCPA · Aald
SCPA · ald · .
2000 · CPA · Sald
./ J .
1000 µl J 54 µl
CPA
1,054
./
54 µl
Tabela 4. – Obliczenia dla roztworów trawionej aldolazy i próbach kontrolnych w kuwetach (5)
.
Z
Δt
Z
AktZ
Próbka
traw
8
Akt
9
Δ
ald
spec
µl
· Z
ald
mg/ml
min
U/ml
U/mg
K1’
50
385
2,46 ∙ 10–3
2
0,06
0,135
0,075
0,0137
5,58
5’
50
385
2,46 ∙ 10–3
2
0,09
0,16
0,07
0,0128
5,21
15’
50
385
2,46 ∙ 10–3
2
0,06
0,11
0,05
0,0092
3,72
20’
50
385
2,46 ∙ 10–3
2
0,08
0,125
0,045
0,0082
3,35
25’
50
385
2,46 ∙ 10–3
1
0,14
0,16
0,02
0,0073
2,98
35’
50
385
2,46 ∙ 10–3
1,5
0,02
0,04
0,02
0,0049
1,99
45’
50
385
2,46 ∙ 10–3
3
0,015
0,05
0,035
0,0043
1,74
K50’
50
385
2,46 ∙ 10–3
3
0,045
0,155
0,11
0,0134
5,46
gdzie:
objętość buforu do „hamowania” reakcji: .buforu 500 µl objętość pobierana z K lub P: ./Z 50 µl objętość (do testu hydrazynowego): .test 1,5 ml J 200 µl 1700 µl 4
rozcieńczenie: · Z 2buforu32[
Z µl3Z µl · (\ µl3Z µl 385
24
· 2test32traw
[
2traw
Z µl
Z µl
<
( mg
stężenie: Z
ml
ald
$ald
2,46 · 10] mg
%&·%<·%[
(,Z·Z
ml
8
zmiana absorbancji: Δ
9
:
długość drogi optycznej (szerokość kuwety): - 1 cm molowy współczynnik ekstynkcji dla hydranazonu GAP (przy 240 nm): DE 2730 1
M·cm
aktywność aldolazowa: AktZald ^_< · 10
`>·a·∆b
[
aktywność specyficzna aldolazy: AktZspec Aktald $[
ald
Strona 4 z 4
Sprawozdanie 5.
Wydział Chemiczny
Data zajęć: 2008/10/28
Enzymologia (BTC4033l)
Grupa IV
Ćwiczenie 4.
laboratorium
Anna Dawiec
Trawienie króliczej aldolazy mięśniowej
mgr inż. Dominika Bystranowska
Mateusz Jędrzejewski
PT, 16:10-18:45, F-4/C3
za pomocą karboksypeptydazy A
Aleksandra Korkuś
Tabela 5. – Obliczenia dla roztworu trawionej aldolazy (P) i w próbie kontrolnej (K) t*
Akt
Akt
tot
spec
%Akt
min
U
U/mg
spec
5
5,20
5,21
93,3%
15
3,72
3,72
66,7%
20
3,34
3,35
60,0%
P
25
2,97
2,98
53,3%
35
1,98
1,99
35,6%
45
1,73
1,74
31,1%
1
5,57
5,58
100,0%
K
50
5,45
5,46
97,8%
gdzie: założono, że aktywność specyficzna próby K1’ wynosi 100%.
* czas inkubacji dla (K) i czas trawienia dla (P).
Akt
/
Z
tot Aktald · c. J .CPAd · Z · Aktald · 1054 µl Wykres 3. – Zmiana aktywności specyficznej aldolazy od czasu trawienia przez CPA 100%
80%
ce 60%
t spkA 40%
%
20%
0%
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
czas [s]
Ćwiczenie 4. Wnioski
Aktywność specyficzną aldolazy w pierwszym teście wyznaczono na 3,53 U/mg. Pomiar ten należy uznać za obarczony dużym błędem, pomyłkę. Późniejsze pomiary dla próbek kontrolnych wyznaczyły wartość aktywności specyficznej aldolazy na 5,58 U/mg oraz 5,46 U/mg. Utrata aktywności dla próby kontrolnej była niewielka i wynosiła zaledwie 2,2%. Nie zmienia to faktu, że wartość aktywności specyficznej aldolazy była znacznie niższa niż wartość aktywności specyficznej tej samej aldolazy oznaczonej w ćwiczeniu 1. dnia 2008/10/17 na 7,58 U/mg.
Wykres 3. pokazuje wyraźny spadek aktywności aldolazy od czasu trawienia CPA. W pierwszej fazie następuje gwałtowny spadek aktywności aldolazy (na wykresie jest zbyt rozciągnięty w czasie).
C-końcowe reszty aminokwasowe w aldolazie, w szczególności ostatnia czyli tryptofan, biorą udział w stabilizacji produktu pośredniego (w centrum katalitycznym) lub utrzymują właściwą konformację aldolazy. Ich brak daje wyraźne spadek aktywności. W drugiej fazie aktywność aldolazy utrzymuje się na stałym poziomie (na wykresie jest zbyt krótki w czasie). W centrum katalitycznym aldolazy są jeszcze inne reszty aminokwasowe niż te C-końcowe odcięte przez CPA, więc aldolaza zachowuje aktywność na poziomie ponad 30%. Powodem mało wyraźnego charakteru wykresu 3.
może być zbyt niska aktywność specyficzna aldolazy już w roztworze wyjściowym.
Załączniki
1. Wykresy spektrofotometru: zmiany absorbancji w czasie (Wykres 1. oraz Wykres 2.).
2. Instrukcja „Ćwiczenia 1.” oraz „Ćwiczenia 4.” wraz z bieżącymi obliczeniami.