Sprawozdanie 4. 

Politechnika Wrocławska 

Wydział Chemiczny 

Strona 1 z 3 
Data zajęć: 2008/11/14 

Enzymologia (BTC4033l) 
laboratorium 
mgr inż. Dominika Bystranowska 
PT, 16:10-18:45, F-4/C3 

Ćwiczenie 5. 

Oznaczanie N-końcowych reszt aminowych 

białka metodą dansylowania 

Grupa IV 
Anna Dawiec 
Mateusz Jędrzejewski 
Aleksandra Korkuś 

 

Ćwiczenie 5.  Wstęp 

Białka  (peptydy)  są  zbudowane  z  aminokwasów  połączonych  szeregowo  wiązaniami 

peptydowymi.  Kolejność  aminokwasów  wyznacza  sekwencję  peptydu.  Tak  utworzony 

łańcuch  jest  polarny;  ma  wyróżniony  C-koniec  z  grupą  karboksylową  oraz  N-koniec 

zawierający grupę aminową. 

Poznawanie  sekwencji  białka  można  rozpocząć  od  oznaczenia  aminokwasu  na  N-końcu. 

Jedną  z  metodą  jest  dansylowanie.  Substratem  reakcji  jest  chlorek  dansylu  (DNS-Cl),  który 

reaguje  m.in.  z  I  i  II  rzędowymi  aminami  na  N-końcu.  Tak  utworzone  pochodne 

sulfonamidowe  mają  silne  właściwości  fluoryzujące.  Po  dansylowaniu  peptydu  należy 

go zhydrolizować. Dodatkowo należy niezależnie dansylować aminokwasy, które posłużą jako 

wzorce odniesienia do identyfikacji aminokwasu na N-końcu. 

Ćwiczenie 5.  Cel 

Dansylowanie peptydu P1 oraz dansylowanie aminokwasów: Arg, Gly, Pro.  

Przygotowanie próbek do Ćwiczenia 6. 

(a) 

NH

2

O

N

H

NH

N

H

2

OH

 

(b) 

NH

2

O

OH

 

(c) 

N

H

O

OH

 

Rysunek 1. – wzory aminokwasów: (a) arginina (Arg), (b) glicyna (Gly), (c) prolina (Pro). 

Ćwiczenie 5.  Wykonanie 

Przygotowania do dansylowania aminokwasów i badanego peptydu P1 prowadzono równolegle. 

Do trzech szklanych ampułek odmierzono po 100 μl aminokwasów (Arg, Gly, Pro). Odparowano 

zawartość  ampułek  pod  próżnią.  Dodano  po  0,5  ml  0,1  M  NaHCO

3

  oraz  po  0,25  ml  roztworu 

chlorku  dansylu  (5  mg/ml)  w  acetonie.  Inkubowano  przez  30  min  w  37°C.  Reakcję  przerwano 

dodając po 25 μl 85% kwasu mrówkowego. Ampułki zamknięto parafilmem. 

 Do  dwóch  ampułek  odmierzono  po  10  μl  peptydu  P1.  Odparowano  zawartość  ampułek 

pod  próżnią.  Dodano  po  20  μl  0,2  M  NaHCO

3

.  Odparowano  zawartość  ampułek  pod  próżnią.  

Dodano  po  20  μl  wody  dejonizowanej.  Sprawdzono  poziom  pH.  Dodano  po  20  μl  roztworu 

chlorku dansylu (5 mg/ml) w acetonie. Inkubowano przez 60 min w 37°C. Odparowano zawartość 

ampułek pod próżnią. Dodano po 100 μl stałowrzącego HCl. Zatopiono ampułki nad palnikiem. 

Asystent techniczny poddawał próbkę chemicznej hydrolizie wiązań peptydowych w temperaturze 

105°C przez 18 godzin. 

Ćwiczenie 5.  Wyniki 

Trzy ampułki zamknięte parafilmem z DNS-aminokwasami. 

Dwie zatopione ampułki z peptydem P1 przeznaczone do hydrolizy. 

Ćwiczenie 5.  Wnioski 

Wnioski umieszczono w Ćwiczeniu 6. Wnioski. 

Sprawozdanie 4. 

Politechnika Wrocławska 

Wydział Chemiczny 

Strona 2 z 3 
Data zajęć: 2008/11/19 

Enzymologia (BTC4033l) 
laboratorium 
mgr inż. Dominika Bystranowska 
ŚR, 16:10-18:45, F-4/C3 

Ćwiczenie 6. 

Identyfikacja dansylowanych 

aminokwasów metodą cienkowarstwowej 

chromatografii na płytkach poliamidowych 

Mateusz Jędrzejewski 
odróbka z grupą IV 

 

Ćwiczenie 6.  Wstęp 

Chromatografia  jest  techniką  służąca  do  badania  składu  mieszaniny  związków  chemicznych. 

Pierwszy etap to rozdział roztworu na złożu. Drugi etap to identyfikacja składników. 

W  chromatografii  cienkowarstwowej  (ang.  thin  layer  chromatography)  fazą  rozdzielczą 

(złożem)  jest  sztywna  płytka.  Można  użyć  płytek  z  żelem  krzemionkowym  –  mniejsza 

rozdzielczość.  Natomiast  płytki  poliamidowe  dają  dobrą  rozdzielność.  Rozdział  na  płytce 

następuje  gdy  eluent  dyfunduje  w  górę  płytki.  Szybkość  poszczególnych  składników 

rozdzielanej  mieszaniny  jest  zależna  od  oddziaływań  międzycząsteczkowych  między 

związkami chemicznymi obecnymi w analizowanej próbce, a fazą rozdzielczą i eluentem. Gdy 

czoło  eluenta  dotrze  do  górnej  krawędzi  płytki  rozdział  jest  zakończony.  Identyfikacja 

składników  na  płytce  jest  możliwa  poprzez  porównanie  ze  wzorcami.  Składniki  na  płytce 

powinny  być  fluoryzujące  lub  barwne,  jeżeli  nie  to  trzeba  je  wybarwić.  W  szczególności 

metoda nadaje się do identyfikacji DNS-aminokwasów. 

Miarą  rozdziału  chromatograficznego  jest  współczynnik  opóźnienia,  czyli  rozdziału  



 

(ang.  retardation  factor). Definiowany  jako  iloraz  drogi  przebytej  przez  daną  substancję  (



) 

do drogi przebytej przez czoło eluentu (), zgodnie ze wzorem (1). 

 

,







 

(1) 

Ćwiczenie 6.  Cel 

Oznaczenie  N-końcowego  aminokwasu  w  peptydzie  P1  chromatograficznie.  W  tym  celu 

prowadzono  rozdzielanie  dla  DNS-aminokwasów  oraz  shydrolizowanej  próbki  P1  zwierającej 

DNS-aminokwas N-końcowy. Wykorzystano dwa układu rozdzielające. 

Układ 1: octan etylu, etanol, amoniak (20:5:1) 

Układ 2: n-propanol; chloroform; 99,7% kwas octowy (80:20:5) 

Ćwiczenie 6.  Wykonanie 

Przygotowano  dwie  płytki  poliamidowe  (o  wymiarach  5 na 5 cm).  Miejsce  nakładania 

preparatu zaznaczono ołówkiem po 1 cm od brzegów, na jednej symbolem „x” na drugiej „o”. 

Do probówki eppendorfa odmierzono po 50 μl każdego z trzech DNS-aminokwasów i mieszano. 

Do  próbki  peptydu  dodano  10  μl  pirydyny  i  mieszano.  Nakładano  kroplami  w  miejsce  „x” 

roztwór peptydu. Po każdej nałożonej kropli płytę suszono. Analogicznie nakładano w miejsce 

„o” roztwór aminokwasów. 

Do  kuwety  wlano  układ  1.  Płytki  wstawiono  do  statywu.  Statyw  częściowo  włożono 

do kuwety (ponad poziom cieczy). Statyw poziomowano. Odczekano 15 min.  Statyw zanurzono 

całkowicie w kuwecie (do dna kuwety). Odczekano aż  eluent przedyfunduje do góry płytek. 

Statyw wyjęto. Płytki wyruszono. Kuwetę umyto. 

Statyw  odwrócono  o  90°  w  zaznaczonym  kierunku  na  statywie.  Do  kuwety  wlano  układ  2. 

Płytki wstawiono do statywu. Statyw częściowo włożono do kuwety (ponad poziom cieczy). 

Statyw poziomowano. Odczekano 15 min.  Statyw zanurzono całkowicie w kuwecie (do dna 

kuwety). Odczekano aż eluent przedyfunduje do góry płytek. Statyw wyjęto. Kuwetę umyto. 

Płytki wyruszono. Oglądano płytki w świetle UV. 

 

Sprawozdanie 4. 

Politechnika Wrocławska 

Wydział Chemiczny 

Strona 3 z 3 
Data zajęć: 2008/11/19 

Enzymologia (BTC4033l) 
laboratorium 
mgr inż. Dominika Bystranowska 
ŚR, 16:10-18:45, F-4/C3 

Ćwiczenie 6. 

Identyfikacja dansylowanych 

aminokwasów metodą cienkowarstwowej 

chromatografii na płytkach poliamidowych 

Mateusz Jędrzejewski 
odróbka z grupą IV 

 

Ćwiczenie 6.  Wyniki 

Otrzymany rozdział na płytkach oglądano pod lampą UV przy 365 nm. 

(a) 

 

(b) 

 

(c) 

 

(d) 

 

 

gdzie: * identyfikowany N-końcowy aminokwas; wymienione aminokwasy są zdansylowane. 

Rysunek 2. – rozdział chromatograficzny płytek w świetle UV (obraz przekonwertowano na odcienie szarości, 

ciemne obszary to większa fluorescencja): (a) fluorescencja DNS-aminokwasów (wzorzec), (b) fluorescencja 

hydrolizatu peptydu (badana próbka), (c) opisany schemat wzorca, (d) opisany schemat badanej próbki. 

 

Obliczenia współczynników rozdziału DNS-aminokwasów 

, Arg

układ 1



, cm

 cm

 0,11 

, Arg

układ 2



, cm

 cm

 0,60 

, Gly

układ 1



,  cm

 cm

 0,32 

, Gly

układ 2



," cm

 cm

 0,47 

, Pro

układ 1



,'( cm

 cm

 0,41 

, Pro

układ 2



,) cm

 cm

 0,77 

, *

układ 1



, cm

 cm

 0,33 

, *

układ 2



,   cm

 cm

 0,44 

Współczynniki rozdziału * są zbliżone do współczynników rozdziału DNS-glicyny. 

Ćwiczenie 6.  Wnioski 

pH roztworu z peptydem było równe 9 co pozwoliło na skuteczne oznaczenie N-końcowego 

aminokwasu. Roztwory po dansylowaniu zmieniły kolor z żółtego na bezbarwny. 

Badany peptyd P1 na N-końcu zawierał glicynę. 

Załączniki 

1.

 

Instrukcja „Ćwiczenie 5.” wraz z bieżącymi notatkami. 

2.

 

Instrukcja „Ćwiczenie 6.” wraz z bieżącymi notatkami. 

Układ 1 

U

k

ła

d

 2

 

Gly

Gly*

Pro

Arg

DNS 

DNS 

Układ 1 

U

k

ła

d

 2