Sprawozdanie 4.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 1 z 3
Data zajęć: 2008/11/14

Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
mgr inż. Dominika Bystranowska
PT, 16:10-18:45, F-4/C3

Ćwiczenie 5.

Oznaczanie N-końcowych reszt aminowych

białka metodą dansylowania

Grupa IV
Anna Dawiec
Mateusz Jędrzejewski
Aleksandra Korkuś

Ćwiczenie 5. Wstęp

Białka (peptydy) są zbudowane z aminokwasów połączonych szeregowo wiązaniami

peptydowymi. Kolejność aminokwasów wyznacza sekwencję peptydu. Tak utworzony

łańcuch jest polarny; ma wyróżniony C-koniec z grupą karboksylową oraz N-koniec

zawierający grupę aminową.

Poznawanie sekwencji białka można rozpocząć od oznaczenia aminokwasu na N-końcu.

Jedną z metodą jest dansylowanie. Substratem reakcji jest chlorek dansylu (DNS-Cl), który

reaguje m.in. z I i II rzędowymi aminami na N-końcu. Tak utworzone pochodne

sulfonamidowe mają silne właściwości fluoryzujące. Po dansylowaniu peptydu należy

go zhydrolizować. Dodatkowo należy niezależnie dansylować aminokwasy, które posłużą jako

wzorce odniesienia do identyfikacji aminokwasu na N-końcu.

Ćwiczenie 5. Cel

Dansylowanie peptydu P1 oraz dansylowanie aminokwasów: Arg, Gly, Pro.

Przygotowanie próbek do Ćwiczenia 6.

(a)

NH

2

O

N

H

NH

N

H

2

OH

(b)

NH

2

O

OH

(c)

N

H

O

OH

Rysunek 1. – wzory aminokwasów: (a) arginina (Arg), (b) glicyna (Gly), (c) prolina (Pro).

Ćwiczenie 5. Wykonanie

Przygotowania do dansylowania aminokwasów i badanego peptydu P1 prowadzono równolegle.

Do trzech szklanych ampułek odmierzono po 100 μl aminokwasów (Arg, Gly, Pro). Odparowano

zawartość ampułek pod próżnią. Dodano po 0,5 ml 0,1 M NaHCO

3

oraz po 0,25 ml roztworu

chlorku dansylu (5 mg/ml) w acetonie. Inkubowano przez 30 min w 37°C. Reakcję przerwano

dodając po 25 μl 85% kwasu mrówkowego. Ampułki zamknięto parafilmem.

Do dwóch ampułek odmierzono po 10 μl peptydu P1. Odparowano zawartość ampułek

pod próżnią. Dodano po 20 μl 0,2 M NaHCO

3

. Odparowano zawartość ampułek pod próżnią.

Dodano po 20 μl wody dejonizowanej. Sprawdzono poziom pH. Dodano po 20 μl roztworu

chlorku dansylu (5 mg/ml) w acetonie. Inkubowano przez 60 min w 37°C. Odparowano zawartość

ampułek pod próżnią. Dodano po 100 μl stałowrzącego HCl. Zatopiono ampułki nad palnikiem.

Asystent techniczny poddawał próbkę chemicznej hydrolizie wiązań peptydowych w temperaturze

105°C przez 18 godzin.

Ćwiczenie 5. Wyniki

Trzy ampułki zamknięte parafilmem z DNS-aminokwasami.

Dwie zatopione ampułki z peptydem P1 przeznaczone do hydrolizy.

Ćwiczenie 5. Wnioski

Wnioski umieszczono w Ćwiczeniu 6. Wnioski.

Sprawozdanie 4.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 2 z 3
Data zajęć: 2008/11/19

Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
mgr inż. Dominika Bystranowska
ŚR, 16:10-18:45, F-4/C3

Ćwiczenie 6.

Identyfikacja dansylowanych

aminokwasów metodą cienkowarstwowej

chromatografii na płytkach poliamidowych

Mateusz Jędrzejewski
odróbka z grupą IV

Ćwiczenie 6. Wstęp

Chromatografia jest techniką służąca do badania składu mieszaniny związków chemicznych.

Pierwszy etap to rozdział roztworu na złożu. Drugi etap to identyfikacja składników.

W chromatografii cienkowarstwowej (ang. thin layer chromatography) fazą rozdzielczą

(złożem) jest sztywna płytka. Można użyć płytek z żelem krzemionkowym – mniejsza

rozdzielczość. Natomiast płytki poliamidowe dają dobrą rozdzielność. Rozdział na płytce

następuje gdy eluent dyfunduje w górę płytki. Szybkość poszczególnych składników

rozdzielanej mieszaniny jest zależna od oddziaływań międzycząsteczkowych między

związkami chemicznymi obecnymi w analizowanej próbce, a fazą rozdzielczą i eluentem. Gdy

czoło eluenta dotrze do górnej krawędzi płytki rozdział jest zakończony. Identyfikacja

składników na płytce jest możliwa poprzez porównanie ze wzorcami. Składniki na płytce

powinny być fluoryzujące lub barwne, jeżeli nie to trzeba je wybarwić. W szczególności

metoda nadaje się do identyfikacji DNS-aminokwasów.

Miarą rozdziału chromatograficznego jest współczynnik opóźnienia, czyli rozdziału



(ang. retardation factor). Definiowany jako iloraz drogi przebytej przez daną substancję (



)

do drogi przebytej przez czoło eluentu (), zgodnie ze wzorem (1).

,







(1)

Ćwiczenie 6. Cel

Oznaczenie N-końcowego aminokwasu w peptydzie P1 chromatograficznie. W tym celu

prowadzono rozdzielanie dla DNS-aminokwasów oraz shydrolizowanej próbki P1 zwierającej

DNS-aminokwas N-końcowy. Wykorzystano dwa układu rozdzielające.

Układ 1: octan etylu, etanol, amoniak (20:5:1)

Układ 2: n-propanol; chloroform; 99,7% kwas octowy (80:20:5)

Ćwiczenie 6. Wykonanie

Przygotowano dwie płytki poliamidowe (o wymiarach 5 na 5 cm). Miejsce nakładania

preparatu zaznaczono ołówkiem po 1 cm od brzegów, na jednej symbolem „x” na drugiej „o”.

Do probówki eppendorfa odmierzono po 50 μl każdego z trzech DNS-aminokwasów i mieszano.

Do próbki peptydu dodano 10 μl pirydyny i mieszano. Nakładano kroplami w miejsce „x”

roztwór peptydu. Po każdej nałożonej kropli płytę suszono. Analogicznie nakładano w miejsce

„o” roztwór aminokwasów.

Do kuwety wlano układ 1. Płytki wstawiono do statywu. Statyw częściowo włożono

do kuwety (ponad poziom cieczy). Statyw poziomowano. Odczekano 15 min. Statyw zanurzono

całkowicie w kuwecie (do dna kuwety). Odczekano aż eluent przedyfunduje do góry płytek.

Statyw wyjęto. Płytki wyruszono. Kuwetę umyto.

Statyw odwrócono o 90° w zaznaczonym kierunku na statywie. Do kuwety wlano układ 2.

Płytki wstawiono do statywu. Statyw częściowo włożono do kuwety (ponad poziom cieczy).

Statyw poziomowano. Odczekano 15 min. Statyw zanurzono całkowicie w kuwecie (do dna

kuwety). Odczekano aż eluent przedyfunduje do góry płytek. Statyw wyjęto. Kuwetę umyto.

Płytki wyruszono. Oglądano płytki w świetle UV.

Sprawozdanie 4.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 3 z 3
Data zajęć: 2008/11/19

Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
mgr inż. Dominika Bystranowska
ŚR, 16:10-18:45, F-4/C3

Ćwiczenie 6.

Identyfikacja dansylowanych

aminokwasów metodą cienkowarstwowej

chromatografii na płytkach poliamidowych

Mateusz Jędrzejewski
odróbka z grupą IV

Ćwiczenie 6. Wyniki

Otrzymany rozdział na płytkach oglądano pod lampą UV przy 365 nm.

(a)

(b)

(c)

(d)

gdzie: * identyfikowany N-końcowy aminokwas; wymienione aminokwasy są zdansylowane.

Rysunek 2. – rozdział chromatograficzny płytek w świetle UV (obraz przekonwertowano na odcienie szarości,

ciemne obszary to większa fluorescencja): (a) fluorescencja DNS-aminokwasów (wzorzec), (b) fluorescencja

hydrolizatu peptydu (badana próbka), (c) opisany schemat wzorca, (d) opisany schemat badanej próbki.

Obliczenia współczynników rozdziału DNS-aminokwasów

, Arg

układ 1



, cm

 cm

 0,11

, Arg

układ 2



, cm

 cm

 0,60

, Gly

układ 1



, cm

 cm

 0,32

, Gly

układ 2



," cm

 cm

 0,47

, Pro

układ 1



,'( cm

 cm

 0,41

, Pro

układ 2



,) cm

 cm

 0,77

, *

układ 1



, cm

 cm

 0,33

, *

układ 2



, cm

 cm

 0,44

Współczynniki rozdziału * są zbliżone do współczynników rozdziału DNS-glicyny.

Ćwiczenie 6. Wnioski

pH roztworu z peptydem było równe 9 co pozwoliło na skuteczne oznaczenie N-końcowego

aminokwasu. Roztwory po dansylowaniu zmieniły kolor z żółtego na bezbarwny.

Badany peptyd P1 na N-końcu zawierał glicynę.

Załączniki

1.

Instrukcja „Ćwiczenie 5.” wraz z bieżącymi notatkami.

2.

Instrukcja „Ćwiczenie 6.” wraz z bieżącymi notatkami.

Układ 1

U

k

ła

d

2

Gly

Gly*

Pro

Arg

DNS

DNS

Układ 1

U

k

ła

d

2