Sprawozdanie 7.
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 1 z 5
Data zajęć: 2008/12/17
Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
mgr inż. Michał Jakób
ŚR, 16:10-18:45, F-4/C3
Ćwiczenie 9.
Kolorymetryczne oznaczanie stężenia
białka metodą Bradford.
Mateusz Jędrzejewski
grupa
mgr inż. Dominika Bystranowska
PT, 16:10-18:45, F-4/C3
Wstęp teoretyczny
Kolorymetria jest techniką analityczną wykorzystującą zdolność związków chemicznych
do absorbancji światła (np. VIS, UV) w celu oznaczania ich stężenia w roztworze. Zakłada się
często liniową zależność absorbancji od stężenia . Stosuje się wówczas prawo Lamberta-
Beera (1), gdzie to współczynnik ekstynkcji (absorbancji), a to długość drogi optycznej.
· ·
(1)
Zawsze należy sporządzić krzywą standardową (jest to zależność absorbancji
od stężenia/masy/liczności) dla danego związku który się oznacza.
Jedną z metoda kolorymetrycznego oznaczania stężenia białka jest metoda Bradford. Opiera
się ona na wiązaniu barwnika Coomassie Brilliant Blue G-250 z białkiem. Barwnik ten występuje
w trzech różnych formach jonowych. Zależy to od uprotonowania barwnika, czyli od pH
roztworu. Forma I koloru czerwonego dominuje przy pH < 0,5. Forma II koloru zielonego
dominuje w zakresie 1< pH < 2. Forma III koloru niebieskiego dominuje w 3 < pH < 9. Barwnik
związany z białkiem ma kolor niebieski. Widmo absorbancji kompleksu posiada dwa maksima,
jedno przy 465 nm dla formy kationowej, drugie przy 595 nm dla formy anionowej.
Na tej podstawie można szacować ubytek barwnika, a przez to stężenia białka w roztworze.
Białko poprzez reszty arginylowe, aromatyczne i lizynowe oddziałuje z barwnikiem
(jest to proces odwracalny). Siła tego specyficznego oddziaływania zależy od stężenia
oznaczanego białka. Jest to jednocześnie prosta i czuła metoda kolorymetryczna.
Zabarwienie utrzymuje się do 90 minut. Pozwala oznaczać od 1 do 50 μl białka.
Na oznaczanie nie mają wpływu kwasy nukleinowe obecne w roztworze. Natomiast wrażliwa
jest do obecność surfaktantów. Różne białka, ale o identycznym stężeniu mogą dawać bardzo
różne intensywności zabarwienia po reakcji z barwnikiem.
Protokół
Do probówki dodano 2 ml buforu (10mM Tris, 100mM NaCl, pH 7,0). Wyzerowano
spektrofotometr. Do probówki dodano 0,5 ml standardu białkowego (roztwór
immunoglobuliny G). Zmierzono absorbancję roztworu przy 280 nm.
0,2366
,%
· ·
gdzie:
,%
1,5
ml
mg·cm
1 cm
Stężenia białka standardowego w badanej próbce:
,%
·
0,2366
1,5 · 1
0,158
mg
ml
Sprawozdanie 7.
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 2 z 5
Data zajęć: 2008/12/17
Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
mgr inż. Michał Jakób
ŚR, 16:10-18:45, F-4/C3
Ćwiczenie 9.
Kolorymetryczne oznaczanie stężenia
białka metodą Bradford.
Mateusz Jędrzejewski
grupa
mgr inż. Dominika Bystranowska
PT, 16:10-18:45, F-4/C3
Stężenia wyjściowe białka standardowego:
standardu
$ V
buforu
standardu
0,5 $ 2,0
0,5
5
·
5 · 0,158 0,79
mg
ml
0,79
µg
µl
Przygotowano 15 ponumerowanych próbówek. Zgodnie z tabelami 1., 2. oraz 3.
przygotowano roztwory w kolejnych próbkach.
Tabela 1. – Przygotowanie roztworów standardu
nr próbki
standardu
,µl-
.
standardu
,µg-
V
buforu
,µl-
1
0
0,00
100
2
2
1,58
98
3
3
2,37
97
4
6
4,73
94
5
13
10,25
87
6
25
19,72
75
7
51
40,22
49
gdzie: .
standardu
to rzeczywista masa standardu
Tabela 2. – Przygotowanie roztworów immunoglobuliny G o nieznanym stężeniu
nr próbki
IgG
,µl-
V
buforu
,µl-
8
10
90
9
20
80
10
40
60
11
60
40
Tabela 3. – Przygotowanie roztworów białka w obecności SDS
nr próbki
standardu
,µl-
V
buforu
,µl-
V
SDS
,µl-
C
SDS
4w/v8
12
13
87
0
0,0 %
13
13
77
10
1,0 %
14
13
67
20
2,0 %
15
13
37
50
5,0 %
gdzie: .
standardu
10 µg
standardu
9
standardu
:
standardu
,;<
12,7 µg = 13 µg
Stężenie wyjściowe C
SDS
10% 4w/v8
Objętość całkowita próbki
>
standardu
$ V
buforu
$ V
SDS
100 µl
?
@
A
SDS
A
SDS
(dla V
SDS
B 0)
Stężenie w próbce:
C
SDS
C
SDS
D
E
%·A
SDS
A
SDS
%
Sprawozdanie 7.
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 3 z 5
Data zajęć: 2008/12/17
Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
mgr inż. Michał Jakób
ŚR, 16:10-18:45, F-4/C3
Ćwiczenie 9.
Kolorymetryczne oznaczanie stężenia
białka metodą Bradford.
Mateusz Jędrzejewski
grupa
mgr inż. Dominika Bystranowska
PT, 16:10-18:45, F-4/C3
Do przygotowanych 15 probówek dodano po 2 ml odczynnika Bradford (Coomassie Brilliant
Blue G-250). Roztwory delikatnie wymieszano. Odczekano 5 minut. Spektrofotometr
wyzerowano przy 595 nm na bufor standardowy. Zmierzono absorbancję 15 próbek przy
595 nm. Zerowano i pomiary powtórzono dla 465 nm. Wyniki umieszono w tabeli 4. oraz 5a.
Wyniki
Wyznaczane ilorazy
F<F
/
GHF
dają dobra linearyzację wyników metody Bradford.
Tabela 4. – Absorbancja dla roztworów standardu
nr próbki
.
standardu
,µg-
standardu
,µl-
F<F
GHF
F<F
/
GHF
1
0,00
0
0,674
1,172
0,58
2
1,58
2
0,671
1,135
0,59
3
2,37
3
0,722
1,158
0,62
4
4,73
6
0,846
1,136
0,74
5
10,25
13
0,926
1,032
0,90
6
19,72
25
1,084
0,983
1,10
7*
40,22
51
1,536
0,744
2,06
gdzie: .
standardu
to rzeczywista masa standardu
* przy obliczeniu regresji liniowej (Wykres 1.) pominięty punkt pomiarowy próbki 7.
ponieważ jest znacznie oddalony od prostej wyznaczonej przez pozostałe punkty.
Wykres 1. – Krzywa standardowa IgG
Wyznaczono równanie regresji z wykresu 1.:
F<F
/
GHF
0,0278 · .
standardu
$ 0,5764
więc:
.
x
F<F
/
GHF
K 0,5764
0,0278
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
A
5
9
5
/A
4
6
5
m
standardu
[μg]
Sprawozdanie 7.
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 4 z 5
Data zajęć: 2008/12/17
Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
mgr inż. Michał Jakób
ŚR, 16:10-18:45, F-4/C3
Ćwiczenie 9.
Kolorymetryczne oznaczanie stężenia
białka metodą Bradford.
Mateusz Jędrzejewski
grupa
mgr inż. Dominika Bystranowska
PT, 16:10-18:45, F-4/C3
Tabela 5a. – Obliczenia stężeń białek w badanych próbkach
nr
próbki*
,
F<F
/
GHF
L4. ,µg-8
F<F
GHF
F<F
/
GHF
.
x
,µg-
x
,µl-
x
,µg/µl-
8
0,715
1,146
0,624
1,71
10
0,17
9
0,736
1,115
0,660
3,01
20
0,15
10
0,834
1,099
0,759
6,56
40
0,16
11
0,901
1,049
0,859
10,16
60
0,17
12
0,920
1,020
0,902
11,71
13
0,90
13
1,174
0,788
1,490
32,86
13
2,53
14
1,158
0,789
1,468
32,06
13
2,47
15
1,154
0,782
1,476
32,35
13
2,49
gdzie:
M
9
x
?
x
* 8-11 to próbki z immunoglobuliną G o nieznanym stężeniu, 12-15 to próbki z SDS.
Tabela 5b. – Obliczenia stężeń białek w próbkach badanych przez inne grupy
nr
próbki*
,
F<F
/
GHF
L4. ,µg-8
F<F
GHF
F<F
/
GHF
.
x
,µg-
x
,µl-
x
,µg/µl-
16**
0,764
1,069
0,715
4,97
10
0,50
17
0,779
1,107
0,704
4,58
20
0,23
18
0,929
1,027
0,905
11,80
40
0,30
19
0,966
1,012
0,955
13,60
60
0,23
20**
0,785
1,685
0,466
-3,98
10
-0,40
21
0,950
1,074
0,885
11,08
20
0,55
22**
1,490
0,777
1,918
48,25
40
1,21
23
1,265
0,907
1,395
29,44
60
0,49
24
0,920
1,059
0,869
10,52
13
0,81
25
0,944
1,042
0,906
11,85
13
0,91
26
0,894
1,066
0,839
9,43
13
0,73
27
0,872
1,086
0,803
8,15
13
0,63
gdzie:
M
9
x
?
x
* 16-19 to próbki z lizozymem, 20-23 to próbki z albuminą wołową, 24-27 to próbki z NaCl.
** odrzucone pomiary, ponieważ ich wyniki znacznie różnią się od pozostałych w serii.
Wyznaczona ujemna wartość stężenia w próbce 20 nie na sensu chemicznego. Pomiar
wykonano względem innej krzywej standardowej niż odniesiono w obliczeniach (*).
Wnioski
Na podstawie przeprowadzonych eksperymentów udało się oznaczyć stężenia białek
(tabela 6a.). Wyznaczono stężenia immunoglobuliny G w badanej próbce na 0,16 μg/μl.
Stężenie to jest właściwie określone ponieważ korzystano z krzywej standardowej (wykres 1.)
dla immunoglobuliny G. Takie samo białko w kompleksie białko-barwnik absorbuje zależnie
od swojego stężenia. Natomiast wyznaczone stężenia lizozymu i albuminy wołowej odpowiednio
na 0,25 μg/μl i 0,52 μg/μl są wyznaczone niewłaściwie. Odnoszono się cały czas do krzywej
standardowej (wykres 1.) dla immunoglobuliny G. Lizozym jednak słabiej oddziałuje
z barwnikiem Bradford. Białko to posiada silnie naładowaną powierzchnię. Rzeczywiste
Sprawozdanie 7.
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 5 z 5
Data zajęć: 2008/12/17
Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
mgr inż. Michał Jakób
ŚR, 16:10-18:45, F-4/C3
Ćwiczenie 9.
Kolorymetryczne oznaczanie stężenia
białka metodą Bradford.
Mateusz Jędrzejewski
grupa
mgr inż. Dominika Bystranowska
PT, 16:10-18:45, F-4/C3
stężenia lizozymu jest więc większe niż oznaczone. Z kolei albumina wołowa silniej oddziałuje
z barwnikiem Bradford niż IgG, więc rzeczywiste jest mniejsze niż oznaczone.
Tabela 6a. – Oznaczone stężenia białek
białko
stężenia* białka
,µg/µl-
IgG
0,16
lizozym
0,25
albumina wołowa
0,52
gdzie: * to średnia arytmetyczna odpowiednich stężeń (z tabeli 5a i 5b) bez odrzuconych.
Zbadano także wpływ SDS (czynnika denaturującego) oraz NaCl (zmiana siły jonowej
roztworu) na oznaczane stężenia białka metodą Bradford. Wyniki zebrano w tabeli 6b. Każda
próbka miała identyczne stężenia białka, więc oznaczane stężenia również powinny być
identyczne. Tak nie jest. Na oddziaływanie białko-barwnik wpływa roztwór w którym się
znajdują. Denaturacja białka, przez dodanie SDS, powoduję ekspozycję grupy hydrofobowych
na powierzchnię białka. Zmienia się naładowanie i zwiększa się powierzchnia oddziaływania
białka z roztworem. Zgodnie z oczekiwaniami dodatek SDS powoduje zwiększenie
oddziaływania białko-barwnik. Więcej barwnika jest wiązane z białkiem, a przez to oznaczane
stężenie białka są zawyżone. Już niewielkie stężenie SDS (1,0% (w/v)) powoduje denaturację.
Efekt ten utrzymuje się dla użytych większych stężeń SDS.
Zwiększenie siły jonowej roztworu, przez dodanie NaCl, również zmienia oddziaływanie
białko-barwnik. Efekt ten widoczny jest najbardziej dla 1,5 M NaCl. Oznaczane stężenia białka
jest niższe niż rzeczywiste. Jest to spowodowane słabszym oddziaływaniem białko-barwnik.
Tabela 6b. – Oznaczone stężenia białek
nr
próbki
stężenie
SDS/NaCl
oznaczone
stężenie
białka
,µg/µl-
12
0,0 %
0,90
13
1,0 %
2,53
14
2,0 %
2,47
15
5,0 %
2,49
24
0,0 M
0,81
25
0,3 M
0,91
26
0,6 M
0,73
27
1,5 M
0,63
Ważnym aspektem (*) jest to, że wyniki absorbancji próbek dla lizozymu, albuminy wołowej
oraz standardu białkowego w obecności NaCl pochodzą z innych grup. Zachowanie
identyczności próbkowania oraz czasu inkubacji są mniejsze niż w obrębie serii pomiarowej
dla jeden grupy. Jednak każda grupa korzystała z takiej samej instrukcji do wykonania ćwiczenia.