Sprawozdanie 7.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 1 z 5
Data zajęć: 2008/12/17

Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
mgr inż. Michał Jakób
ŚR, 16:10-18:45, F-4/C3

Ćwiczenie 9.

Kolorymetryczne oznaczanie stężenia

białka metodą Bradford.

Mateusz Jędrzejewski
grupa
mgr inż. Dominika Bystranowska
PT, 16:10-18:45, F-4/C3

Wstęp teoretyczny

Kolorymetria jest techniką analityczną wykorzystującą zdolność związków chemicznych

do absorbancji światła (np. VIS, UV) w celu oznaczania ich stężenia w roztworze. Zakłada się

często liniową zależność absorbancji
od stężenia . Stosuje się wówczas prawo Lamberta-

Beera (1), gdzie  to współczynnik ekstynkcji (absorbancji), a  to długość drogi optycznej.

  ·  · 

(1)

Zawsze należy sporządzić krzywą standardową (jest to zależność absorbancji

od stężenia/masy/liczności) dla danego związku który się oznacza.

Jedną z metoda kolorymetrycznego oznaczania stężenia białka jest metoda Bradford. Opiera

się ona na wiązaniu barwnika Coomassie Brilliant Blue G-250 z białkiem. Barwnik ten występuje

w trzech różnych formach jonowych. Zależy to od uprotonowania barwnika, czyli od pH

roztworu. Forma I koloru czerwonego dominuje przy pH < 0,5. Forma II koloru zielonego

dominuje w zakresie 1< pH < 2. Forma III koloru niebieskiego dominuje w 3 < pH < 9. Barwnik

związany z białkiem ma kolor niebieski. Widmo absorbancji kompleksu posiada dwa maksima,

jedno przy 465 nm dla formy kationowej, drugie przy 595 nm dla formy anionowej.

Na tej podstawie można szacować ubytek barwnika, a przez to stężenia białka w roztworze.

Białko poprzez reszty arginylowe, aromatyczne i lizynowe oddziałuje z barwnikiem

(jest to proces odwracalny). Siła tego specyficznego oddziaływania zależy od stężenia

oznaczanego białka. Jest to jednocześnie prosta i czuła metoda kolorymetryczna.

Zabarwienie utrzymuje się do 90 minut. Pozwala oznaczać od 1 do 50 μl białka.

Na oznaczanie nie mają wpływu kwasy nukleinowe obecne w roztworze. Natomiast wrażliwa

jest do obecność surfaktantów. Różne białka, ale o identycznym stężeniu mogą dawać bardzo

różne intensywności zabarwienia po reakcji z barwnikiem.

Protokół

Do probówki dodano 2 ml buforu (10mM Tris, 100mM NaCl, pH 7,0). Wyzerowano

spektrofotometr. Do probówki dodano 0,5 ml standardu białkowego (roztwór

immunoglobuliny G). Zmierzono absorbancję roztworu przy 280 nm.



 0,2366





,%

·  · 

gdzie:



,%

 1,5

ml

mg·cm

  1 cm

Stężenia białka standardowego w badanej próbce:











,%

· 



0,2366

1,5 · 1

 0,158

mg

ml

Sprawozdanie 7.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 2 z 5
Data zajęć: 2008/12/17

Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
mgr inż. Michał Jakób
ŚR, 16:10-18:45, F-4/C3

Ćwiczenie 9.

Kolorymetryczne oznaczanie stężenia

białka metodą Bradford.

Mateusz Jędrzejewski
grupa
mgr inż. Dominika Bystranowska
PT, 16:10-18:45, F-4/C3

Stężenia wyjściowe białka standardowego:

 



standardu

$ V

buforu



standardu



0,5 $ 2,0

0,5

 5

   · 



 5 · 0,158  0,79

mg

ml

 0,79

µg

µl

Przygotowano 15 ponumerowanych próbówek. Zgodnie z tabelami 1., 2. oraz 3.

przygotowano roztwory w kolejnych próbkach.

Tabela 1. – Przygotowanie roztworów standardu

nr próbki



standardu

,µl-

.

standardu

,µg-

V

buforu

,µl-

1

0

0,00

100

2

2

1,58

98

3

3

2,37

97

4

6

4,73

94

5

13

10,25

87

6

25

19,72

75

7

51

40,22

49

gdzie: .

standardu

to rzeczywista masa standardu

Tabela 2. – Przygotowanie roztworów immunoglobuliny G o nieznanym stężeniu

nr próbki



IgG

,µl-

V

buforu

,µl-

8

10

90

9

20

80

10

40

60

11

60

40

Tabela 3. – Przygotowanie roztworów białka w obecności SDS

nr próbki



standardu

,µl-

V

buforu

,µl-

V

SDS

,µl-

C

SDS

4w/v8

12

13

87

0

0,0 %

13

13

77

10

1,0 %

14

13

67

20

2,0 %

15

13

37

50

5,0 %

gdzie: .

standardu

 10 µg



standardu



9

standardu

:

standardu





,;<

 12,7 µg = 13 µg

Stężenie wyjściowe C

SDS

 10% 4w/v8

Objętość całkowita próbki 

>

 

standardu

$ V

buforu

$ V

SDS

 100 µl

 

?

@

A

SDS





A

SDS

(dla V

SDS

B 0)

Stężenie w próbce:

C

SDS



C

SDS

D

E



 %·A

SDS





A

SDS



%

Sprawozdanie 7.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 3 z 5
Data zajęć: 2008/12/17

Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
mgr inż. Michał Jakób
ŚR, 16:10-18:45, F-4/C3

Ćwiczenie 9.

Kolorymetryczne oznaczanie stężenia

białka metodą Bradford.

Mateusz Jędrzejewski
grupa
mgr inż. Dominika Bystranowska
PT, 16:10-18:45, F-4/C3

Do przygotowanych 15 probówek dodano po 2 ml odczynnika Bradford (Coomassie Brilliant

Blue G-250). Roztwory delikatnie wymieszano. Odczekano 5 minut. Spektrofotometr

wyzerowano przy 595 nm na bufor standardowy. Zmierzono absorbancję 15 próbek przy

595 nm. Zerowano i pomiary powtórzono dla 465 nm. Wyniki umieszono w tabeli 4. oraz 5a.

Wyniki

Wyznaczane ilorazy

F<F

/

GHF

dają dobra linearyzację wyników metody Bradford.

Tabela 4. – Absorbancja dla roztworów standardu

nr próbki

.

standardu

,µg-



standardu

,µl-

F<F

GHF

F<F

/

GHF

1

0,00

0

0,674

1,172

0,58

2

1,58

2

0,671

1,135

0,59

3

2,37

3

0,722

1,158

0,62

4

4,73

6

0,846

1,136

0,74

5

10,25

13

0,926

1,032

0,90

6

19,72

25

1,084

0,983

1,10

7*

40,22

51

1,536

0,744

2,06

gdzie: .

standardu

to rzeczywista masa standardu

* przy obliczeniu regresji liniowej (Wykres 1.) pominięty punkt pomiarowy próbki 7.

ponieważ jest znacznie oddalony od prostej wyznaczonej przez pozostałe punkty.

Wykres 1. – Krzywa standardowa IgG

Wyznaczono równanie regresji z wykresu 1.:

F<F

/

GHF

 0,0278 · .

standardu

$ 0,5764

więc:

.

x



F<F

/

GHF

K 0,5764

0,0278

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

A

5

9

5

/A

4

6

5

m

standardu

[μg]

Sprawozdanie 7.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 4 z 5
Data zajęć: 2008/12/17

Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
mgr inż. Michał Jakób
ŚR, 16:10-18:45, F-4/C3

Ćwiczenie 9.

Kolorymetryczne oznaczanie stężenia

białka metodą Bradford.

Mateusz Jędrzejewski
grupa
mgr inż. Dominika Bystranowska
PT, 16:10-18:45, F-4/C3

Tabela 5a. – Obliczenia stężeń białek w badanych próbkach

nr

próbki*

,

F<F

/

GHF

 L4. ,µg-8

F<F

GHF

F<F

/

GHF

.

x

,µg-



x

,µl-



x

,µg/µl-

8

0,715

1,146

0,624

1,71

10

0,17

9

0,736

1,115

0,660

3,01

20

0,15

10

0,834

1,099

0,759

6,56

40

0,16

11

0,901

1,049

0,859

10,16

60

0,17

12

0,920

1,020

0,902

11,71

13

0,90

13

1,174

0,788

1,490

32,86

13

2,53

14

1,158

0,789

1,468

32,06

13

2,47

15

1,154

0,782

1,476

32,35

13

2,49

gdzie: 

M



9

x

?

x

* 8-11 to próbki z immunoglobuliną G o nieznanym stężeniu, 12-15 to próbki z SDS.

Tabela 5b. – Obliczenia stężeń białek w próbkach badanych przez inne grupy

nr

próbki*

,

F<F

/

GHF

 L4. ,µg-8

F<F

GHF

F<F

/

GHF

.

x

,µg-



x

,µl-



x

,µg/µl-

16**

0,764

1,069

0,715

4,97

10

0,50

17

0,779

1,107

0,704

4,58

20

0,23

18

0,929

1,027

0,905

11,80

40

0,30

19

0,966

1,012

0,955

13,60

60

0,23

20**

0,785

1,685

0,466

-3,98

10

-0,40

21

0,950

1,074

0,885

11,08

20

0,55

22**

1,490

0,777

1,918

48,25

40

1,21

23

1,265

0,907

1,395

29,44

60

0,49

24

0,920

1,059

0,869

10,52

13

0,81

25

0,944

1,042

0,906

11,85

13

0,91

26

0,894

1,066

0,839

9,43

13

0,73

27

0,872

1,086

0,803

8,15

13

0,63

gdzie: 

M



9

x

?

x

* 16-19 to próbki z lizozymem, 20-23 to próbki z albuminą wołową, 24-27 to próbki z NaCl.

** odrzucone pomiary, ponieważ ich wyniki znacznie różnią się od pozostałych w serii.

Wyznaczona ujemna wartość stężenia w próbce 20 nie na sensu chemicznego. Pomiar
wykonano względem innej krzywej standardowej niż odniesiono w obliczeniach (*).

Wnioski

Na podstawie przeprowadzonych eksperymentów udało się oznaczyć stężenia białek

(tabela 6a.). Wyznaczono stężenia immunoglobuliny G w badanej próbce na 0,16 μg/μl.

Stężenie to jest właściwie określone ponieważ korzystano z krzywej standardowej (wykres 1.)

dla immunoglobuliny G. Takie samo białko w kompleksie białko-barwnik absorbuje zależnie

od swojego stężenia. Natomiast wyznaczone stężenia lizozymu i albuminy wołowej odpowiednio

na 0,25 μg/μl i 0,52 μg/μl są wyznaczone niewłaściwie. Odnoszono się cały czas do krzywej

standardowej (wykres 1.) dla immunoglobuliny G. Lizozym jednak słabiej oddziałuje

z barwnikiem Bradford. Białko to posiada silnie naładowaną powierzchnię. Rzeczywiste

Sprawozdanie 7.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 5 z 5
Data zajęć: 2008/12/17

Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
mgr inż. Michał Jakób
ŚR, 16:10-18:45, F-4/C3

Ćwiczenie 9.

Kolorymetryczne oznaczanie stężenia

białka metodą Bradford.

Mateusz Jędrzejewski
grupa
mgr inż. Dominika Bystranowska
PT, 16:10-18:45, F-4/C3

stężenia lizozymu jest więc większe niż oznaczone. Z kolei albumina wołowa silniej oddziałuje

z barwnikiem Bradford niż IgG, więc rzeczywiste jest mniejsze niż oznaczone.

Tabela 6a. – Oznaczone stężenia białek

białko

stężenia* białka

,µg/µl-

IgG

0,16

lizozym

0,25

albumina wołowa

0,52

gdzie: * to średnia arytmetyczna odpowiednich stężeń (z tabeli 5a i 5b) bez odrzuconych.

Zbadano także wpływ SDS (czynnika denaturującego) oraz NaCl (zmiana siły jonowej

roztworu) na oznaczane stężenia białka metodą Bradford. Wyniki zebrano w tabeli 6b. Każda

próbka miała identyczne stężenia białka, więc oznaczane stężenia również powinny być

identyczne. Tak nie jest. Na oddziaływanie białko-barwnik wpływa roztwór w którym się

znajdują. Denaturacja białka, przez dodanie SDS, powoduję ekspozycję grupy hydrofobowych

na powierzchnię białka. Zmienia się naładowanie i zwiększa się powierzchnia oddziaływania

białka z roztworem. Zgodnie z oczekiwaniami dodatek SDS powoduje zwiększenie

oddziaływania białko-barwnik. Więcej barwnika jest wiązane z białkiem, a przez to oznaczane

stężenie białka są zawyżone. Już niewielkie stężenie SDS (1,0% (w/v)) powoduje denaturację.

Efekt ten utrzymuje się dla użytych większych stężeń SDS.

Zwiększenie siły jonowej roztworu, przez dodanie NaCl, również zmienia oddziaływanie

białko-barwnik. Efekt ten widoczny jest najbardziej dla 1,5 M NaCl. Oznaczane stężenia białka

jest niższe niż rzeczywiste. Jest to spowodowane słabszym oddziaływaniem białko-barwnik.

Tabela 6b. – Oznaczone stężenia białek

nr

próbki

stężenie

SDS/NaCl

oznaczone

stężenie

białka

,µg/µl-

12

0,0 %

0,90

13

1,0 %

2,53

14

2,0 %

2,47

15

5,0 %

2,49

24

0,0 M

0,81

25

0,3 M

0,91

26

0,6 M

0,73

27

1,5 M

0,63

Ważnym aspektem (*) jest to, że wyniki absorbancji próbek dla lizozymu, albuminy wołowej

oraz standardu białkowego w obecności NaCl pochodzą z innych grup. Zachowanie

identyczności próbkowania oraz czasu inkubacji są mniejsze niż w obrębie serii pomiarowej

dla jeden grupy. Jednak każda grupa korzystała z takiej samej instrukcji do wykonania ćwiczenia.