Sprawozdanie 6.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 1 z 5
Data zajęć: 2008/12/05

Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
mgr inż. Tomasz Krusiński
PT, 16:10-18:45, F-4/C3

Ćwiczenie 8.

Zastosowanie widm różnicowych

w badaniach zmian konformacyjnych białek.

Wyznaczanie ∆G

o

denaturacji BSA.

Grupa III
Dorota Druszkowska
Marcin Milewicz
Anna Wojczuk
Grupa IV
Anna Dawiec
Mateusz Jędrzejewski
Aleksandra Korkuś

Wyniki

Tabela 1. – Obliczenia dla roztworu BSA w kuwecie pomiarowej (2) oraz w preparacie wyjściowym (1)

uwagi



µl

1500

-





4

-





µl

375











 





0,30

odczyt ze spektrofotometru



BSA

mg/ml

0,455



BSA











,%

·#



BSA



mg/ml

1,82



BSA



 



· 

BSA

gdzie: masowy współczynnik ekstynkcji BSA (przy 280 nm):





,%

 0,66

ml

mg·cm

długość drogi optycznej (szerokość kuwety):

'  1 cm

Tabela 2. – Obliczenia dla roztworów BSA w GdmCl

c

GdmCl

M



µl

V

GdmCl

µl

BSA

µl

V

buforu

µl

0,0

1500

0

824

676

0,4

1500

86

824

590

0,8

1500

171

824

504

1,0

1500

214

824

462

1,2

1500

257

824

419

1,6

1500

343

824

333

1,8

1500

386

824

290

2,2

1500

471

824

204

2,6

1500

557

824

119

3,0

1500

643

824

33

gdzie:

V

GdmCl



3

GdmCl

3

7M GdmCl

·





3

GdmCl

5

· 1500  214 · c

GdmCl

BSA



9BSA

9BSA



·







,

· 1500  824 µl

V

buforu





; <V

GdmCl

=

BSA

>  1500 ; V

GdmCl

; 824  676 ; V

GdmCl

Sprawozdanie 6.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 2 z 5
Data zajęć: 2008/12/05

Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium

Ćwiczenie 8.

Grupa III
Grupa IV

Tabela 3. – Obliczenia widm różnicowych dla BSA we wzrastających stężeniach GdmCl

?

nm 0,4 M

0,8 M 1,0 M 1,2 M 1,6 M 1,8 M 2,2 M 2,6 M 3,0 M

330

0,00000

0,00000

0,00000

0,00000

0,00000

0,00000

0,00000

0,00000

0,00000

329

0,00039

0,00023

0,00036

0,00018

0,00035

0,00025

0,00031

0,00016

-0,00002

328

0,00063

0,00050

0,00064

0,00040

0,00066

0,00036

0,00051

0,00019

-0,00015

327

0,00063

0,00063

0,00081

0,00050

0,00083

0,00038

0,00066

0,00028

-0,00044

326

0,00057

0,00077

0,00082

0,00059

0,00094

0,00029

0,00065

0,00026

-0,00070

325

0,00071

0,00095

0,00092

0,00077

0,00107

0,00035

0,00084

0,00046

-0,00078

324

0,00094

0,00122

0,00119

0,00095

0,00125

0,00036

0,00115

0,00060

-0,00085

323

0,00133

0,00154

0,00144

0,00126

0,00156

0,00061

0,00147

0,00085

-0,00082

322

0,00142

0,00164

0,00159

0,00142

0,00171

0,00075

0,00159

0,00090

-0,00098

321

0,00147

0,00166

0,00160

0,00155

0,00184

0,00093

0,00158

0,00093

-0,00127

320

0,00163

0,00173

0,00171

0,00171

0,00209

0,00093

0,00175

0,00105

-0,00154

319

0,00180

0,00185

0,00183

0,00184

0,00224

0,00116

0,00186

0,00101

-0,00171

318

0,00191

0,00202

0,00186

0,00201

0,00238

0,00121

0,00196

0,00105

-0,00190

317

0,00199

0,00222

0,00194

0,00220

0,00251

0,00132

0,00219

0,00116

-0,00209

316

0,00194

0,00220

0,00186

0,00210

0,00255

0,00121

0,00220

0,00113

-0,00240

315

0,00182

0,00209

0,00182

0,00219

0,00257

0,00105

0,00218

0,00100

-0,00279

314

0,00186

0,00207

0,00183

0,00210

0,00263

0,00106

0,00210

0,00091

-0,00324

313

0,00178

0,00197

0,00163

0,00207

0,00262

0,00098

0,00208

0,00076

-0,00372

312

0,00170

0,00198

0,00151

0,00196

0,00258

0,00092

0,00197

0,00062

-0,00424

311

0,00156

0,00188

0,00135

0,00198

0,00251

0,00070

0,00189

0,00049

-0,00480

310

0,00141

0,00169

0,00111

0,00190

0,00222

0,00052

0,00161

0,00019

-0,00546

309

0,00108

0,00141

0,00086

0,00168

0,00212

0,00029

0,00140

-0,00020

-0,00618

308

0,00075

0,00110

0,00041

0,00142

0,00170

-0,00022

0,00103

-0,00072

-0,00718

307

0,00026

0,00081

0,00001

0,00114

0,00145

-0,00064

0,00063

-0,00128

-0,00831

306

-0,00021

0,00054

-0,00048

0,00097

0,00112

-0,00103

0,00014

-0,00173

-0,00944

305

-0,00079

0,00009

-0,00105

0,00049

0,00076

-0,00153

-0,00062

-0,00243

-0,01093

304

-0,00135

-0,00029

-0,00162

0,00026

0,00031

-0,00202

-0,00134

-0,00322

-0,01248

303

-0,00201

-0,00074

-0,00217

-0,00013

-0,00012

-0,00252

-0,00203

-0,00408

-0,01421

302

-0,00294

-0,00122

-0,00293

-0,00064

-0,00072

-0,00319

-0,00298

-0,00521

-0,01626

301

-0,00399

-0,00177

-0,00368

-0,00128

-0,00141

-0,00388

-0,00393

-0,00653

-0,01847

300

-0,00520

-0,00241

-0,00456

-0,00188

-0,00221

-0,00479

-0,00527

-0,00823

-0,02126

299

-0,00647

-0,00305

-0,00545

-0,00255

-0,00313

-0,00568

-0,00696

-0,01017

-0,02443

298

-0,00803

-0,00395

-0,00664

-0,00336

-0,00420

-0,00704

-0,00927

-0,01260

-0,02811

297

-0,01018

-0,00520

-0,00821

-0,00457

-0,00573

-0,00884

-0,01242

-0,01581

-0,03297

296

-0,01242

-0,00635

-0,00971

-0,00575

-0,00730

-0,01094

-0,01637

-0,01979

-0,03860

295

-0,01512

-0,00767

-0,01136

-0,00720

-0,00932

-0,01339

-0,02137

-0,02518

-0,04610

294

-0,01789

-0,00859

-0,01273

-0,00843

-0,01128

-0,01619

-0,02744

-0,03172

-0,05514

293

-0,02130

-0,00979

-0,01451

-0,00998

-0,01368

-0,01975

-0,03499

-0,04014

-0,06671

292

-0,02448

-0,01028

-0,01594

-0,01109

-0,01601

-0,02341

-0,04364

-0,04985

-0,07999

291

-0,02753

-0,01032

-0,01685

-0,01173

-0,01813

-0,02717

-0,05336

-0,06090

-0,09487

290

-0,03046

-0,00999

-0,01759

-0,01215

-0,02012

-0,03096

-0,06410

-0,07280

-0,11086

289

-0,03355

-0,00957

-0,01775

-0,01222

-0,02153

-0,03451

-0,07470

-0,08462

-0,12656

288

-0,03646

-0,00915

-0,01783

-0,01195

-0,02236

-0,03702

-0,08322

-0,09360

-0,13937

287

-0,03937

-0,00892

-0,01790

-0,01160

-0,02267

-0,03770

-0,08768

-0,09701

-0,14594

286

-0,04218

-0,00873

-0,01814

-0,01129

-0,02212

-0,03624

-0,08673

-0,09280

-0,14437

285

-0,04458

-0,00882

-0,01847

-0,01086

-0,02105

-0,03323

-0,08144

-0,08252

-0,13530

284

-0,04586

-0,00837

-0,01843

-0,01019

-0,01970

-0,02956

-0,07400

-0,06994

-0,12322

283

-0,04640

-0,00796

-0,01815

-0,00948

-0,01848

-0,02657

-0,06819

-0,06049

-0,11405

282

-0,04690

-0,00763

-0,01813

-0,00926

-0,01793

-0,02543

-0,06618

-0,05677

-0,11109

281

-0,04755

-0,00752

-0,01810

-0,00911

-0,01779

-0,02570

-0,06721

-0,05750

-0,11308

280

-0,04822

-0,00723

-0,01803

-0,00889

-0,01741

-0,02605

-0,06851

-0,05861

-0,11535

279

-0,04860

-0,00689

-0,01781

-0,00857

-0,01687

-0,02565

-0,06766

-0,05685

-0,11414

278

-0,04867

-0,00669

-0,01739

-0,00803

-0,01571

-0,02371

-0,06387

-0,05081

-0,10755

277

-0,04817

-0,00686

-0,01729

-0,00784

-0,01451

-0,02127

-0,05793

-0,04197

-0,09776

276

-0,04768

-0,00721

-0,01730

-0,00792

-0,01347

-0,01884

-0,05168

-0,03315

-0,08777

275

-0,04708

-0,00778

-0,01772

-0,00838

-0,01304

-0,01721

-0,04689

-0,02648

-0,08038

274

-0,04671

-0,00826

-0,01803

-0,00909

-0,01288

-0,01629

-0,04345

-0,02245

-0,07546

273

-0,04586

-0,00805

-0,01808

-0,00911

-0,01241

-0,01569

-0,04112

-0,01987

-0,07185

272

-0,04497

-0,00815

-0,01796

-0,00927

-0,01229

-0,01573

-0,03948

-0,01854

-0,06941

271

-0,04426

-0,00823

-0,01826

-0,00933

-0,01210

-0,01584

-0,03813

-0,01727

-0,06709

270

-0,04393

-0,00897

-0,01885

-0,01012

-0,01252

-0,01649

-0,03742

-0,01624

-0,06558

269

-0,04415

-0,01051

-0,02018

-0,01120

-0,01330

-0,01723

-0,03694

-0,01504

-0,06337

268

-0,04440

-0,01232

-0,02170

-0,01322

-0,01477

-0,01893

-0,03683

-0,01442

-0,06134

267

-0,04525

-0,01410

-0,02358

-0,01521

-0,01613

-0,02078

-0,03720

-0,01478

-0,06037

266

-0,04610

-0,01521

-0,02531

-0,01733

-0,01781

-0,02286

-0,03873

-0,01630

-0,06120

265

-0,04717

-0,01687

-0,02798

-0,01974

-0,01967

-0,02524

-0,04086

-0,01833

-0,06233

264

-0,04854

-0,01984

-0,03087

-0,02250

-0,02232

-0,02861

-0,04284

-0,02050

-0,06317

263

-0,05028

-0,02314

-0,03402

-0,02567

-0,02526

-0,03223

-0,04512

-0,02291

-0,06420

262

-0,05294

-0,02726

-0,03750

-0,02962

-0,02921

-0,03685

-0,04840

-0,02671

-0,06699

261

-0,05570

-0,03054

-0,04106

-0,03384

-0,03241

-0,04190

-0,05245

-0,03130

-0,07100

260

-0,05943

-0,03428

-0,04587

-0,03827

-0,03653

-0,04807

-0,05792

-0,03672

-0,07582

Sprawozdanie 6.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 3 z 5
Data zajęć: 2008/12/05

Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium

Ćwiczenie 8.

Grupa III
Grupa IV

Największa różnica między absorbancją BSA natywnego i w 3,0 M GdmCl jest dla 287 nm.

Δ

Cmax

 Δ

5 nm

 ;0,14594

Wykres 1. – Widma dla BSA w rosnących stężeniach GdmCl

260

270

280

290

300

310

320

330

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,0 M
0,4 M
0,8 M
1,0 M
1,2 M
1,6 M
1,8 M
2,2 M
2,6 M
3,0 M

A

b

s

o

rb

a

n

c

ja

Długo

ść

fali [nm]

Wykres 2. – Widma różnicowe dla BSA w rosnących stężeniach GdmCl względem białka natywnego

260

270

280

290

300

310

320

330

-0,15

-0,10

-0,05

0,00

0,05

0,4 M
0,8 M
1,0 M
1,2 M
1,6 M
1,8 M
2,2 M
2,6 M
3,0 M

R

ó

ż

n

ic

a

a

b

s

o

rb

a

n

c

ji

Długo

ść

fali [nm]

Sprawozdanie 6.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 4 z 5
Data zajęć: 2008/12/05

Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium

Ćwiczenie 8.

Grupa III
Grupa IV

Wykres 3. – Denaturacja BSA w rosnących stężeniach GdmCl

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

2,0

2,4

2,8

3,2

0,000

0,025

0,050

0,075

0,100

0,125

0,150

∆

A

2

8

7

n

m

C

GdmCl

[M]

Wyznaczono trzy proste reprezentujące 100% populacji cząsteczek natywnych (

G

H

) , przejście

denaturacyjne (

G) oraz 100% populacji cząsteczek rozfałdowanych (G

I

).

G

H

 0,00669 · c

GdmCl

= 0,00611

G  0,11072 · c

GdmCl

; 0,15733

G

I

 0,02334 · c

GdmCl

= 0,03634

Tabela 3. – Obliczenia ΔG

o

dla denaturacji BSA

c

GdmCl

M

G

H

G

G

I

J 

K

L

∆G°

O

J

mol

Q

1,74

0,01775

0,03532

0,07695

0,422

2138

1,77

0,01795

0,03864

0,07765

0,530

1572

1,80

0,01815

0,04197

0,07835

0,654

1051

1,83

0,01835

0,04529

0,07905

0,798

560

1,86

0,01855

0,04861

0,07975

0,965

88

gdzie:

∆G°  ;R · 'S J

  8,314

J

K·mol

R  298 K

Sprawozdanie 6.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 5 z 5
Data zajęć: 2008/12/05

Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium

Ćwiczenie 8.

Grupa III
Grupa IV

Wykres 4. – ΔG

o

denaturacji BSA

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

2,0

2,4

-5,00

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

∆

G

O

[

k

J

/m

o

l]

C

GdmCl

[M]

Wyznaczoną prostą i ekstrapolowano ją do 0,0 M GdmCl

∆G°  ;17,04 · c

GdmCl

= 31,75

Obliczono

∆G° denaturacji w 0,0 M GdmCl

∆G°  31,75

kJ

mol

Wnioski

Widma różnicowe pozwalają badać zmiany konformacyjne białek. Wykres 1. przedstawia

zależność absorbancji od długości fali dla różnych konformacji białka (od natywnej

do denaturowanej). Im białko bardziej denaturowane tym mniejsza absorbancja.

Absorbancje znormalizowano do 0 dla 330 nm. Największą różnicę (względem białka

natywnego) w absorbancji wyznaczono dla 287 nm na wykresie 2. Punkty te naniesiono

na wykres 3. różnicy absorbancji od stężenia denaturanta. Wyznaczono trzy proste

odpowiednio dla stanu natywnego, przejściowego i zdenaturowanego białka. Pominięto

skrajne punkty dla 0,4 M i 3,0 M ze względu na znaczne odstępstwo od trendu linowego.

Dla wybranych 5 stężeń denaturanta z fazy przejściowej obliczono stałe równowagi reakcji

denaturacji, a z nich

∆G° dla każdego stężenia. Punkty naniesiono na wykres 4. ∆G°

od stężenia denaturanta. Wyznaczono prostą i ekstrapolowaną ją do 0,0 M stężenia

denaturanta. Wyznaczona dodatnia wartość

∆G° wskazuje, że BSA nie ulega spontanicznej

denaturacji w warunkach standardowych.