Sprawozdanie 6.
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 1 z 5
Data zajęć: 2008/12/05
Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
mgr inż. Tomasz Krusiński
PT, 16:10-18:45, F-4/C3
Ćwiczenie 8.
Zastosowanie widm różnicowych
w badaniach zmian konformacyjnych białek.
Wyznaczanie ∆G
o
denaturacji BSA.
Grupa III
Dorota Druszkowska
Marcin Milewicz
Anna Wojczuk
Grupa IV
Anna Dawiec
Mateusz Jędrzejewski
Aleksandra Korkuś
Wyniki
Tabela 1. – Obliczenia dla roztworu BSA w kuwecie pomiarowej (2) oraz w preparacie wyjściowym (1)
uwagi
µl
1500
-
4
-
µl
375
0,30
odczyt ze spektrofotometru
BSA
mg/ml
0,455
BSA
,%
·#
BSA
mg/ml
1,82
BSA
·
BSA
gdzie: masowy współczynnik ekstynkcji BSA (przy 280 nm):
,%
0,66
ml
mg·cm
długość drogi optycznej (szerokość kuwety):
' 1 cm
Tabela 2. – Obliczenia dla roztworów BSA w GdmCl
c
GdmCl
M
µl
V
GdmCl
µl
BSA
µl
V
buforu
µl
0,0
1500
0
824
676
0,4
1500
86
824
590
0,8
1500
171
824
504
1,0
1500
214
824
462
1,2
1500
257
824
419
1,6
1500
343
824
333
1,8
1500
386
824
290
2,2
1500
471
824
204
2,6
1500
557
824
119
3,0
1500
643
824
33
gdzie:
V
GdmCl
3
GdmCl
3
7M GdmCl
·
3
GdmCl
5
· 1500 214 · c
GdmCl
BSA
9BSA
9BSA
·
,
· 1500 824 µl
V
buforu
; <V
GdmCl
=
BSA
> 1500 ; V
GdmCl
; 824 676 ; V
GdmCl
Sprawozdanie 6.
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 2 z 5
Data zajęć: 2008/12/05
Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
Ćwiczenie 8.
Grupa III
Grupa IV
Tabela 3. – Obliczenia widm różnicowych dla BSA we wzrastających stężeniach GdmCl
?
nm 0,4 M
0,8 M 1,0 M 1,2 M 1,6 M 1,8 M 2,2 M 2,6 M 3,0 M
330
0,00000
0,00000
0,00000
0,00000
0,00000
0,00000
0,00000
0,00000
0,00000
329
0,00039
0,00023
0,00036
0,00018
0,00035
0,00025
0,00031
0,00016
-0,00002
328
0,00063
0,00050
0,00064
0,00040
0,00066
0,00036
0,00051
0,00019
-0,00015
327
0,00063
0,00063
0,00081
0,00050
0,00083
0,00038
0,00066
0,00028
-0,00044
326
0,00057
0,00077
0,00082
0,00059
0,00094
0,00029
0,00065
0,00026
-0,00070
325
0,00071
0,00095
0,00092
0,00077
0,00107
0,00035
0,00084
0,00046
-0,00078
324
0,00094
0,00122
0,00119
0,00095
0,00125
0,00036
0,00115
0,00060
-0,00085
323
0,00133
0,00154
0,00144
0,00126
0,00156
0,00061
0,00147
0,00085
-0,00082
322
0,00142
0,00164
0,00159
0,00142
0,00171
0,00075
0,00159
0,00090
-0,00098
321
0,00147
0,00166
0,00160
0,00155
0,00184
0,00093
0,00158
0,00093
-0,00127
320
0,00163
0,00173
0,00171
0,00171
0,00209
0,00093
0,00175
0,00105
-0,00154
319
0,00180
0,00185
0,00183
0,00184
0,00224
0,00116
0,00186
0,00101
-0,00171
318
0,00191
0,00202
0,00186
0,00201
0,00238
0,00121
0,00196
0,00105
-0,00190
317
0,00199
0,00222
0,00194
0,00220
0,00251
0,00132
0,00219
0,00116
-0,00209
316
0,00194
0,00220
0,00186
0,00210
0,00255
0,00121
0,00220
0,00113
-0,00240
315
0,00182
0,00209
0,00182
0,00219
0,00257
0,00105
0,00218
0,00100
-0,00279
314
0,00186
0,00207
0,00183
0,00210
0,00263
0,00106
0,00210
0,00091
-0,00324
313
0,00178
0,00197
0,00163
0,00207
0,00262
0,00098
0,00208
0,00076
-0,00372
312
0,00170
0,00198
0,00151
0,00196
0,00258
0,00092
0,00197
0,00062
-0,00424
311
0,00156
0,00188
0,00135
0,00198
0,00251
0,00070
0,00189
0,00049
-0,00480
310
0,00141
0,00169
0,00111
0,00190
0,00222
0,00052
0,00161
0,00019
-0,00546
309
0,00108
0,00141
0,00086
0,00168
0,00212
0,00029
0,00140
-0,00020
-0,00618
308
0,00075
0,00110
0,00041
0,00142
0,00170
-0,00022
0,00103
-0,00072
-0,00718
307
0,00026
0,00081
0,00001
0,00114
0,00145
-0,00064
0,00063
-0,00128
-0,00831
306
-0,00021
0,00054
-0,00048
0,00097
0,00112
-0,00103
0,00014
-0,00173
-0,00944
305
-0,00079
0,00009
-0,00105
0,00049
0,00076
-0,00153
-0,00062
-0,00243
-0,01093
304
-0,00135
-0,00029
-0,00162
0,00026
0,00031
-0,00202
-0,00134
-0,00322
-0,01248
303
-0,00201
-0,00074
-0,00217
-0,00013
-0,00012
-0,00252
-0,00203
-0,00408
-0,01421
302
-0,00294
-0,00122
-0,00293
-0,00064
-0,00072
-0,00319
-0,00298
-0,00521
-0,01626
301
-0,00399
-0,00177
-0,00368
-0,00128
-0,00141
-0,00388
-0,00393
-0,00653
-0,01847
300
-0,00520
-0,00241
-0,00456
-0,00188
-0,00221
-0,00479
-0,00527
-0,00823
-0,02126
299
-0,00647
-0,00305
-0,00545
-0,00255
-0,00313
-0,00568
-0,00696
-0,01017
-0,02443
298
-0,00803
-0,00395
-0,00664
-0,00336
-0,00420
-0,00704
-0,00927
-0,01260
-0,02811
297
-0,01018
-0,00520
-0,00821
-0,00457
-0,00573
-0,00884
-0,01242
-0,01581
-0,03297
296
-0,01242
-0,00635
-0,00971
-0,00575
-0,00730
-0,01094
-0,01637
-0,01979
-0,03860
295
-0,01512
-0,00767
-0,01136
-0,00720
-0,00932
-0,01339
-0,02137
-0,02518
-0,04610
294
-0,01789
-0,00859
-0,01273
-0,00843
-0,01128
-0,01619
-0,02744
-0,03172
-0,05514
293
-0,02130
-0,00979
-0,01451
-0,00998
-0,01368
-0,01975
-0,03499
-0,04014
-0,06671
292
-0,02448
-0,01028
-0,01594
-0,01109
-0,01601
-0,02341
-0,04364
-0,04985
-0,07999
291
-0,02753
-0,01032
-0,01685
-0,01173
-0,01813
-0,02717
-0,05336
-0,06090
-0,09487
290
-0,03046
-0,00999
-0,01759
-0,01215
-0,02012
-0,03096
-0,06410
-0,07280
-0,11086
289
-0,03355
-0,00957
-0,01775
-0,01222
-0,02153
-0,03451
-0,07470
-0,08462
-0,12656
288
-0,03646
-0,00915
-0,01783
-0,01195
-0,02236
-0,03702
-0,08322
-0,09360
-0,13937
287
-0,03937
-0,00892
-0,01790
-0,01160
-0,02267
-0,03770
-0,08768
-0,09701
-0,14594
286
-0,04218
-0,00873
-0,01814
-0,01129
-0,02212
-0,03624
-0,08673
-0,09280
-0,14437
285
-0,04458
-0,00882
-0,01847
-0,01086
-0,02105
-0,03323
-0,08144
-0,08252
-0,13530
284
-0,04586
-0,00837
-0,01843
-0,01019
-0,01970
-0,02956
-0,07400
-0,06994
-0,12322
283
-0,04640
-0,00796
-0,01815
-0,00948
-0,01848
-0,02657
-0,06819
-0,06049
-0,11405
282
-0,04690
-0,00763
-0,01813
-0,00926
-0,01793
-0,02543
-0,06618
-0,05677
-0,11109
281
-0,04755
-0,00752
-0,01810
-0,00911
-0,01779
-0,02570
-0,06721
-0,05750
-0,11308
280
-0,04822
-0,00723
-0,01803
-0,00889
-0,01741
-0,02605
-0,06851
-0,05861
-0,11535
279
-0,04860
-0,00689
-0,01781
-0,00857
-0,01687
-0,02565
-0,06766
-0,05685
-0,11414
278
-0,04867
-0,00669
-0,01739
-0,00803
-0,01571
-0,02371
-0,06387
-0,05081
-0,10755
277
-0,04817
-0,00686
-0,01729
-0,00784
-0,01451
-0,02127
-0,05793
-0,04197
-0,09776
276
-0,04768
-0,00721
-0,01730
-0,00792
-0,01347
-0,01884
-0,05168
-0,03315
-0,08777
275
-0,04708
-0,00778
-0,01772
-0,00838
-0,01304
-0,01721
-0,04689
-0,02648
-0,08038
274
-0,04671
-0,00826
-0,01803
-0,00909
-0,01288
-0,01629
-0,04345
-0,02245
-0,07546
273
-0,04586
-0,00805
-0,01808
-0,00911
-0,01241
-0,01569
-0,04112
-0,01987
-0,07185
272
-0,04497
-0,00815
-0,01796
-0,00927
-0,01229
-0,01573
-0,03948
-0,01854
-0,06941
271
-0,04426
-0,00823
-0,01826
-0,00933
-0,01210
-0,01584
-0,03813
-0,01727
-0,06709
270
-0,04393
-0,00897
-0,01885
-0,01012
-0,01252
-0,01649
-0,03742
-0,01624
-0,06558
269
-0,04415
-0,01051
-0,02018
-0,01120
-0,01330
-0,01723
-0,03694
-0,01504
-0,06337
268
-0,04440
-0,01232
-0,02170
-0,01322
-0,01477
-0,01893
-0,03683
-0,01442
-0,06134
267
-0,04525
-0,01410
-0,02358
-0,01521
-0,01613
-0,02078
-0,03720
-0,01478
-0,06037
266
-0,04610
-0,01521
-0,02531
-0,01733
-0,01781
-0,02286
-0,03873
-0,01630
-0,06120
265
-0,04717
-0,01687
-0,02798
-0,01974
-0,01967
-0,02524
-0,04086
-0,01833
-0,06233
264
-0,04854
-0,01984
-0,03087
-0,02250
-0,02232
-0,02861
-0,04284
-0,02050
-0,06317
263
-0,05028
-0,02314
-0,03402
-0,02567
-0,02526
-0,03223
-0,04512
-0,02291
-0,06420
262
-0,05294
-0,02726
-0,03750
-0,02962
-0,02921
-0,03685
-0,04840
-0,02671
-0,06699
261
-0,05570
-0,03054
-0,04106
-0,03384
-0,03241
-0,04190
-0,05245
-0,03130
-0,07100
260
-0,05943
-0,03428
-0,04587
-0,03827
-0,03653
-0,04807
-0,05792
-0,03672
-0,07582
Sprawozdanie 6.
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 3 z 5
Data zajęć: 2008/12/05
Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
Ćwiczenie 8.
Grupa III
Grupa IV
Największa różnica między absorbancją BSA natywnego i w 3,0 M GdmCl jest dla 287 nm.
Δ
Cmax
Δ
5 nm
;0,14594
Wykres 1. – Widma dla BSA w rosnących stężeniach GdmCl
260
270
280
290
300
310
320
330
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,0 M
0,4 M
0,8 M
1,0 M
1,2 M
1,6 M
1,8 M
2,2 M
2,6 M
3,0 M
A
b
s
o
rb
a
n
c
ja
Długo
ść
fali [nm]
Wykres 2. – Widma różnicowe dla BSA w rosnących stężeniach GdmCl względem białka natywnego
260
270
280
290
300
310
320
330
-0,15
-0,10
-0,05
0,00
0,05
0,4 M
0,8 M
1,0 M
1,2 M
1,6 M
1,8 M
2,2 M
2,6 M
3,0 M
R
ó
Ŝ
n
ic
a
a
b
s
o
rb
a
n
c
ji
Długo
ść
fali [nm]
Sprawozdanie 6.
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 4 z 5
Data zajęć: 2008/12/05
Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
Ćwiczenie 8.
Grupa III
Grupa IV
Wykres 3. – Denaturacja BSA w rosnących stężeniach GdmCl
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
2,0
2,4
2,8
3,2
0,000
0,025
0,050
0,075
0,100
0,125
0,150
∆
A
2
8
7
n
m
C
GdmCl
[M]
Wyznaczono trzy proste reprezentujące 100% populacji cząsteczek natywnych (
G
H
) , przejście
denaturacyjne (
G) oraz 100% populacji cząsteczek rozfałdowanych (G
I
).
G
H
0,00669 · c
GdmCl
= 0,00611
G 0,11072 · c
GdmCl
; 0,15733
G
I
0,02334 · c
GdmCl
= 0,03634
Tabela 3. – Obliczenia ΔG
o
dla denaturacji BSA
c
GdmCl
M
G
H
G
G
I
J
K
L
∆G°
O
J
mol
Q
1,74
0,01775
0,03532
0,07695
0,422
2138
1,77
0,01795
0,03864
0,07765
0,530
1572
1,80
0,01815
0,04197
0,07835
0,654
1051
1,83
0,01835
0,04529
0,07905
0,798
560
1,86
0,01855
0,04861
0,07975
0,965
88
gdzie:
∆G° ;R · 'S J
8,314
J
K·mol
R 298 K
Sprawozdanie 6.
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 5 z 5
Data zajęć: 2008/12/05
Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
Ćwiczenie 8.
Grupa III
Grupa IV
Wykres 4. – ΔG
o
denaturacji BSA
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
2,0
2,4
-5,00
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
∆
G
O
[
k
J
/m
o
l]
C
GdmCl
[M]
Wyznaczoną prostą i ekstrapolowano ją do 0,0 M GdmCl
∆G° ;17,04 · c
GdmCl
= 31,75
Obliczono
∆G° denaturacji w 0,0 M GdmCl
∆G° 31,75
kJ
mol
Wnioski
Widma różnicowe pozwalają badać zmiany konformacyjne białek. Wykres 1. przedstawia
zależność absorbancji od długości fali dla różnych konformacji białka (od natywnej
do denaturowanej). Im białko bardziej denaturowane tym mniejsza absorbancja.
Absorbancje znormalizowano do 0 dla 330 nm. Największą różnicę (względem białka
natywnego) w absorbancji wyznaczono dla 287 nm na wykresie 2. Punkty te naniesiono
na wykres 3. różnicy absorbancji od stężenia denaturanta. Wyznaczono trzy proste
odpowiednio dla stanu natywnego, przejściowego i zdenaturowanego białka. Pominięto
skrajne punkty dla 0,4 M i 3,0 M ze względu na znaczne odstępstwo od trendu linowego.
Dla wybranych 5 stężeń denaturanta z fazy przejściowej obliczono stałe równowagi reakcji
denaturacji, a z nich
∆G° dla każdego stężenia. Punkty naniesiono na wykres 4. ∆G°
od stężenia denaturanta. Wyznaczono prostą i ekstrapolowaną ją do 0,0 M stężenia
denaturanta. Wyznaczona dodatnia wartość
∆G° wskazuje, że BSA nie ulega spontanicznej
denaturacji w warunkach standardowych.