Boom na sekwencjonowanie
Środa, 21 Styczeń 2009 01:40
Boom na sekwencjonowanie
Redakcja prestiżowego czasopisma Science dokonała niedawno podsumowania
minionego roku pod kątem osiągnięc naukowych. Do chlubnego grona 10 przełomów
naukowych zaliczono także gwałtowny rozwój technik sekwencjonowania DNA. Przykładowo
opublikowano pełne sekwencje genomowe pacjenta chorego na raka, Azjaty i Afrykańczyka. W
domyśle badania nad tymi genomami mają pomóc w badaniu mechanizmów odpowiednio
nowotworzenia oraz migracji ludzi na przestrzeni ostatnich kilku tysięcy lat.
Istotnego postępu dokonano także na polu genomiki roślin. W 2009 roku zostanie
opublikowany genom kukurydzy oraz znaczne fragmenty genomów soi, oraz widłaka. Może nie
brzmi to imponującą ale należy pamiętać, że badania nad genomami roślinnymi są znacznie
trudniejsze w porównaniu do ich zwierzęcych odpowiedników z uwagi na ich większy rozmiar i
ogromną ilość powtórzeń sekwencyjnych. Właśnie z powodu relatywnie małego genomu w
biologii molekularnej za modelową rośliną uznawany jest rzodkiewnik pospolity ( Arabido
psis thaliana
).
Do nieco bardziej egzotycznych zastosowań nowoczesnych technik sekwencjonowania
można zaliczyć badania nad genomami wymarłych gatunków. Niedawno udało się otrzymać
pełny genom mitochondrialny niedz
wiedzia jaskiniowego i neandertalczyka. Zsekwecjonowano
także w przybliżeniu 70% genomu mamuta a prace nad uzyskaniem kompletnego
genomu neandertalczyka.
1 / 4
Boom na sekwencjonowanie
Środa, 21 Styczeń 2009 01:40
Uzyskiwane w ten sposób informacje raczej na pewno nie pozwolą na  ożywienie dinozaurów
ani innych wymarłych stworzeń ale są niezwykle cenne dla biologów ewolucyjnych. Badania
nad genomem neandertalczyka mogą pomóc w odpowiedzenie na wiele pytań dotyczących
naszego pochodzenia i ewolucji.
Metody szybkiego sekwencjonowania mają bez wątpienia znaczny potencjał aplikacyjny
i umożliwiają prowadzenie wielu interesujących badań. Dlatego warto też wiedzieć na jakiej
zasadzie działają. Obecnie istnieje kilka konkurencyjnych systemów sekwencjonowania, z
których każdy promowany jest przez inna firmę. Historycznie pierwszym była technika
454
opracowana przez 454 Life Sciences należącą do koncernu Roche. Jej istotą jest wykorzystanie
równoległego pirosekwencjonowania wielu fragmentów DNA w tym samym czasie. Zasada
pirosekwencjonowania ( sekwencjonowania poprzez syntezę ) jest stosunkowo prosta. DNA
będące matrycą dla syntezy jest unieruchamiane na podłożu stałym
a następnie w każdym kroku syntezy jest ono inkubowane wraz układem 4 enzymów:
polimerazy DNA, sulfurylazy ATP, lucyferazy oraz apyrazy. Do takiej matrycy dodaje się jeden z
czterech trifosforanów nukleozydów (dNTP). Jeżeli jest on komplementarny do nici matrycowej
to zachodzi jego inkorporacja do tworzonej przez polimerazę nici DNA. Powstały wtedy
pirofosforan reaguje z obecnym w układzie 5 fosfosiarczanem adenozyny
dając w wyniku ATP. Reakcja ta jest katalizowana przez sulfurylazę. Powstały ATP jest
rozkładany przez lucyferazę czego efektem jest emisja światła które jest rejestrowane przez
aparaturę pomiarową. W przypadku dodania do układu reakcyjnego niewłaściwego dNTP nie
obserwuje się emisji światła a sam związek jest rozkładany przez apyrazę. W ten sposób krok
po kroku zachodzi synteza nici komlementarnej i jednocześnie zbierana jest informacja o jej
sekwencji. Podejście to pozwala w znaczący sposób przyśpieszyć cały proces przy znacznej
redukcji kosztów.
2 / 4
Boom na sekwencjonowanie
Środa, 21 Styczeń 2009 01:40
Inną techniką masowego sekwencjonowania jest technologia rozwinięta i opanowana
przez firmę Illumina . Opiera się ona na jednoczesnym sekwencjonowaniu znacznej
ilości lowowych fragmentów DNA zakotwiczonych na szklanej płytce. Naniesione fragmenty
DNA są amplifikowane tak aby ilość powtórzeń każdej matrycy wynosiła przynajmniej 1000.
Cząsteczki te są sekwencjonowane poprzez syntezę opartą na wykorzystaniu odwracalnych
terminatorów z usuwalnymi barwnikami fluorescencyjnymi. Wedle zapewnień producentów
technika ta jest wierna i dobrze radzi sobie z powtórzeniami sekwencyjnymi. Ponieważ stopień
pokrycia płytki jest bardzo wysoki cały proces zachodzi bardzo szybko. Wysoka czułość detekcji
osiągana jest za pomocą wzbudzania fluoroforu laserem i stosowania specjalnie
zaprojektowanego systemu optycznego.
Najciekawszą (subiektywnym zdaniem autora) z rozwijanych technik jest opracowana
przez Pacific Biosciences technika SMRT (Single Molecule Real-Time ) Sequencing. J
ak sama nazwa wskazuje opiera się ona na wykorzystaniu pojedynczej cząsteczki polimerazy
DNA, pracującej w trybie ciągłym. Sekwencjonowanie przebiega
w małej komorze o średnicy 10 nm i objętości wynoszącej 20 zeptolitrów, utworzonej na cienkiej
metalowej warstewce nadrukowanej na kwarcową płytkę. Każdy taki chip zawiera kilka tysięcu
takich komór. Dzięki takiemu poziomowi miniaturyzacji możliwy jest pomiar aktywności
pojedynczej cząsteczki polimerazy, przytwierdzonej kowalencyjnie do ściany komory.
3 / 4
Boom na sekwencjonowanie
Środa, 21 Styczeń 2009 01:40
Do syntezy do końcowego atomudNTP znakowane różnymipolimerazy przez co fluorofor
dołączonymDNA wykorzystuje się fosforu. Gdy cząsteczkę fluorescencyjnymi ugrupowaniami
substrat się przezinkorporacja nukleotydu przezdo komory reakcyjnej wprowadza się pasujący
znajdujezachodzi szybkościąPo się powtarza.sekundę.par czas tejmożliwe jest szybkość
cząsteczkizachodzi w zasięguprocespar rządponadPodstawowązasad DNA zachodzi dyfuzja
znakowanego pirofosforanu tej 10włączeniuwielkości dłużejłańcuchaw techniki jest więc
 synteza z komoryzreakcyjnej.dziedzinie
pomocąniebywały postęp w i detekcji o zasadnukleotydu doTeoretycznieciągu minuty, co
stanowi jednego chipu) zsekwencjonowanie na miliona niżzaletąpotrzebny na dyfuzję(za
4 / 4