Analiza ekspresji genów
Wiadomości Zootechniczne, R. XLIV (2006), 1: 11-13
Analiza ekspresji genów na poziomie białek przy
użyciu techniki western-blot
Jolanta Opiela
Instytut Zootechniki, Dział Biotechnologii Rozrodu Zwierząt,
32-083 Balice k. Krakowa
iałka powstałe na matrycy mRNA są osta- " transfer białek z żelu na membranę,
B
tecznym produktem ekspresji genów, a ana-
" inkubacja membrany ze specyficznym
liza ekspresji białek stanowi jedną z pod-
przeciwciałem,
stawowych metod biologii molekularnej. W celu
" detekcja białek na membranie.
przeprowadzenia analizy białek stosuje się elek-
troforezę, podczas której cząsteczki białka, obar-
Rozdział białek przy wykorzystaniu
czone określonym ładunkiem, migrują w polu
elektroforezy SDS-PAGE
elektrycznym. W połowie lat sześćdziesiątych
Aby rozdzielić białka na podstawie róż-
ubiegłego stulecia została opracowana metoda
nic w ich ciężarze cząsteczkowym należy prze-
elektroforezy w żelu poliakrylamidowym SDS-
prowadzić elektroforezę w żelu poliakryloami-
PAGE (ang. sodium dodecyl sulfate polyacryla-
dowym, w warunkach denaturujÄ…cych, w obec-
mide gel electrophoresis), która pozwala na roz-
noÅ›ci siarczanu dodecylu sodu (SDS) i ²-mer-
dział białek zgodnie z ich ładunkiem, wielkością
kaptoetanolu.
i kształtem. Aby zidentyfikować określone
Siarczan dodecylu sodu, SDS, jest silnym,
białko, zawarte w mieszaninie innych białek, sto-
anionowym detergentem zbudowanym z hydro-
suje siÄ™ metodÄ™ western-blot.
filowej  głowy oraz długiego hydrofobowego
Hybrydyzacja western-blot, określana
 ogona (CH3-(CH2)11-SO4-Na+). Detergent SDS
również jako immuno-blotting, jest procedurą,
przyłącza się do hydrofobowych obszarów
w której różne rodzaje białek są rozdzielane przy
cząsteczki białka i powoduje jej  rozkręcenie do
wykorzystaniu elektroforezy SDS-PAGE i prze-
struktury łańcucha polipeptydowego. W rezul-
noszone na trwałą  podstawę , jaką jest mem-
tacie, pojedyncze cząsteczki białek zawieszone są
brana. Następnie, poprzez inkubację tej mem-
swobodnie w roztworze SDS. Ponadto, ²-
brany ze specyficznym przeciwciałem pierwszo-
merkaptoetanol stosowany w tej procedurze jest
rzędowym, następuje identyfikacja poszukiwa-
związkiem o silnych właściwościach reduku-
nego białka.
jÄ…cych, przecina on mostki dwusiarczkowe (S-S)
Metoda ta, z uwagi na jej czułość i do-
między białkami. W trakcie elektroforezy SDS-
kładność, znalazła szerokie zastosowanie w ilo-
PAGE aniony SDS nie tylko denaturują białko,
ściowej analizie białek. Pozwala jednocześnie na
ale również opłaszczają polipeptydy w proporcji
uzyskanie informacji na temat rodzaju, wielkości
1,4 µg SDS/1 µg biaÅ‚ka. W rezultacie, każda
białka oraz poziomu jego ekspresji - danych tych
cząsteczka białka wiąże dużą liczbę ujemnie
nie można uzyskać przy użyciu innych, alterna-
naładowanych cząsteczek SDS, które pokonują
tywnych technik (Wu i in., 2004).
wynikający ze składu aminokwasowego natywny
Standardowa hybrydyzacja western-blot
ładunek białka. Bez tego etapu elektroforeza
składa się z czterech etapów:
białek nie byłaby możliwa. W polu elektrycznym
" rozdział białek przy wykorzystaniu
ujemnie naładowane białka migrują w kierunku
elektroforezy SDS-PAGE,
dodatniej elektrody.
Prace przeglÄ…dowe
11
J. Opiela
W celu wzmocnienia rozdziału białek sto- niskiego ciśnienia od 200 do 400 Pa. Transfer
suje się żele poliakryloamidowe. Żel poliakryloami- trwa maksymalnie do 1 godz., a uzyskane prążki
dowy (PAA) uzyskuje się poprzez wspólną polime- cechują się większą ostrością oraz rozdzielczo-
ryzację akryloamidu i N,N -metylenobisakrylo- ścią niż przy wykorzystaniu innych technik
amidu (bisakryloamidu), od ilości tego ostatniego transferu. Pomimo tych zalet blottingu próżnio-
zależy usieciowanie żelu. Mechanizm polimeryzacji wego, obecnie najczęściej stosowaną techniką
katalizowany jest przez wolne rodniki, których z
ró- jest elektrotransfer. Zaletą tej formy transferu
dłem jest nadsiarczan amonu, a ich uwalnianie przy- jest szybkość, co znacznie redukuje dyfuzję sa-
spiesza dodatek N,N,N ,N -Tetramethylethylene- mych białek i pozwala na uzyskanie bardziej
diaminy (TEMED). Stężenie żelu PAA decyduje czytelnego obrazu po immunodetekcji. Elektro-
o rozdziale białek. Według ogólnie przyjętej za- transfer można przeprowadzić dwoma sposo-
sady, im większe białko chcemy oznaczyć, tym bami: jako elektrotransfer mokry, gdy  kanapkę
niższe stężenie żelu powinno być użyte. Ma to transferową zamoczymy w buforze do transferu,
decydujące znaczenie dla odczytu ostrości prąż- lub elektrotransfer półmokry, gdy  kanapka
ków uzyskiwanych przy detekcji białka. W trak- transferowa umieszczona jest pomiędzy bibu-
cie elektroforezy SDS-PAGE białka o małej ma- łami nasączonymi buforem (Wu i in., 2004;
sie cząsteczkowej migrują szybciej w porówna- Kyhse-Anderson, 1984; Towbin i in., 1979).
niu do białek o dużej masie cząsteczkowej. Roz- Jako membranę w elektrotransferze naj-
dział prowadzi się w żelu składającym się częściej stosuje się aktywowany nylon (PVDF,
z dwóch części, dolnej - tzw. żel rozdzielający polivinylidene fluoride), można stosować również
i górnej - tzw. żel zagęszczający. Żele różnią się nitrocelulozę. Nitroceluloza jest tania, ma jednak
między sobą gęstością oraz odczynem pH. pewne wady: jest stosunkowo krucha, zwłaszcza
Białka, w buforze o niskim przewodnictwie (lo- gdy jest sucha, a białka nie wiążą się z nią
ading buffer) nałożone w części zagęszczającej kowalencyjnie. Natomiast PVDF ma bardzo dobrą
żelu, ulegają skoncentrowaniu na skutek obu- wytrzymałość mechaniczną, umożliwia wiązanie
stronnego kontaktu z buforami o wysokim prze- dużej liczby białek, a sygnał uzyskany w trakcie
wodnictwie, tj. w buforze elektrodowym oraz detekcji jest mocniejszy, przy równoczesnym
w buforze w żelu zagęszczającym. Białka ule- ograniczeniu tła (Wu i in., 2004; Kyhse-
gają zagęszczeniu w wąskim regionie, powyżej Anderson, 1984; Towbin i in., 1979).
granicy z żelem rozdzielającym. Dzięki takiemu
umiejscowieniu możliwy jest następnie efek- Inkubacja membrany ze specyficznym prze-
tywny rozdział białek w części rozdzielającej ciwciałem
żelu (Wu i in., 2004; Szalata i in., 2004; Kyhse- Western-blot wymaga stosowania specy-
Anderson, 1984; Towbin i in., 1979). ficznych przeciwciał, które służą jako sondy.
Specyficzność i aktywność przeciwciał to klu-
Transfer białek z żelu na membranę czowe, lecz i newralgiczne warunki sukcesu
Przeniesienie białka z żelu na membranę metody. Przeważnie stosuje się dwa rodzaje
następuje w drodze elektrotransferu. Odbywa się przeciwciał: monoklonalne (mysie) i poliklo-
to w ten sposób, że ujemnie naładowane białka, nalne (królicze). Częściej używana jest surowica
migrując w kierunku dodatniej elektrody, zostają z przeciwciałami poliklonalnymi. Zawiera ona
zatrzymane na membranie umieszczonej między bowiem wiele przeciwciał, które wiążąc się
żelem a anodą. Białka, w postaci prążków znaj- z różnymi epitopami antygenu generują znacz-
dujących się na różnych poziomach, są precyzyj- nie silniejszy sygnał niż można uzyskać przy
nie przeniesione na membranę dając lustrzany użyciu przeciwciał monoklonalnych. Jednak,
obraz rozdzielonych w żelu polipeptydów. użycie surowicy z przeciwciałami poliklonal-
Transfer białek z żelu na membranę nymi zwiększa ryzyko powstania dodatkowych,
można wykonać przy użyciu kilku metod. Naj- niespecyficznych sygnałów, gdyż do reakcji
prostszą z nich jest dyfuzja, inne metody to wprowadzane są również inne przeciwciała,
transfer w warunkach próżniowych i elektro- obecne w organizmie osobnika użytego do im-
transfer. Transfer w warunkach próżniowych munizacji. Dlatego, z uwagi na specyficzność
(vacuum blotting) wykonywany jest przy użyciu reakcji, lepiej jest stosować przeciwciała mono-
Prace przeglÄ…dowe
12
Analiza ekspresji genów
klonalne, gdyż identyfikując określony antygen ciwciała skoniugowane z enzymem HRP, który
przyłączają się one tylko do jednego epitopu. w reakcji z cyklicznymi diacylohydrazydami (np.
Niestety, posiadają również pewne wady, a mia- luminolem) w środowisku zasadowym emituje
nowicie nie reagują ze zdenaturowanymi biał- promieniowanie. W wyniku oksydacji luminol
kami, zwykle rozpoznając epitopy powstałe przechodzi w stan wzbudzenia, a powracając do
wskutek zwinięcia III-rzędowej struktury białka. stanu podstawowego emituje promieniowanie
Należy mieć też na uwadze, że przeciwciała mo- świetlne. Wynik doświadczenia zarejestrowany
noklonalne mogą również powodować powsta- zostaje na kliszy wrażliwej na niebieskie światło.
wanie niespecyficznych sygnałów poprzez od- Metoda ta charakteryzuje się następującymi za-
działywanie z podobnymi epitopami innych bia- letami:
Å‚ek (Wu i in., 2004).
" wysoka czułość (10 razy czulsza w sto-
sunku do metod wykorzystujących zwykłe
Detekcja białek na membranie
barwniki oraz 2-5 razy czulsza w stosunku
Ostatnim etapem metody western-blot
do metod izotopowych);
jest detekcja białek na membranie.
" dobra rozdzielczość;
Przy detekcji najczęściej stosuje się
" znaczna szybkość;
przeciwciała tzw. II-rzędowe, ponieważ rozpo-
" oszczędność dzięki stosowaniu małych
znają one przeciwciała użyte do reakcji wiązania
ilości przeciwciał;
z antygenem. Przeciwciała użyte do reakcji
" możliwość przeprowadzenia powtórzeń
z antygenem (czyli poszukiwanym białkiem) no-
detekcji na tej samej membranie.
szą nazwę przeciwciał I-rzędowych. Przeciw-
W badaniach realizowanych w Instytucie
ciała II-rzędowe mogą być znakowane radioak-
Zootechniki, w Dziale Biotechnologii Rozrodu
tywnie, najczęściej jednak skoniugowane są
ZwierzÄ…t, w ramach grantu promotorskiego (nr
z enzymem, np. z peroksydazÄ… chrzanowÄ… (HRP)
2PO6D 00728) metoda western - blot stosowana
lub fosfatazÄ… alkalicznÄ… (AP), co pozwala na
jest do oceny ekspresji białek apoptotycznych
przeprowadzenie reakcji barwnej.
w oocytach bydlęcych zróżnicowanych pod
W ostatnich latach coraz częściej stoso-
względem zawartości enzymu dehydrogenazy
wana jest chemiluminescencyjna metoda detekcji
glokozo-6-fosforanowej (G6PD).& & & & & & ..
białek. Wykorzystuje ona I- lub II-rzędowe prze-
Literatura
Kyhse-Anderson J. (1984). Electroblotting of multiple polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets:
gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid procedure and some applications. Proc. Natl. Acad.
transfer of proteins from polyacrylamide to Sci., USA, 76, p. 4350.
nitrocellulose. J. Biochem. Biophys. Meth., 10, p. 203.
Wu W., Welsh M.J., Kaufman P.B., Zhang H.H.
Szalata M., Toboła P., Pławski A., Kalak R., Jura J., (2004). Analysis of gene expression at the proteomic
Słomski R. (2004). Elektroforeza białek w żelu level. In: Gene Biotechnology; CRC Press.
poliakryloamidowym. W: Przykłady analiz DNA. AR
Poznań, ss. 313-319. Do przygotowania niniejszego opracowania wykorzy-
stano również materiały szkoleniowe oraz informacje
Towbin J., Staehlin T., Gordon J. (1979). podawane przez producentów sprzętu do elektrofo-
Electrophoretic transfer of proteins from rezy i transferu białek.& & & & & .& & & ..
& &
ANALYSIS OF GENE EXPRESSION AT THE PROTEOMIC LEVEL
USING WESTERN BLOT
Summary
Western blot analysis can detect one protein in a mixture of any number of proteins while giving
information about the size of the protein. However, this method is dependent on the use of a high-quality
antibody directed against a desired protein. The article describes the principles of western blot hybridization.
Prace przeglÄ…dowe
13