Tom 54 2005
Numer 2 3 (267 268)
Strony 227 239
JOANNA SZTUBA-SOLIC
SKA
Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin Oddział Bydgoszcz
Al. Powstańców Wielkopolskich 10, 85-090 Bydgoszcz
e-mail: [e-mail]
SYSTEMY MARKERÓW MOLEKULARNYCH I ICH ZASTOSOWANIE W HODOWLI
ROÅšLIN
WPROWADZENIE
Badanie polimorfizmu DNA stało się moż- mi, stwierdzenie introgresji między odległy-
liwe dzięki opracowaniu systemów wyko- mi ewolucyjnie osobnikami, a także badanie
rzystujÄ…cych markery molekularne. Systemy cech poligenicznych.
markerów molekularnych stały się głównym Niniejsze opracowanie obejmuje cha-
narzędziem analiz genetycznych przełamują- rakterystykę systemów markerów moleku-
cym bariery, z którymi borykały się konwen- larnych oraz możliwości ich zastosowania
cjonalne metody hodowli. Stosowanie metod w analizach genetycznych i w hodowli roślin
molekularnych umożliwiło analizę przekazu uprawnych.
genów między spokrewnionymi odmiana-
DEFINICJA MARKERA
Marker to wyznacznik, dowolna, gene- Początkowo do analizy zmienności or-
tycznie kontrolowana cecha fenotypowa lub ganizmów stosowano markery morfologicz-
też dowolna różnica genetyczna wykorzysty- ne, czyli cechy fenotypowe, których ekspre-
wana dla ujawnienia polimorfizmu osobni- sja umożliwia ocenę sposobu dziedziczenia.
czego. Pod pojęciem polimorfizmu rozumie Następnie dołączyły do nich markery cyto-
się całokształt różnic występujących między logiczne bazujące na obserwacji aberracji
poszczególnymi gatunkami, odmianami, osob- chromosomowych w genomie danego orga-
nikami, a także komórkami organizmu, które nizmu, umożliwiające m.in. ocenę poziomu
potencjalnie mogą być ujawniane za pomocą ploidalności oraz analizę transferu genów.
odpowiednio dobranego systemu markero- Analiza polimorfizmu struktury molekularnej
wego. System markerowy o wysokiej uży- polipeptydów mogących pośrednio odzwier-
teczności powinien nie tylko ujawniać szero- ciedlać zmienność materiału genetycznego,
ki zakres zmienności analizowanej cechy, ale przyczyniła się do rozwoju markerów białek
także nie powinien ulegać wpływowi czynni- strukturalnych oraz białek enzymatycznych.
ków środowiskowych. Użyteczność systemu Obecnie, najczęściej stosowanymi technika-
analiz uzależniona jest również od wysokiej mi analizy zróżnicowania organizmów są sys-
powtarzalności wyników, łatwości detekcji temy markerów molekularnych ujawniające
oraz możliwości szczegółowego poznania zmienność sekwencji nukleotydowej DNA.
mechanizmów warunkujących występowanie
danej właściwości organizmu.
JOANNA SZTUBA-SOLIC
SKA
228
SYSTEMY MARKERÓW MOLEKULARNYCH
Współcześnie znane są liczne techniki larnych umożliwiają analizę zróżnicowania
umożliwiające identyfikację polimorfizmu or- organizmów niezależnie od ich fazy rozwo-
ganizacji i struktury materiału genetycznego, jowej i wpływu czynników środowiskowych.
zarówno w obrębie sekwencji kodujących, Ponadto, metody molekularne gwarantują
jak i niekodujących. Przełomowymi odkry- wysoką powtarzalność wyników i łatwość
ciami dla ich rozwoju było zaproponowa- aplikacji, co decyduje o ich wysokim stopniu
nie sekwencji DNA i modelu jego replikacji użyteczności. Poszczególne techniki analizy
(WATSON i CRICK 1953), następnie wyizo- zmienności materiału genetycznego różnią
lowanie po raz pierwszy polimerazy DNA się między sobą, co wynika z ich specyfiki,
(KORNBERG i współaut. 1955), wyizolowanie typu i poziomu polimorfizmu, który określa-
i scharakteryzowanie pierwszej sekwencyj- ją. Ze względu na sposób identyfikacji zmien-
nie specyficznej endonukleazy restrykcyjnej ności genetycznej systemy markerów mole-
(SMITH i WILCOX 1968) oraz opracowanie kularnych można podzielić na kilka kategorii,
metody sekwencjonowania DNA (MAXAM których charakterystykę przedstawiono w ni-
i GILBERT 1977). Systemy markerów moleku- niejszej pracy.
CHARAKTERYSTYKA SYSTEMÓW MARKERÓW MOLEKULARNYCH
Przebieg analizy polimorfizmu za pomo- DNA enzymami restrykcyjnymi, a następnie
cą omawianych poniżej kategorii systemów
poddaniu produktów trawienia rozdziałowi
markerów molekularnych ilustruje Ryc. 1,
na żelu agarozowym (Ryc. 2). Póz
niejsza mo-
a ich właściwości i wymagania zestawione są
dyfikacja metody wprowadziła dodatkowo
w Tabeli 1.
transfer rozdzielonych fragmentów DNA na
membranę, a następnie hybrydyzację DNA ze
MARKERY OPARTE NA HYBRYDYZACJI DNA
specyficznÄ… sondÄ… znakowanÄ… radioaktywnie
(SOUTHERN 1975) lub fluorescencyjnie (NEU-
RFLP  Polimorfizm długości fragmentów
HAUS-URL i NEUHAUS 1993). Jako sondy sto-
restrykcyjnych
suje się zwykle DNA lub cDNA o wielkości
Technika RFLP (ang. restriction fragment
300 500 pz, zaÅ› wizualizacjÄ™ polimorfizmu
length polymorphism) polega na trawieniu
sygnałów hybrydyzacyjnych dokonuje się za
Ryc. 1. Schematy przebiegu analizy poliformizmu dla wybranych systemów markerów molekularnych.
Systemy markerów molekularnych i ich zastosowanie w hodowli
229
Tabela 1. Zestawienie właściwości najczęściej stosowanych systemów markerowych.
Cecha RFLP RAPD AFLP SSR SSCP CAPS
Ilość DNA (µg) 10 0,02 0,5-1,0 0,05 0,05 0,05
Jakość DNA wysoka wysoka średnia średnia średnia średnia
Poziom średni średni średni wysoki średni średni
polimorfizmu
Typ kodominacja dominacja dominacja kodominacja kodominacja kodominacja
dziedziczenia
Występowanie regiony cały genom cały genom DNA cały cały
w genomie kodujÄ…ce nie nie repetytywny genom genom
Wymagana nie nie tak tak tak tak
znajomość
sekwencji
Detekcja tak/nie nie tak/nie nie tak/nie nie
radioaktywna
Trudności średnie małe wysokie wysokie średnie średnie
techniczne
Wiarygodność wysoka średnia średnia wysoka wysoka średnia
Powtarzalność wysoka niska wysoka wysoka wysoka średnia
Koszty analiz wysokie niskie średnie wysokie wysokie wysokie
pomocÄ… autoradiografii. ZaletÄ… tej metody litarnego waha siÄ™ od 2 do 1000 razy i jest
jest możliwość stwierdzenia homo- lub hete- często zróżnicowana wśród genotypów tego
rozygotyczności analizowanego osobnika na samego gatunku, co powodowane jest liczny-
podstawie uzyskanego profilu genetycznego mi zdarzeniami rekombinacyjnymi. Polimor-
oraz wysoka częstotliwość wykrywanego po-
limorfizmu. y
ródłem zróżnicowania struktury
DNA określanego metodą RFLP mogą być de-
lecje, insercje, utrata miejsca restrykcyjnego
w obrębie sekwencji rozpoznawanej przez
sondÄ™, bÄ…dz
też pojawienie się nowego miej-
sca restrykcyjnego w obrębie sekwencji roz-
poznawanej przez sondÄ™ lub poza sekwencjÄ…
komplementarną dla sondy. RFLP umożliwia
analizÄ™ specyficznych loci lub alleli, a uzy-
skane rezultaty cechuje wysoka wiarygod-
ność. Metoda ta wymaga jednak dużej ilości
DNA niezbędnego do trawienia restrykcyjne-
go oraz zwiÄ…zana jest z wysokimi kosztami
otrzymania sondy.
VNTR  Zmienna liczba tandemowych
powtórzeń
Metoda VNTR (ang. variable number of
tandem repeats), po raz pierwszy została za-
stosowana do tworzenia mapy genetycznej Ryc. 2. Analiza RFLP obrazująca zmienność mi-
człowieka. Opiera się na analizie tandemowo tochondrialnego DNA między liniami płodnymi
powtarzających się motywów sekwencyjnych (ścieżka 1-2; 7-12) i męskosterylnymi (ścieżka
długości 11 60 pz zwanych minisatelitarnym 3-6) buraka cukrowego trawionych restryktazą
DNA. Liczba powtórzeń motywu minisate- EcoRI.
JOANNA SZTUBA-SOLIC
SKA
230
fizm minisatelitarnych loci wykrywany jest i wydają się być identyczne dla różnych
poprzez trawienie DNA enzymami restrykcyj- osobników, nie świadczy o ich homologii
nymi, które rozpoznają sekwencje flankujące sekwencyjnej. Pojedyncze produkty składają-
minisatelitarne regiony. Dalsze etapy anali- ce się na wzór prążkowy, w rzeczywistości
zy przebiegają jak w przypadku markerów mogą składać się z kilku fragmentów wspól-
RFLP, z zastosowaniem sond homologicznych nie migrujących w żelu. Aby uniknąć trudno-
do minisatelitarnego DNA. W wyniku analizy ści związanych z interpretacją profili uzyska-
uzyskuje się profile molekularne składające nych dzięki metodzie RAPD, stworzono al-
się z wielu produktów o wielkości od 4 20 ternatywne systemy molekularne: DAF (ang.
kpz, zwane  fingerprintami (Ryc. 3) DNA amplification fingerprinting) i AP-PCR
(ang. arbitrarily primed polymerase chain re-
MARKERY BAZUJ
CE NA REAKCJI PCR
action). W metodzie DAF losowa amplifikacja
Z ZASTOSOWANIEM ARBITRALNEGO STARTERA
DNA odbywa siÄ™ z zastosowaniem startera
o długości 5 8 pz. Powstaje wówczas od 40
RAPD  Losowo amplifikowany
do 100 produków DNA, które rozdziela się
polimorficzny DNA
na żelu poliakrylamidowym. AP-PCR to mo-
RAPD (ang. random amplified polymor- dyfikacja metody RAPD, w której stosuje się
phic DNA) to system markerowy bazujący na starter o długości 10 50 pz (WELSH i MCC-
reakcji PCR z zastosowaniem startera o przy- LELLAND 1990). Pierwsze dwa cykle reakcyjne
padkowej sekwencji i długości 9 11 pz (WIL- zachodzą w obniżonej temperaturze wiąza-
LIAMS i współaut. 1990). Każdy taki starter nia starterów, zaś kolejne w wyższej, warun-
hybrydyzując do matrycy DNA, zapoczątko- kującej dużą specyficzność amplifikacji. Obie
wuje amplifikację w wielu rejonach genomu modyfikacje metody RAPD umożliwiają sku-
jednocześnie. Produkty amplifikacji rozdziela teczniejszą analizę molekularną osobników
się na żelu agarozowym, a ich detekcja odby- o bardzo niskim stopniu zróżnicowania ge-
wa się z użyciem bromku etydyny lub srebra netycznego.
(Ryc. 4). Metoda ta jest szybsza, wydajniej-
ISSR  Polimorfizm sekwencji
sza i mniej pracochłonna niż RFLP. Potrzeba
międzymikrosatelitarnych
również znacznie mniejszych ilości DNA, po-
nieważ jest on powielany w kolejnych run- Technika ISSR (ang. inter simple sequen-
dach amplifikacji. ce repeats) umożliwia identyfikację polimor-
Stosując analizę RAPD należy być świado- fizmu długości obszarów DNA, zawartych po-
mym jej ograniczeń. Obecność produktów,
które migrują w żelu na ten sam dystans
Ryc. 3. Analiza VNTR obrazująca zmienność
locus minisatelitarnego w mitochondrialnym
DNA linii LO (ścieżka 1 2; 7 12) i MS (ścieżka
Ryc. 4. Analiza RAPD obrazujÄ…ca polimorfizm
3-6) buraka cukrowego trawionych restryktazÄ…
organizacji genomowego DNA tetraploidalnych
BamHI, poddanych hybrydyzacji z sondÄ… kom-
zapylaczy buraka (ścieżka 1 12) z zastosowa-
plementarnÄ… do TR3 minisatelitarnego mtDNA.
niem startera OPK10.
Systemy markerów molekularnych i ich zastosowanie w hodowli
231
między przeciwlegle skierowanymi, identycz- liczby powtórzeń motywu nukleotydowego,
nymi sekwencjami mikrosatelitarnymi. W re- a także możliwość oceny homo- lub hetero-
akcji PCR stosowane są startery o długości zygotyczności analizowanego osobnika na
16 18 pz odpowiadajÄ…ce motywom mikro- podstawie profilu genetycznego.
satelitarnym, które posiadają kilka selektyw-
STS  Miejsca znaczone sekwencyjnie
nych nukleotydów (ZIETKIEWICZ i współaut.
1994). Podczas reakcji powstaje od 10 do Technika STS (ang. sequence tagged sites)
60 produktów, które poddaje się rozdziałowi umożliwia analizę mikrosatelitarnych regio-
na żelu agarozowym lub poliakrylamidowym nów w genomie, które wykazują polimorfizm
oraz wizualizacji. ze względu na zmienną liczbę tandemowych
ISSR zyskuje dużą popularność, co wiąże motywów nukleotydowych. Powtórzone jed-
się zarówno z względną prostotą tej techni- nostki są otoczone sekwencjami unikatowy-
ki, wysoką powtarzalnością wyników, jak i z mi, mogącymi służyć jako startery do gene-
przypuszczeniem, że markery mikrosatelitar- racji polimorficznych produktów. Sekwencje
ne mogą być sprzężone z obszarami kodują- te występują w genomie średnio co 10 kpz,
cymi. co sprawia iż mogą one służyć jako punkty
orientacyjne, względem których można loka-
MARKERY BAZUJ
CE NA REAKCJI PCR
lizować i badać określone sekwencje. System
Z ZASTOSOWANIEM SPECYFICZNYCH STARTERÓW
markerowy STS stosowany jest głównie do
zagęszczania map genetycznych oraz do po-
SSR  Mikrosatelitarny polimorfizm
szukiwania sprzężeń z cechami użytkowymi.
krótkich tandemowych powtórzeń
SCAR  Polimorfizm sekwencyjnie
SSR (ang. simple sequence repeats) opie-
charakteryzowanych regionów DNA
ra siÄ™ na analizie sekwencji mikrosatelitar-
nych DNA, składających się z powtarzalnego Użyteczność markerów RAPD może być
motywu długości 1 4 nukleotydów. Liczba zwiększona, gdy kontynuacją ich analizy jest
powtórzeń waha się w przedziale 10 50 system markerowy SCAR (ang. sequence
i może być zmienna w obrębie osobników characterized amplified region). Technika
tego samego gatunku. Dla genomu roślin- ta polega na sekwencjonowaniu końcowych
nego najbardziej charakterystycznym po- odcinków produktu RAPD, na bazie których
wtórzeniem jest dwunukleotyd (AT)n oraz projektowane są startery długości 22 30 pz
trójnukleotyd (TAT)n (MORGANTE i współaut. stosowane do amplifikacji specyficznego lo-
2002). Aby dokonać analizy sekwencji za cus. System markerowy SCAR identyfikuje
pomocą systemu SSR stosuje się biblioteki różnice sekwencyjne, które dziedziczą się
genomowe, z których, przy użyciu sondy dominacyjnie, jednakże dodatkowe podda-
mikrosatelitarnej, selekcjonuje się klony za- nie produktów PCR trawieniu restrykcyj-
wierające komplementarne loci. Wyselekcjo- nemu i rozdziałowi na denaturującym żelu
nowane klony poddaje się sekwencjonowa- poliakrylamidowym może służyć określeniu
niu, by na ich bazie zaprojektować startery homo- lub heterozygotyczności analizowane-
dla amplifikacji repetytywnego DNA. Przy go osobnika.
projektowaniu starterów korzysta się rów-
SNP  Polimorfizm pojedynczych
nież z baz danych sekwencyjnych znaczni-
nukleotydów
ków ekspresji EST (ang. expressed sequ-
ence tags) lub sekwencji spokrewnionych System SNP (ang. single nucleotide po-
gatunków. Dokonuje się także wzbogacania lymorphism) umożliwia wykrycie polimorfi-
istniejących bibliotek genomowych w se- zmu pojedynczego nukleotydu w obrębie ba-
kwencje mikrosatelitarne dzięki selektywnej danej sekwencji (BROOKES 1999). Polega na
hybrydyzacji fragmentów DNA przy użyciu amplifikacji określonego fragmentu genomu
magnetycznych kulek pokrytych streptawi- w reakcji PCR i sekwencjonowaniu uzyskane-
dynÄ… bÄ…dz
też nylonowych membran (RAKO- go produktu. Następnie dokonuje się porów-
CZY-TROJANOWSKA i BOLIBOK 2004). nania obrazów elektroforetycznych produk-
W zależności od liczby powtórzeń ele- tów amplifikacji, co pozwala na stwierdze-
mentu podstawowego na żelu poliakrylami- nie, czy mutacja w danym obszarze genomu
dowym uzyskuje się produkty o różnej dłu- miała miejsce. Zaletą tej techniki jest wysoka
gości. Zaletą systemu markerowego SSR jest wydajność identyfikacji polimorfizmu w ob-
wysoka częstotliwość identyfikacji polimor- rębie badanej sekwencji, wadą jest wysoki
ficznych sekwencji, wynikajÄ…ca ze zmiennej koszt analizy.
JOANNA SZTUBA-SOLIC
SKA
232
MARKERY BAZUJ
CE NA REAKCJI PCR
SAMPL  Polimorfizm selektywnie
I TRAWIENIU RESTRYKCYJNYM
amplifikowanych mikrosatelitarnych loci
SAMP (ang. selectively amplified microsa-
AFLP  Polimorfizm długości
telite polimorphic loci) to modyfikacja meto-
amplifikowanego fragmentu
dy AFLP skupiajÄ…ca siÄ™ na analizie polimorfi-
AFLP (ang. amplified fragment length po-
zmu sekwencji mikrosatelitarnych (MORGAN-
lymorphism) to technika polegajÄ…ca na tra-
TE i VOGEL 1994). Genomowe DNA podda-
wieniu matrycowego DNA enzymami restryk-
wane jest trawieniu restrykcyjnemu, tak by
cyjnymi, a następnie poddaniu uzyskanych
utworzyć lepki koniec, do którego przyłączo-
fragmentów dwóm rundom amplifikacji: nie-
ny zostanie adaptor. Miejsce to stanowić bę-
specyficznej i specyficznej (VOS i współaut
dzie sekwencje komplementarnÄ… dla startera
1995). Kombinacja dwóch enzymów restryk-
AFLP, zaÅ› drugi starter projektowany jest tak,
cyjnych umożliwia uzyskanie tzw. lepkich
by hybrydyzował do sekwencji mikrosateli-
końców, które są niezbędne do połączenia
tarnej. Amplifikowany fragment zawiera siÄ™
produktów trawienia z oligonukleotydowymi
więc pomiędzy miejscem restrykcyjnym a se-
odcinkami tzw. adaptorami. Po ligacji adapto-
kwencją mikrosatelitarną. Ponieważ meto-
rów prowadzona jest reakcja preamplifikacji
da ta umożliwia amplifikacje repetytywnego
z zastosowaniem starterów komplementar-
DNA, bez konieczności znajomości sekwen-
nych do adaptora i miejsca restrykcyjnego,
cji flankujÄ…cych, generuje obrazy o bardzo
posiadających na końcu 3 selektywny nu-
wysokim polimorfizmie oraz pozwala na wy-
kleotyd. Po reakcji amplifikacji niespecyficz-
krycie alleli kodominujÄ…cych.
nej prowadzi siÄ™ amplifikacjÄ™ specyficznÄ…
MARKERY OPARTE NA POLIMORFIZMIE
z użyciem starterów, które na końcu 3 po-
POJEDYNCZYCH NUKLEOTYDÓW
siadają 2 4 specyficzne nukleotydy. Rozdział
produktów PCR następuje na żelu poliakry-
SSCP  Polimorfizm konformacji
lamidowym, a detekcja poprzez barwienie
pojedynczej nici DNA
srebrem bÄ…dz
autoradiograficznie. MetodÄ™ tÄ…
charakteryzuje wysoka rozdzielczość genero-
SSCP (ang. single strand conformation
wanych wzorów prążkowych oraz możliwość
polymorphism) polega na detekcji polimor-
szybkiej detekcji polimorfizmu. System ten
fizmu z zastosowaniem elektroforezy zdena-
nie wymaga znajomości badanych sekwencji,
turowanego jednoniciowego DNA, którego
możliwe jest jego zautomatyzowanie, a także
konformacja ulega zmianie pod wpływem
konwersja w inne typy markerów.
punktowych substytucji, delecji lub inser-
cji. Jej zastosowanie umożliwia identyfikacje
CAPS  Polimorfizm trawionych
heterozygotyczności organizmów, a także
amplifikowanych sekwencji
określenie różnic strukturalnych DNA obej-
Technika CAPS (ang. cleaved amplified poly-
mujących kilka par zasad, wpływających na
morphic sequence) Å‚Ä…czy reakcjÄ™ PCR z trawie-
zmianę ruchliwości produktu w żelu polia-
niem restrykcyjnym, alternatywnie określana
krylmidowym. Metoda ta głównie stosowana
jest jako PCR-RFLP. Startery konstruowane sÄ…
w detekcji chorób genetycznych człowieka,
na podstawie znanych sekwencji DNA, cDNA
została zaadoptowana do analizy polimorfi-
lub klonowanych produktów RAPD i wybie-
zmu i detekcji mutacji w obrębie genomów
rane są tak, aby powielały produkty zawierają-
roślin hodowlanych.
ce introny, co zwiększa możliwość znalezienia
Pyrosequencing
polimorfizmu. Podstawowe produkty PCR sÄ…
poddawane trawieniu zestawem endonukleaz
Jest to technika umożliwiająca analizę po-
restrykcyjnych, a następnie rozdzielane na żelu
limorfizmu pojedynczych nukleotydów po-
agarozowym w celu wykrycia polimorfizmu.
przez sekwencjonowanie określonego locus.
System CAPS służy do identyfikacji zmienności
W trakcie amplifikacji sekwencji DNA prowa-
w sekwencji DNA i znajduje zastosowanie, gdy
dzonej w obecności specyficznego startera,
amplifikowane fragmenty DNA, nie dajÄ… siÄ™
a także polimerazy DNA, sulfurylazy ATP, lu-
zróżnicować pod względem długości. Zmien-
cyferazy i apyrazy oraz substratów, następuje
ność ta jest możliwa do wykrycia dzięki specy-
wprowadzanie poszczególnych dNTP do nici
ficznemu rozpoznawaniu i trawieniu ściśle zde-
DNA, co powoduje uwolnienie ekwimolarnej
finiowanych sekwencji przez enzymy restryk-
ilość pirofosforanu. Sulfurylaza ATP ilościo-
cyjne.
wo przekształca PPi w ATP w obecności ade-
Systemy markerów molekularnych i ich zastosowanie w hodowli
233
nozyno-5 -fosfosiarczanu. Powstały ATP gene- jest uzupełniane brakującymi nukleotydami,
ruje konwersję lucyferyny do oksylucyferyny, natomiast pyrogram jest uzupełniany przez
co powoduje emisję światła o natężeniu pro- kolejne piki generowane sygnałem świetl-
porcjonalnym do ilości produkowanego ATP. nym. Metoda ta ma przewagę nad tradycyj-
Światło to jest rejestrowane przez kamerę nym sekwencjonowaniem, gdyż umożliwia
CCD i uwidaczniane w postaci piku na pyro- jednoczesną analizę wielu prób DNA, a jej
gramie. W ostatnim etapie apyraza, degradu- nowopowstajÄ…ce modyfikacje pozwalajÄ… na
je nadmiar dNTP i ATP, wówczas dodawany obniżenie kosztów związanych z badaniami
jest kolejny dNTP i cykl siÄ™ powtarza. W cza- (AGHAJAN 2003).
sie kolejnych cykli syntezy matrycowe DNA
ZASTOSOWANIE MARKERÓW MOLEKULARYCH W HODOWLI ROŚLIN
Systemy markerów molekularnych dają moż-
Systemy markerów molekularnych stały
liwość kontroli włączania nowego materiału
się niezbędnym narzędziem diagnostycznym
genetycznego do tworzonej odmiany w dro-
nowoczesnej hodowli roślin uprawnych.
Umożliwiły pokonanie barier, których na- dze introgresji. Geny takie niejednokrotnie
warunkują ważne użytkowo cechy, takie jak:
stręczała konwencjonalna metoda hodowli,
odporność na choroby polowe, wysoką ja-
co przyczyniło się do ich szerokiego zakresu
wykorzystania w analizach (Tabela 2). Stoso- kość plonów, tak więc analiza ich obecności
wane sÄ… w kolejnych etapach tworzenia no- w genomie wspiera selekcjÄ™ hodowlanÄ… (BE-
RZONSKY i FRANCKI 1999). Często powstająca
wych, wydajnych odmian roślin uprawnych,
których prawidłowy przebieg zapewnia po- odmiana mieszańcowa, oprócz pożądanych
cech użytkowych, wykazuje także cechy dzi-
wodzenie prac hodowlanych.
kiego gatunku rodzicielskiego, które zostały
Pierwszym z podejmowanych kroków
w hodowli roślin jest dobór roślin rodziciel- niezamierzenie wprowadzone do genomu
skich spośród dostępnej puli genowej istnie- roślinnego. Podczas dalszych prac hodowla-
nych, analizy molekularne umożliwiają wery-
jących odmian. Aby właściwie ocenić zasoby
genowe pod kątem produktywności, para- fikację obecności pożądanych alleli z jedno-
czesną eliminacją genotypów posiadających
metrów jakości oraz tolerancji na abiotyczne
niechciane sekwencje DNA.
i biotyczne czynniki stresogenne, stosowano
Dobór linii rodzicielskich wykorzystywa-
dotychczas czasochłonne techniki opierające
nych w pracach hodowlanych opiera siÄ™ na
się na wielokrotnych krzyżowaniach i selekcji
fenotypowej, bÄ…dz
też analizach profili izoen- dokładnej ocenie oraz selekcji, tak by sto-
zymatycznych (KARP i współaut. 1998). Syste- pień ich pokrewieństwa odpowiadał zamie-
rzonemu celowi hodowlanemu. Podobień-
my markerów molekularnych okazały się być
stwo genetyczne wykorzystywanych genoty-
korzystniejszą alternatywą, gdyż umożliwiły
pów może być szacowane za pomocą analiz
szybszą i dokładniejszą analizę zróżnicowania
dostępnej puli genowej, identyfikację waż- morfologicznych, rodowodowych, a także
nych użytkowo cech, a także ocenę stabilno- genetycznych bazujących na systemach mar-
kerów molekularnych. Wiarygodność nie-
ści genetycznej uzyskanego potomstwa. Jest
to szczególnie ważne przy dobieraniu kom- których metod bywa dyskusyjna, zwłaszcza
jeżeli rozpatruje się wyniki analiz izoenzy-
ponentów odmian mieszańcowych. W tym
względzie coraz szersze zastosowanie do ana- matycznych lub morfologicznych. Techni-
ki molekularne okazują się być najbardziej
lizy genomów roślinnych znajdują systemy
efektywne w ocenie dystansu genetycznego
markerów mikrosatelitarnych SSR (HACKAUF
i WEHLING 2002), ISSR (DOMENIUK i współ- występującego między liniami rodzicielskimi,
a jednocześnie umożliwiają prognozę efek-
aut. 2002) oraz SAMPL (BOLIBOK i współaut.
tywności tworzenia nowych odmian mie-
2003).
Gdy materiał biologiczny, którym dys- szańcowych wykazujących ważne użytkowo
ponujemy, wykazuje zawężone zróżnicowa- cechy. Stosowane były z powodzeniem do
oceny wartości kombinacyjnej genotypów
nie genetyczne, możliwe jest zastosowanie
rodzicielskich prowadzÄ…c do wytworzenia li-
w pracach hodowlanych dzikich gatunków
spokrewnionych z daną linią w celu wpro- nii mieszańcowych kukurydzy o korzystnych
wadzenia pożądanych cech do nowotwo- cechach gospodarnych (STUBER i współaut.
1992). Dotychczas najczęściej stosowaną me-
rzonej odmiany (KELLER i współaut. 1999).
JOANNA SZTUBA-SOLIC
SKA
234
Tabela 2. Zastosowanie systemów markerów molekularnych w hodowli roślin uprawnych.
System markerów ge- Zastosowanie systemu markerowego w hodowli roślin
netycznych
RFLP  mapowanie genomów roślin uprawnych m.in. żyta, ryżu, pszenicy, jęczmienia
i kukurydzy (MALYSHEV i współaut. 2003)
 lokalizacja loci cech ilościowych (QTL) trzciny cukrowej i sorgo (JORDAN i KHUSH
2004)
 detekcja introgresji w krzyżowaniu wstecznym roślin (JENA i współaut. 1990)
 analiza pokrewieństwa genetycznego między dzikimi gatunkami ryżu a odmiana-
mi uprawnymi (BAUTISTA i współaut. 2001)
VNTR  ocena zróżnicowania genetycznego (KEANE i współaut. 1999)
 analiza ewolucyjna sekwencji minisatelitarnych (KING i FERRIS 2002)
 identyfikacja sekwencji zaangażowanych w występowanie zjawiska cytoplazma-
tycznej męskiej sterylności (NISHIZAWA i współaut. 2000).
RAPD  detekcja zróżnicowania genetycznego między genotypami soi (CAETANO-ANOLLES
i współaut. 1991)
 ocena zróżnicowania genetycznego linii rodzicielskich mieszańców rzepaku ozi-
mego (LIERSCH i współaut. 2004)
 lokalizacja sekwencji sprzężonych z genem warunkującym odporność na rdzę
brunatną pszenicy (CHEN i współaut. 2004)
 identyfikacja sekwencji specyficznych dla danej płci roślin dwupiennych (URASA-
KI i współaut. 2002).
ISSR  identyfikacja polimorfizmu sekwencji mikrosatelitarnych rzodkiewnika i spo-
krewnionych przedstawicieli rodzaju Brassica (BORNET i BRANCHARD 2004)
 lokalizacja sekwencji warunkujących użyteczne cechy ilościowe kukurydzy (DO-
MENIUK i współaut. 2002)
 mapowanie genomu pszenicy (KOJIMA i współaut. 1998)
 ocenia zróżnicowania genetycznego rzodkiewnika (BARTH i współaut. 2002).
SSR  analiza filogenetyczna i identyfikacja osobnicza ziemniaka (ASHKENAZI i współaut.
2001)
 ocena zróżnicowania kodujących sekwencji genomu żyta (HACKAUF i WEHLING.
2002)
 mapowanie genów odporności na rdzę brunatną pszenicy (ST
PIEC
i współaut.
2004)
 ocena loci cech ilościowych odpowiadających za odporność na parch pszenicy
(ZHOU i współaut. 2003)
 mapowanie genomów (ZIETKIEWICZ i współaut. 1994)
STS  mapowanie genomu pszenicy (KHLESTKINA i współaut. 2002)
 mapowanie loci QTL odpowiedzialnych za specyficzne cechy morfologiczne gro-
chu (IRZYKOWSKA i współaut. 2002)
 mapowanie genów odporności na rdzę brunatną pszenicy (ST
PIEC
i współaut.
2004)
 selekcja mutantów ryżu (KIM i współaut. 2004)
SCAR  analiza sekwencji warunkujących cytoplazmatyczną męską sterylność ryżu (YANG
i współaut. 2002)
 identyfikacja genu Sex1 determinującego płeć papai (DEPUTY i współ. 2002)
 mapowanie mutacji warunkujących partenokarpiczne owoce (BERALDI i współ-
aut. 2004)
Systemy markerów molekularnych i ich zastosowanie w hodowli
235
SNP  identyfikacja mutacji punktowych w obrębie genu odporności na rdzę liściową
pszenicy (TYRKA i współaut. 2004)
 badanie ekspresji genów u roślin poliploidalnych (MOCHIDA i współaut. 2003)
AFLP  analiza zmian genetycznych indukowanych naturalnym procesem starzenia siÄ™
nasion żyta (CHWEDORZEWSKA i współaut. 2002)
 identyfikacja locus przywracającego płodność dzikich gatunków buraka (TOUZET
i współaut. 2004)
 lokalizacja genu odporności na mączniaka właściwego (SINGRUN i współaut.
2004)
 identyfikacja zmienności sekwencyjnej (VOS i współaut. 1995)
CAPS  mapowanie genu odporności na rdzę liściową pszenicy jarej (CHEA
KOWSKI
i współaut. 2003)
 mapowanie genu odporności na rdzę Brassica juncea (VARSHNEY i współaut.
2004).
 mapowanie mutacji pat warunkującej powstawanie partenokarpicznych owoców
pomidora (BERALDI i współaut. 2004)
 ocenia zróżnicowania genetycznego rzodkiewnika (BARTH i współaut. 2002).
SAMPL  ocena zróżnicowania genetycznego żyta ozimego (BOLIBOK i RAKOCZY-TROJANOW-
SKA 2003) i pszenicy uprawnej (ROY i współaut. 2002)
 ocena pokrewieństwa genetycznego odmian uprawnych batata (TSENG i współ-
aut. 2002)
 identyfikacja polimorfizmu sekwencji mikrosatelitarnych (MORGANTE i VOGEL
1994)
SSCP  analiza polimorfizmu i detekcji mutacji w obrębie genomów mutantów ryżu
(SATO i NISHIO 2003)
 lokalizacja mutacji w obrębie genu gf-2.8 warunkującego odporność na zasolenie
mutantów pszenicy (WANG i współaut. 2001)
Pyrosequencing  detekcja mutacji punktowych w obrębie genomu (PACEY-MILLER i HENRY 2003)
 ocena mutacji punktowych roślin poliploidalnych m.in.: tetraploidalnego ziem-
niaka (RICKERT i współaut. 2002) i heksaploidalnej pszenicy (MOCHIDA i współaut.
2003)
todą oceny zróżnicowania genetycznego był dzone są analizy, mające na celu ich identy-
system markerowy RFLP oparty na hybrydy- fikację i eliminację, a także tworzenie linii
zacji trawionego DNA z polimorficzną sondą. o zwiększonej wartości kombinacyjnej (SILLS
Jako, że system ten wymaga dużego nakładu i NIENHUIS 1998).
czasu i kosztów związanych ze znalezieniem Ważnym etapem prac hodowlanych jest
polimorficznej sondy i odpowiedniego dobo- ocena uzyskanego potomstwa, majÄ…ca na
ru enzymu restrykcyjnego, obecnie częściej celu wybór najlepszej linii pod kątem ana-
stosuje się metody opierające się na reakcji lizowanych cech. Systemy markerów mole-
PCR. Przeprowadzając analizy molekularne kularnych umożliwiają lokalizację sekwencji
dla niektórych gatunków roślin uprawnych sprzężonych z genami warunkującymi ważne
wykazano, iż prosta detekcja pokrewieństwa użytkowo cechy, dzięki czemu możliwe jest
genetycznego między liniami bywa niewy- pominięcie kosztownej i długotrwałej oceny
starczajÄ…ca w przypadku tworzenia odmian fenotypowej linii hodowlanych. W zwiÄ…zku
mieszańcowych. Zidentyfikowano bowiem z tym znajdują one zastosowanie w selekcji
geny kontrolujące proces rozszczepienia materiału hodowlanego MAS (ang. marker
użytecznych cech mieszańców oraz sprzęże- assisted selection). W selekcji standardo-
nia genów obniżające żywotność potomstwa wo stosuje się linie donorową prezentującą
mieszańcowego (FU 1999). Występowanie w formie homozygotycznej ważny użytko-
takich czynników genetycznych w badanych wo gen lub geny, zaś drugim komponentem
genotypach może zakłócić przebieg tworze- jest odmiana, której wartość hodowlana ma
nia mieszańców, w związku z tym, prowa- być udoskonalona poprzez wprowadzenie
JOANNA SZTUBA-SOLIC
SKA
236
określonego genu z linii donorowej. Syste- umożliwiła wykrycie genów lub regionów
my markerów genetycznych, takie jak RFLP, kodujących ważne ekonomicznie cechy pro-
SCAR, CAPS, znajdujÄ… zastosowanie w iden- dukcyjne. Na podstawie przeprowadzonych
tyfikacji obu komponentów poprzez odróż- analiz molekularnych możliwa jest selekcja li-
nienie homozygotycznych genetypów od nii donorowych wykazujących najkorzystniej-
heterozygotycznych. Możliwe jest także sto- szą kombinację pożądanych alleli, bądz
też
sowanie w tym celu systemów markerowych jednej linii posiadającej skumulowane waż-
o dominującym typie dziedziczenia, takich ne użytkowo geny. Następnie wykorzystuje
jak AFLP lub RAPD, jednakże należy poddać się je w pracach hodowlanych mających na
je konwersji w systemy SCAR lub CAPS (BRA- celu uzyskania genotypu o optymalnej kom-
DEEN i SIMON 1998). Strategia wprowadzania binacji genów warunkujących określoną ce-
ważnego użytkowo genu do udoskonalanej chę ilościową (ROMAGOSA i współaut. 1999).
odmiany opiera się na konwencjonalnym Selekcja materiału hodowlanego opierająca
krzyżowaniu wstecznym, a uzyskane poko- się na technikach DNA może również przy-
lenie ocenia się pod kątem heterozygotycz- spieszyć proces odtwarzania linii rodziciel-
ności badanego genu i stosuje w kolejnym skich w procesie krzyżowania wstecznego
krzyżowaniu. Proces eliminacji  niechcianych oraz identyfikację roślin o wysokim stopniu
genów pochodzących od linii donorowej pokrewieństwa dla odtwarzania genotypów
można przyspieszyć dzięki zastosowaniu sys- macierzystych.
temów markerowych w kolejnych rundach Systemy markerów molekularnych wyko-
krzyżówania wstecznego, jednakże muszą rzystywane są również w połączeniu z tech-
one różnicować komponenty rodzicielskie. niką BSA (ang. bulk segregant analysis) (BED-
Wykazano, iż dobór prowadzony w kierunku NAREK i współaut. 2002). Metoda ta zakłada
cechy warunkowanej pojedynczym genem możliwość identyfikacji sekwencji warunku-
z wykorzystaniem systemów markerów mo- jących określoną cechę użytkową, poprzez
lekularnych, okazuje się być wysoce efektyw- porównanie wzorów molekularnych roślin
ny u różnych gatunków roślin uprawnych segregujących pod względem danej właści-
(RHARRABTI i współaut. 2000). wości o skrajnie różnych fenotypach. Mapo-
Systemy markerowych DNA znajdują rów- wanie genomów roślin należących do dużej
nież zastosowanie w badaniu genów kontro- populacji jest procedurą kosztowną i czaso-
lujących poligeniczne cechy ilościowe. Anali- chłonną. Grupowanie osobników pod wzglę-
za molekularna loci cech ilościowych (QTL) dem wysokiego i niskiego poziomu ekspresji
pozwala na oszacowanie ilości genów kon- fenotypowej danej właściwości, a następnie
trolujących daną właściwość odmiany upraw- przeprowadzanie analiz molekularnych tylko
nej, poziom wpływu każdego z tych loci na na dwóch próbach zbiorczych DNA, umożli-
jej ekspresję, a także ich lokalizację w geno- wia przyspieszenie badań mających na celu
mie (IRZYKOWSKA i WOLKO 2004). Selekcja lokalizacjÄ™ sekwencji warunkujÄ…cych cechy
genów warunkujących cechy ilościowe jest jedno-, jak i wielogenowe. Podczas gdy ma-
utrudniona, co wynika z dużej liczby alleli powanie loci cech ilościowych (QTL) jest
zaangażowanych w powstanie danej właści- najbardziej precyzyjną metodą lokalizacji ge-
wości. Należy więc ograniczyć się do odna- nów warunkujących określone właściwości,
lezienia loci o dużym wpływie na rozpatry- analiza BSA jest wartościową alternatywą,
waną cechę lub też genów sprzężonych z ce- dzięki której można uniknąć pracochłonnej
chą w tak dużym stopniu, że stają się one analizy każdego osobnika z danej populacji.
podstawą dalszej diagnostyki. Systemy mar- Technika ta nie tylko umożliwia identyfika-
kerów molekularnych znalazły zastosowanie cję alleli warunkujących cechy użytkowe, ale
w tworzeniu odpowiednio nasyconych map również pozwala na ocenę frekwencji ich
sprzężeń, które umożliwiają efektywną loka- występowania w obrębie populacji (QUARRIE
lizację QTL, a także analizę sprzężeń pomię- i współaut. 1999). Najczęściej wykorzystywa-
dzy genami cechy ilościowej, a genami ce- nymi systemami markerowymi w technice
chy jakościowej, ustalanie rodzaju zależności BSA są RFLP i SSR, ze względu na ich kodo-
pomiędzy fenotypami tych cech, określenie minacyjny charakter umożliwiający identyfi-
rodzaju segregacji alleli oraz szacowanie czę- kację najbardziej wartościowych rekombinan-
stotliwości rekombinacji pomiędzy badanymi tów wykorzystywanych w hodowli (HACKAUF
loci. Dzięki temu, u wielu gatunków roślin i WEHLING 2002).
uprawnych, analiza molekularna sekwencji W momencie uzyskania ulepszonych od-
oraz ich sprzężeń z cechami ilościowymi, mian roślin uprawnych, niezbędne staje się
Systemy markerów molekularnych i ich zastosowanie w hodowli
237
opracowanie narzędzi umożliwiających ich są publikowane w specjalnych katalogach.
precyzyjną identyfikację. Identyfikacja roślin Obecnie prowadzone analizy potwierdzają
uprawnych dokonywana jest przez międzyna- przewagę systemów markerów molekular-
rodowe organizacje UPOV (ang. The Interna- nych, takich jak SSR, SNP i AFLP, nad dotÄ…d
tional Union for The Protection of New Va- stosowanymi badaniami białek. Dowiedziono,
rieties of Plants) oraz ISTA (ang. Internatio- że markery molekularne stanowią wiarygod-
nal Seed Testing Association) przeprowadza- ne, dostępne i wydajne narzędzie oceny czy-
jące analizy biochemiczne białek zapasowych stości odmian (LAW i współaut. 1998). Tech-
nasion oraz badania izoenzymatyczne, a opra- niki te podlegają ciągłemu rozwojowi, a ich
cowywane wykazy odmian hodowlanych zakres zastosowania staje siÄ™ coraz szerszy.
PODSUMOWANIE
Systemy markerowe rozwijane przez ukowcy napotykajÄ… pewne bariery utrud-
ostatnie dziesięciolecia, wpłynęły w znaczący niające pracę w oparciu o te techniki. Duża
sposób na postęp osiągnięty w hodowli i ge- odległość dzieląca polimorficzne sekwencje
netyce roślin. Obecny stan wiedzy na temat i geny warunkujące użyteczne cechy, zwięk-
organizacji i struktury genomów roślinnych sza prawdopodobieństwo zachodzenia mię-
umożliwił przyspieszenie prac związanych dzy nimi crossing-over. System markerowy
z mapowaniem genomów roślinnych, analizą umożliwiający monitorowanie segregacji
loci cech ilościowych i jakościowych, zaś ana- danego genu podczas krzyżowania, może
liza sekwencji sprzężonych z ważnymi eko- okazać się wówczas nieskuteczny w dalszej
nomicznie cechami stała się niezbędnym ele- selekcji osobników. Podejmując badania
mentem prac hodowlanych. Prowadzone sÄ… opierajÄ…ce siÄ™ na technikach molekularnych
intensywne badania nad doskonaleniem me- należy brać pod uwagę nie tylko ich ogrom-
tod mapowania loci cech ilościowych (QTL) ne zalety, ale także być świadomym ich ogra-
z wykorzystaniem złożonych analiz kompu- niczeń, które mogą wpływać na uzyskane
terowych, które umożliwią uszczegóławianie wyniki badań. Wybór systemu markerowego
obecnie istniejących map genowych roślin. należy uzależnić od celu badawczego, wyma-
Molekularne technologie markerowe stały się ganego poziomu polimorfizmu, skali analiz,
integralną częścią programów hodowlanych, a także takich czynników jak wyposażenie
znajdujÄ…c zastosowanie w transferze i mody- laboratorium oraz fundusze przeznaczone na
fikacji genów między oddalonymi gatunkami badania. Uwzględnienie wyżej wymienionych
roślin. Mimo wszechstronnego zastosowania czynników może dopomóc w realizacji pro-
metod molekularnych w genetyce roślin, na- jektu naukowego.
MOLECULAR MARKERS SYSTEMS AND THEIR APPLICATION IN PLANT BREEDING
Summary
The development of molecular techniques has tremendous advances in the area of plant breeding.
led to significant improvement in our knowledge The first developed marker system, RFLP, has laid
of plant genetics and understanding of the molecu- the groundwork for modern genetic analysis and
lar mechanisms operating within plant genomes. its numerous improvements led to development of
Considerable emphasis has been laid on the use of separate systems such as RAPD and AFLP. The in-
molecular markers in studying DNA sequence vari- creasing knowledge of genotypes, acquired through
ation among species, monitoring genetic variation genome sequencing projects, enabled designing of
and in genotype identification. Molecular (genetic) marker systems based on highly specific motifs such
marker is defined as a sequence on a chromosome as minisatellite and microsatellite DNA repeats. Oth-
with specific location e.g. restriction enzyme cut- er molecular marker-based systems like sequence-
ting site, coding regions of DNA or segment of DNA tagged sites (STS), sequence characterized amplified
with no known coding function but with determi- regions (SCAR) and single nucleotide polymorphism
nable inheritance pattern. Improvements in marker (SNP) have been routinely used to assist selection
systems and in the techniques used to identify DNA for desirable characters, comparative mapping, se-
sequences linked to useful traits, have both enabled quencing of plant genomes and breeding programs.
JOANNA SZTUBA-SOLIC
SKA
238
LITERATURA
AGHAJAN M., 2003. Pyrosequencing in a Microchan- ent breeding schemes. Theor. Appl. Genet. 98,
nel. NNUN REU Program at Stanford Nanofabri- 337 346.
cation Facility, 74 75. HACKAUF B., WEHLING P., 2002. Identyfication of mi-
ASHKENAZI V., CHANI E., LAVI U., LEVY D., HILLEL J., crosatellite polymorphisms in an expressed por-
VEILLEUX R. E., 2001. Development of microsatel- tion of the rye genome. Plant Breed. 12, 17 25.
lite markers in potato and their use in phyloge- IRZYKOWSKA L, WOLKO B., 2004. Interval mapping
netic and fingerprinting analyses. Genome 44, of QTLs controlling yield-related traits and seed
50 62. protein content in Pisum sativum. J. Appl. Ge-
BARTH S., MELCHINGER A. R., LUBBERSTEDT T., 2002. Ge- net. 45, 297 306.
netic diversity in Arabidopsis thaliana L. Heynh. IRZYKOWSKA L., WOLKO R., ÅšWI
CICKI W. K., 2002. In-
Investigated by cleaved amplification polymor- terval mapping of QTLs controlling some mor-
phic sequence (CAPS) and inter-simple sequence phological traits in pea. Cell. Mol. Biol. Lett. 7,
repeat (ISSR) markers. Mol. Ecol. 11, 495 505. 665 670.
BAUTISTA N. S., SOLIS R., KAMIJIMA O., ISHII T., 2001. JENA K. K., KHUSH G. S., 1990. Introgression of genes
RAPD, RFLP and SSLP analyses of phylogenetic from 0ryza officinalis Wall. ex Watt to culti-
relationships between cultivated and wild spe- vated rice. 0. sativa L.. Theor. Appl. Genet. 80,
cies of rice. Genes Genet. Syst. 76, 71 79. 737 745.
BEDNAREK P. T., KUBICKA H., KUBICKA M., 2002. Mor- JORDAN D. R., CASU R. E., BESSE P., CARROLL B. C.,
phological, cytological and BSA-based testing on BERDING N., MCINTYRE C. L., 2004. Markers asso-
limited segregation population AFLPs. Cell. Mol. ciated with stalk number and suckering in su-
Biol. Lett. 7, 635 48. garcane colocate with tillering and rhizomato-
BERALDI D., PICARELLA M. E., SORESSI G. P., MAZZUCA- usness QTLs in sorgium. Genome 47, 988 993.
TO A., 2004. Fine mapping of the partenocarpic KARP, A., ISAAC, P. G., INGRAM, D. S., 1998. Molecular
fruit (pat) mutation in tomato. Theor. Appl. tools for screening biodiversity: plants and ani-
Genet. 108, 209 216. mals. London: Chapman and Hall.
Berzonsky W. A., Francki G. M., 1999. Biochemical, KEANE B., PELIKAN S., TOTH G. P., SMITCH M. K., ROGS-
molecular, and cytogenetic technologies for cha- TAD S., 1999. Genetic diversity of Typha latifolia
racterizing 1RS in wheat: A review. Euphytica (Typhaceae) and the impact of pollutants exam-
108, 1 19. ined with tandem-repetitive DNA probes. Am. J.
BOLIBOK H., RAKOCZY-TROJANOWSKA M., 2003. Evalu- Bot. 86, 1226 1238.
ating the efficiency of SAMPL marker system in KELLER M., KELLER B., SCHACHERMAYR G., WINZELER
assessing genetic diversity in winter rye (Secale M., SCHMID J. E., STAMP P., MESSMER M. M., 1999.
cereale L.). 7th Internat. Congress of Plant Mol. Quantitative trait loci for resistance against
Biol. Barcelona. powdery mildew in a segregating wheat x spelt
BORNET B., BRANCHARD M., 2004. Use of ISSR finger- population. Theor. Appl. Genet. 98, 903 912.
prints to detect microsatellites and genetic diver- KHLESTKINA E. K., PESTSOVA E. G., SALINA E., RODER M.
sity in several related Brassica taxa and Arabi- S., ARBUZOVA V. S., KOVAL S. F., BORNER A., 2002.
dopsis thaliana. Hereditas 140, 245 248. Genetic mapping and tagging of wheat genomes
BRADEEN J. M., SIMON P. W., 1998. Conversion of an using RAPD, STS, SSR markers. Cell. Mol. Biol.
AFLP fragment linked to the caroot Y2 locus to Lett. 7, 795 802.
a simple, codominant, PCR-based marker form. KIM D. S., LEE I. S., JANG C. S., KANG S. Y., SONG H. S.,
Theor. Appl. Genet. 97, 960 967. LEE Y. I., SEO Y. W., 2004. Development of AFLP-
BROOKES, A. J., 1999. The essence of SNPs. Gene 234, derived STS markers for the selection of 5-meth-
177 186. yltryptophan-resistant rice mutants. Plant Cell
CAETANO-ANOLLES G., BASAM B. J., GRESSHOFF P. M., Rep. 23, 71 80.
1991. DNA amplification fingerprinting using KING R.A., FERRIS C., 2002. A variable minisatellite
very short arbitrary oligonucleotide primers. sequence in the chloroplast genome of Sorbus L.
Bio/Technology 9, 553 557. (Rosaceae: Maloideae). Genome 45, 570 600.
CHEA
KOWSKI, J., GOLKA, L., ST
PIEC
. A
., 2003. Appli- KOJIMA T., NAGAOKA T., NODA K., OGIHARA Y., 1998.
cation of STS markers for leaf rust resistance Genetic linkage map of ISSR and RAPD markers
genes in near-isogenic lines of spring wheat cv. in Einkorn wheat in relation to that of mark-
Thatcher. J. Appl. Genet. 44, 323 338. ers. Theor. Appl. Genet., 96, 37 45.
CHEN X. H., NIU Y. C., HU B. Z., 2004. Identyfication KORNBERG A., LIEBERMAN I., SIMMS E. S., 1955. Enzy-
of RAPD markers linked to the resistance gene matic synthesis of purine nucleotides. J. Biol.
Yr5 against wheat stripe rust with denaturing Chem. 215, 417 427.
PAGE-silver stining. Yi. Chuan. Xue. Bao. 31, LAW J. R., DONINI P., KOEBNER R. M. D., REEVES J. C.,
270 274. COOKE R. J., 1998. DNA profiling and plant vari-
CHWEDORZEWSKA K. J., BEDNAREK P. T., PUCHALSKI J., ety registration. III: the statistical assessment of
KRAJEWSKI P., 2002. AFLP-profiling of long-term distinctness in wheat using amplified fragment
stored and regenerated rye Genebank samples. length polymorphisms. Euphytica 102, 335 342.
Cell. Mol. Biol. Lett. 7, 457 463. LIERSCH A., BARTKOWIAK-BRODA I., OGRODOWCZYK M.,
DEPUTY J. C., MING R., MA H., LIU Z., FITCH M. M., KRÓTKA K., 2004. Związek pomiędzy heterozją
WANG M., MANSHARDT R., STILES J. I. 2002., Mo- i dystansem genetycznym oceniony na podsta-
lecular markers for sex determination in papa- wie polimorfizmu markerów RAPD u rzepaku
ya (Carica papaya L.). Theor. Appl. Genet. 106, ozimego (Brassica napus L.). Genetyka w ulep-
107 111. szaniu roślin użytkowych. Instytut Genetyki Ro-
DOMENIUK V. P., BELOUSOV A. A., SIVOLAP IU. M., 2002. ślin PAN w Poznaniu 2004, 261 268.
DNA-marking of quantitive traits in corn. Tsitol. MALYSHEV S. V., KORZUN V. N., ZABEN KOVA K. I., VO-
Genet. 36, 9 15. ILOKOV A. V., BERNER A., KARTEL N. A., 2003.
FU Y. B., 1999. Patterns of the purging of deleteri- Comparitive molecular-genetic mapping of ge-
ous genes with synergistic interactions in differ- nomes of ryse (Secale cereale L.) and other cere-
als. Tsitol. Genet. 37, 9 20.
Systemy markerów molekularnych i ich zastosowanie w hodowli
239
MAXAM A. M., GILBERT W., 1977. A new method for cation and general properties. J. Mol. Biol. 51,
sequencing DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 379 391.
560. SOUTHERN E. M., 1975. Detection of specific sequenc-
MOCHIDA K., YAMAZAKI Y., OGIHARA Y., 2003. Discrim- es among DNA fragments separated by gel elec-
ination of homoeologous expression in hexa- trophoresis. J. Mol. Biol. 98, 503 517.
ploid wheat by SNP analysis of contigs grouped ST
PIEC
A
., BA
ASZCZYK L., CHEA
KOWSKI J., 2004. Marke-
from a large number of expressed sequence ry DNA dla identyfikacji genów odporności na
tags. Mol. Genet. Genomics 270, 371 377. rdzÄ™ brunatnÄ… u pszenicy uprawnej. Genetyka
MORGANTE M., HANAFEY M., POWELL W., 2002. Micro- w ulepszaniu roślin użytkowych, Instytut Gene-
satellites are preferentially associated with non- tyki Roślin PAN w Poznaniu, 309 318.
repetitive DNA in plant genomes. Nat. Genet. 30, STUBER C. W., LINCOLN S. E., WOLFF D. W., HELENTJA-
194 200. RIS T., LANDER E. S., 1992. Identification of genet-
MORGANTE M., VOGEL J., 1994. Compound microsat- ic factors contributing to heterosis in a hybrid
ellite primers for the detection of genetic poly- form elite maize inbred lines using molecular
morphisms. U.S. Patent Appl 08/326456 markers. Genetics 132, 823 839.
NEUHAUS-URL G., NEUHAUS G., 1993. The use of the TOUZET P., HUEBER N., BURKHOLZ A., BARNES S., CU-
nonradioactive digoxigenin chemiluminescent GUEN J., 2004. Genetic analysis of male fertility
technology for plant genomic Southern blot hy- restoration in wild cytoplasmic male sterility G
bridization: a comparison with radioactivity. of beet. Theor. Appl. Genet. 109, 240 247.
Transgenic Res. 2, 115 120. TSENG Y. T., LO H. F., HWANG S. Y., 2002. Genotyp-
NISHIZAWA S., KUBO T., MIKAMI T., 2000. Variable ing and assessment og genetic relationships in
number of tandem repeat loci in the mitochon- elite polycross breeding cultivars of sweet potato
drial genomes of beets. Curr. Genet. 37, 34 38. in Taiwan based on SAMPL polymorphisms. Bot.
PACEY-MILLER T., HENRY R. J., 2003. Single-nucleotide Bull. Acad. Sin. 43, 99 105.
polymorphism detection in plant using a single- TYRKA M., BLASZCZYK L., CHELKOWSKI J., LIND V.,
stranded pyrosequencing protocol with a uni- KRAMER I., WEILEPP M., WISNIEWSKA H., ORDON F.,
versal biotinylated primer. Anal. Biochem. 317, 2004. Development of the single nucleotide poly-
166 170. morphism marker of the wheat Lr1 leaf rust re-
QUARRIE S. A., LAZIĆ-JAN
IĆ V., KOVA
IEVIC D., STEED sistance gene. Cell. Mol. Biol. Lett. 9, 879 889.
A., PEKIĆ S., 1999. Bulk segregant analysis with URASAKI N., TOKUMOTO M., TARORA K., BAN Y., KAY-
molecular markers and its use for improving ANO T., TANAKA H., OKU H., CHINEN I., TERAUCHU
drought resistance in maize. J. Exp. Bot. 50, R., 2002. A male and hermaphrodite specific
1299 1306. RAPD marker for papaya (Carica papaya L.).
RAKOCZY-TROJANOWSKA M., BOLIBOK H., 2004. Char- Theor. Appl. Genet. 104, 281 285.
acteristic and a comparision of three classes of VARSHNEY A., MOHAPATRA T., SHARMA R. P., 2004. De-
microsatellite-based markers and their applica- velopment and validation of CAPS and AFLP
tion in plants. Cell. Mol. Biol. Lett. 9, 221 238. markers for white rust resistance gene in Bras-
RICKERT A. M., PREMSTALLER A., GEBHARDT C., OEFNER sica juncea. Theor. Appl. Genet. 109, 153 159.
P. J., 2002. Genotyping of Snps in a polyploid VOS P., HOGERS R., BLEEKER M., REIJANS M., VAN DE LEE
genome by pyrosequencing. Biotechniques 32, T., HORNES M., FRIJTERS A., POT J., PELEMAN J., KUI-
592 593, 596 598. PER M., ZABEAU M., 1995. AFLP: a new technique
RHARRABTI Y., ELHANI S., MARTOS NUÅ„EZ V. Y GARCÍA for DNA fingerprinting. Nucleic Acid Res., 23,
DEL MORAL L. F., 2000. Relationship between 4407 4414.
some quality traits and yield of durum wheat WANG C. T., HUANG Z. J., HE C. F., BI C. L., SHEN Y.
under southern Spain conditions. [W:] Durum Z., 2001. Detection of the wheat salt-tolerant-
wheat improvement in the Mediterranean re- -mutant using PCR-SSCP combining with direct
gion: New challenges. ROYO C., NACHIT M. M., DI sequencing. Yi Chuan. Xue Bao. 28, 852 855.
FONZO N., ARAUS, J. L. (red.). Options Méditerra- WATSON J. D., CRICK F. H. C., 1953. A Structure for
néennes 40, 529 531. Deoxyribose Nucleic Acid. Nature 171, 737 738.
ROMAGOSA I., HAN F., ULLRICH S. E., HAYES P. M., WE- WELSH J., MCCLELLAND M., 1990. Fingerprinting ge-
SENBERG D. M., 1999. Verification of yield QTL nomes using PCR with arbitrary primers. Nucl.
through realized molecular marker- assisted se- Acids Res. 8, 7213 7218.
lection responses in a barley cross. Mol. Breed. WILLIAMS J. G. K., KUBELIK A. R., LIVAK K. J., RAFAL-
5, 143 152. SKI J. A., TINGEY S. V., 1990. DNA polymorphisms
ROY J. K., BALYAN H. S., PRASAD M., GUPTA P. K., 2002. amplified by arbitrary primers are useful as ge-
Use of SAMPL for a study of DNA polymorphism, netic markers. Nucl. Acids Res. 18, 6531 6535.
genetic diversity and possible gene tagging in YANG J. B., WANG X. F., ZHAO C. S., XIANG T. H., LI L.,
bread wheat. Theor. Appl. Genet. 104, 465 472. 2002. Cloning and sequencing of fragments as-
SATO Y., NISHIO T., 2003. Mutation detection in rice sociated with cytoplasm male sterility of rice. Yi
waxy mutants by PCR-RF-SSCP. Theor. Appl. Chuan Xue Bao. 29, 808 813.
Genet. 3, 560 567. ZHOU W- C., KOLB F. L., BAI G- H., DOMIER L. L., BOZE
SILLS, G., NIENHUIS J., 1998. Changes in DNA-marker L. K., SMITH N. J., 2003. Validation of a major
frequencies associated with response to contrast- QTL for scrab resistance with SSR markers and
ing selection methods in Arabidopsis. Theor. use of marker-assisted selection in wheat. Plant
Appl. Genet. 97, 275 282. Breed. 122, 40 46.
SINGRUN CH., HSAM S. L., ZELLER F. J., WENZEL G., MOH- ZIETKIEWICZ E., RAFALSKI A., LABUDA D., 1994. Genome
LER V., 2004. Localization of a novel recessive fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-
powdery mildew resistance gene from common anchored polymerase chain reaction amplifica-
wheat line RD30 in the terminal region of chro- tion. Genomics 20, 176 183.
mosome 7AL. Theor. Appl. Genet. 109, 210 214.
SMITH H. O., WILCOX K. W., 1970. A restriction en-
zyme from Hemophilus influenzae. 1. Purifi-