Kultury Tkankowe
Zwierzęce i Roślinne
Wykład 6
Hodowle komórkowe w badaniach
podstawowych, farmakologii i medycynie
[e-mail]
Pierwsza linia ludzkich komórek nowotworowych została
wyprowadzona w roku 1951 przez George Otto Geya w laboratorium
Johna Hopkinsa (Baltimore, Maryland).
Pochodziła z biopsji raka szyjki macicy (adenocarcinoma) od
chorej 30 letniej czarnej kobiety Henrietty Lacks, i została nazwana
HeLa.
Dr Gey stosował podłoże złożone z: plazmy kurzej, ekstraku z
płodu cielęcia i ludzkiej surowicy z naczyń łożyska.
Hodował te komórki w obrotowych próbówkach (roller-tube
technique)
Komórki Hela powszechnie stosowano w pierwszych latach
po wyizolowaniu; mało wymagające, duży potencjał wzrostu.
Wiele różnych linii zostało zainfekowanych tymi komórkami
w różnych laboratoriach.
Znanych jest wiele sublinii HeLa, np. HeLa S3).
Obecnie znane są tysiące ustalonych linii komórkowych
pochodzenia ludzkiego i zwierzęcego (głównie mysiego).
Są to w większości linie nowotworowe, ale wiele jest linii
komórek prawidłowych (fibroblasty, keratynocyty, komórki
śródbłonka naczyń).
Kolekcje linii komórkowych
" Kolekcje linii komórkowych posiada wiele krajów, a najbardziej
znane kolekcje to:
" The American Type Culture Collection, ATCC
" The European Collection of Cell Cultures (ECCC) w Wielkiej
Brytanii
" Deutche Samlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,
DSMZ
" Wszystkie linie przed włączeniem do kolekcji są testowane dla
potwierdzenia rodzajów komórek (izoenzymy, testy DNA,
kariotypowanie), oraz na obecność mikoplazmy (mycoplasma),
bakterii i grzybów
Zastosowanie hodowli komórek
" Hodowle komórek do produkcji szczepionek
przeciwwirusowych
" Produkcja przeciwciał monoklonalnych
" Produkcja interferonów (IFað, IFbð, IF gð) i czynników
wzrostowych (EGF, FGF,TGF, IGF)
" Produkcja hormonów (growth hormone - GH, insulina)
" Hodowle komórek macierzystych (nadzieja na leczenie
wielu chorób degeneracyjnych, neurologicznych,
urazów rdzenia kręgowego, zawałów serca, cukrzycy,
uszkodzenia siatkówki)
" Hodowla komórek układu kostnego do autotransplantacji
(regeneracja złamań i trudno gojących się ubytków kości) i do
testowania endoprotez
" Hodowle sztucznych konstruktów tkanek (kultury
narządowe/organotypowe), np. skóry i komórek śródbłonka
naczyń, komórek rogówki, kardiomiocytów
" Zapłodnienie in vitro
" Hodowle komórek niezbędne w różnego rodzaju badaniach
biologicznych (toksykologia, badanie interakcji różnych typów
komórek wchodzących w skład tkanek - kokultury, badania
transferu genów, badania sygnalizacji międzykomórkowej,
różnicowania komórek, śmierci apoptotycznej, odpowiedzi na
czynniki uszkadzajÄ…ce DNA itp.)
" Hodowle pierwotne z wycinków tkanek (primary
cultures); wzrost typu monolayer
" Szczególna aseptyka (płukanie w antybiotykach)
" Rozdrobnienie tkanki
" Trawienie enzymami proteolitycznymi (trypsyna, kolagenaza,
dispaza, temp. 37oC, czas dobrany do rodzaju tkanki)
" Sączenie przez siatki (zatrzymujące tkankę łączną, włókna
kolagenu, większe agregaty)
" Wirowanie
" Zawieszenie w odpowiednim medium
" Wysiewanie do butelek hodowlanych lub płytek
" Inkubacja w atmosferze CO2
Zakładanie hodowli pierwotnych (z tkanek płodów mysich)
Skrawki (eksplanty) przenoszone bezpośrednio na płytkę.
Po trawieniu enzymatycznym (trypsyną) można założyć hodowlę
zawiesiny rozproszonych komórek.
Można też hodować bezpośrednio niewielkie skrawki tkanki (np.
skrawki skóry dla pozyskania fibroblastów).
Primary Explant Culture
Pierwotna hodowla skrawka guza
mysiego raka skóry (widoczny
fragment tkanki i wczesny wzrost,
ok. 3 dni)  górny obraz
Dolny obraz: Wzrost komórek
nowotworowych po usunięciu
skrawka (ok. 7 dni od założenia
hodowli).
W podobny sposób ze skrawka
skóry można uzyskać hodowlę
fibroblastów.
" naskórek
" tkanka Å‚Ä…czna wiotka
skóra
skóry właściwej
właściwa
" tkanka Å‚Ä…czna zbita
skóry właściwej
" tkanka podskórna (tkanka łączna
tłuszczowa)
naskórek
tkanka Å‚Ä…czna
wiotka
tkanka Å‚Ä…czna
zbita
tkanka
podskórna
Skóra wyhodowana in vitro Preparat histologiczny skrawka skóry
" Hodowla komórek skóry
" Zastosowanie w transplantologii do leczenia poważnych
rozległych oparzeń
" Znaczne fragmenty skóry namnaża się z autologicznych
komórek biorcy
" Najlepiej udaje się w układzie kokultywacji komórek
nabłonkowych (keratynocytów) na macierzy ECM (kolagen)
razem z dermatocytami (fibroblastami)
" Keratynocyty produkujÄ… IL-1, pobudzajÄ…cÄ… fibroblasty do
produkcji czynnika wzrostu keratynocytów (KGF) (regulacja
parakrynna)
" Keratynocyty różnicują się jeśli rosną w kontakcie z powietrzem
" Nie jest wymagana surowica
Do lat 50-tych 20 wieku materiałem do badań były głównie
eksplanty i komórki (fibroblasty) pochodzące z zarodków
kurzych (hodowle w kropli wiszÄ…cej
Komórki fibroblastów ludzkich w hodowli widziane w
mikroskopie z kontrastem fazowym powiększenie
1000x
" Wkrótce przekonano się, że lepszym modelem badawczym
od zarodków kurzych są tkanki ssaków, przede wszystkim
myszy, które nadawały się do indukowania guzów
przeszczepialnych. Guzy te stały się dobrym materiałem do
hodowli i wyprowadzania linii komórkowych.
" Obecnie używa się często ksenogenicznych przeszczepów
nowotworów ludzkich hodowanych na myszach
bezgrasiczych/nagich, (ang. nude mice);
przeszczepy autologiczne, allogeniczne, ksenogeniczne
" Wiele badań prowadzi się na komórkach izolowanych z
zarodków mysich, także na firoblastach izolowanych z
zarodków kurzych
Mysz bezgrasicza (nude mice)
Ksenogeniczny przeszczep
ludzkiego nowotworu (raka
krtani) u myszy  nagiej
przed leczeniem hipertermiÄ…
Na myszach  nagich
testuje się też hodowane
in vitro (różnymi metodami)
tzw. zamienniki skóry
ludzkiej, HDE (human
dermal equivalent)
Zastosowania hodowli komórek i tkanek w
przemyśle farmaceutycznym i w rolnictwie:
" Zastosowanie kultur komórek i tkanek roślinnych do
produkcji substancji leczniczych (metabolitów)
" Zastosowanie kultur roślinnych do selekcjonowania
i tworzenia gatunków o pożądanych cechach
" Zastosowanie hodowli komórek rozrodczych ssaków
do pozaustrojowego pozyskiwania zarodków ssaków
Hodowle komórek wykorzystywane są do
produkcji szczepionek przeciwwirusowych
Szczepienia ochronne  najskuteczniejszy sposób
ochrony przed zachorowaniem wywołanym przez :
1. Wirus polio (Poliovirus)-choroba Heinego-Medina,
poliomyelitis
2. Wirus odry (Mumps virus), świnki (Measles virus),
różyczki (Rubivirus, Togavirus)
3. Wirus ospy wietrznej
4. Wirus zapalenia wÄ…troby typu A (WZW A)
5. Wirus wścieklizny (Rhabdovirus)
Szczepionki mogą zawierać wirusy:
1. Żywe osłabione (atenuowane) wirusy (selekcja klonów
niezjadliwych) np. szczepionka przeciw polio, wściekliz
nie,
różyczce
2. Zabite wirusy (niezdolne do namnażania ): polio, grypa,
wścieklizna, odra
3. Fragmenty wirionów (immunogenne białka kapsydu lub
osłonki wirusowej)- szczepionki podjednostkowe
" Wirus zapalenia wÄ…troby typu B (WZW B, ang. HBV,
hepatitis B virus) nie namnaża się w komórkach w hodowli.
Szczepionka uzyskiwana jest metodą inżynierii genetycznej
(szczepionka podjednostkowa-zsyntetyzowany antygen
HBs/antygen Australia).
Dawniej - plazma od zdrowych nosicieli antygenu HBS
poddana inaktywacji
" Brak szczepionki przeciwko WZW C (HCV, hepatitis C
virus), WZW D (HDV, hepatitis D virus, delta virus)
" WZW B (ale także C i D) mogą prowadzić do raka wątroby
" Wirusowe zapalenie wątroby może przebiegać w trojaki sposób:
1. Ostry stan zapalny, całkowite wyzdrowienie i uzyskanie
odporności (90% przypadków)
2. Bardzo gwałtowny przebieg prowadzący do śmierci (<1%)
3. Stan chroniczny, wirus jest stale obecny, osobnik jest
nosicielem wirusa; w surowicy chorych znajduje siÄ™ antygen
HbsAg, tzw antygen Australia, ok. 10% chorych.
Ten typ infekcji może prowadzić do raka !
" Wirusy brodawczaka- HPV (human papiloma virus)
namnażają się w komórkach warstwy rozrodczej skóry i błon
śluzowych j. ustnej, dróg oddechowych i układu moczowo-
płciowego
" Wykryto blisko 60 typów, niektóre mają związek z nowotworami:
- HPV 5 i 8 z rakiem skóry
- HPV 16, 18, 31, 33 z rakiem szyjki macicy (odbytu i pęcherza ?)
- HPV 6 i 11 z przekształceniem brodawczakowatości układu
oddechowego w nowotwory
Szczepionka przeciw HPV (16,18) zalecana u młodych dziewcząt
(przed rozpoczęciem życia płciowego) jako ochrona przed
zachorowaniem na raka szyjki macicy. Zalecane są też
szczepienia młodych mężczyzn.
Produkcja hormonów (growth hormone, GH, insulina)
Wykorzystuje się techniki inżynierii genetycznej. Zrekombinowane
DNA (wektory) niosące pożądane geny wprowadza się do komórek w
hodowli, bakteryjnych lub eukariotycznych (techniki transfekcji-
podręcznik S.Stokłosowej).
Ekspresja wprowadzonych genów w komórkach stransformowanych
(bakteryjnych) lub stransfekowanych (eukariotycznych) pozwala na
produkcję pożądanych zrekombinowanych białek w dowolnej ilości
(rekombinowane produkty bakteryjne nie sÄ… glikozylowane)
Dawniej ludzki hormon wzrostu pozyskiwano z przysadek
mózgowych pobieranych od zmarłych ludzi (groz
ba przeniesienia
prionów!)
Insulinę pozyskiwano z trzustek wieprzowych i wołowych
" Produkcja interferonów: IFNað, IFNbð, IFNgð (15-35 kDa)
" W organizmie interferony produkowane sÄ… w odpowiedzi na infekcje
wirusowe (cytokiny); IFNað, IFNbð głównie przez leukocyty, limfocyty T,
IFNgð przez wszystkie komórki, szczególnie fibroblasty i limfocyty T.
" Działanie:
1. Związanie z receptorami na powierzchni komórki
2. Aktywacja kinaz tyrozynowych, te fosforylują białka z rodziny STAT
będące czynnikami transkrypcji (przechodzą do jądra)
3. Czynniki te indukują transkrypcję wielu genów odpowiedzialnych za:
aktywność przeciwwirusową (kinaza PRK),
zatrzymanie cyklu komórkowego (p21),
indukcjÄ™ apoptozy (synteza prokaspaz),
syntezę białek biorących udział w prezentowaniu antygenów
wirusowych komórkom układu limfatycznego (LyT)
" Produkcja przeciwciał monoklonalnych
ważne m.in. we współczesnej diagnostyce chorób
onkologicznych (testy immunocytochemiczne)
i w leczeniu niektórych nowotworów (rak jelita grubego,
rak piersi, rak przełyku, niedrobnokomórkowy rak płuca),
np. przeciwciała przeciw receptorom EGF (HER2)
stosowane w kontrolowanych badaniach klinicznych:
bewacizumab, trastuzumab, cetuksimab
" Próby leczenia chorób alergicznych za pomocą
przeciwciał
W terapii genowej ( naprawianie komórek , np.
trzustkowych komórek ² wysepek Langerhansa)
Trzustka-dwa typy gruczołów
pęcherzyki trzustkowe (tkanka
gruczołowa o wydzielaniu
zewnętrznym), wytwarza tzw sok
trzustkowy (pankreatyna, lipaza,
amylaza)
wysepka trzustkowa
²/Langerhansa (tkanka
gruczołowa o wydzielaniu
dokrewnym- produkcja
insuliny)
" Hodowle komórek macierzystych dla pozyskania
mezenchymatycznych komórek zdolnych do
różnicowania się w określone tkanki
" Nadzieja na leczenie wielu chorób degeneracyjnych,
neurologicznych, urazów rdzenia kręgowego,
zawałów serca, cukrzycy, uszkodzenia siatkówki,
nowotworów układu chłonnego)
Kaskada różnicowania komórek mezenchymatycznych szpiku
kostnego (mesenchymatic stem cells, MSC ) wielopotencjalne
komórki macierzyste (pluripotent stem cells)
Komórki szpiku mają
zdolność samoodnawiania
i jednocześnie ulegają
różnicowaniu w
specyficzne linie:
hematopoetycznÄ… i mezen-
chymalną, która daje
początek takim komórkom
jak osteocyty, chondrocyty,
miocyty, komórki
endotelialne naczyń,
komórki nerwowe i
hepatocyty
Hematopoetyczna linia komórek macierzystych
" Hodowle komórek krwiotwórczych ukierunkowanych
(erytroblastów, megakarioblastów, prekursorów
granulocytów/monocytów) do celów transplantologii
(transplantologia w chorobach hematologicznych;
auto- i alloprzeszczepy).
" Niezbędne specyficzne czynniki wzrostowe stymulujące
nie tylko proliferację, ale różnicowanie
Granulocyty/
Erytrocyty/erytroblasty
mielocyty
Komórka
plazmatyczna
Monocyt/
makrofag
promielocyty
Limfocyty
Megakariocyt
Hemocytoblast (hematopoetyczna
/płytki krwi
komórka wielopotencjalna
Czynniki wzrostu  Growth factors
Jeden typ komórek może być stymulowany kilkoma czynnikami wzrostu,
niektóre działąją tylko w określonych stadiach różnicowania, inne
stymulują wiele typów komórek
In vitro vs in vivo - Zalety hodowli komórkowych
" Modele zastępujące niektóre badania na zwierzętach (brak
problemów natury etycznej, poza bezpośrednimi badaniami na
materiale ludzkim; niższe koszty ?)
" Linie komórkowe wyprowadzone z określonej tkanki imitują
częściowo daną tkankę (metabolizm, sekrecja)
" Względnie homogenny materiał
" Kontrolowane warunki środowiska (pH, temperatura, skład pożywki,
ciśnienie osmotyczne, ciśnienie tlenu i CO2
" Kontrolowane stężenia badanych substancji
" Powtarzalność wyników (z wyjątkiem przypadku kultur pierwotnych)
" Możliwość badania interakcji komórek pochodzących z tkanek
różnych typów histologicznych (ko-kultury)
Wady i ograniczenia hodowli komórkowych
W żywym organizmie komórki nie funkcjonują niezależnie, lecz
pozostają w bardziej lub mniej ścisłym kontakcie z innymi (organizm
jako biosystem: homeostaza, kontrola poprzez układ nerwowy,
krwionośny, wydzielniczy i immunologiczny)
" W hodowli komórki tracą pierwotne właściwości wydzielnicze
(dłużej utrzymują się one w ko-kulturach) i zdolność proliferacji
(krótki  life span jeżeli nie są unieśmiertelnione)
" Nie wszystkie komórki można hodować, uzyskanie hodowli
pierwotnych nie zawsze jest możliwe, materiał pierwotny jest
heterogenny
" Kontrolowane warunki środowiska (pH, temperatura, skład pożywki,
ciśnienie osmotyczne, ciśnienie tlenu i CO2 są wybitnie sztuczne
(w organizmie jest  rytm biologiczny związany z aktywnością
metabolicznÄ…)
" Niestabilne zachowanie linii komórkowych z upływem pasaży,
pojawianie siÄ™ aberracji chromosomowych (zaleca siÄ™ bankowanie
po 10 pasażach in vitro)
Rodzaje (typy) hodowli
" Jednowarstwowa / monolayer (2-D culture)
- najpowszechniej stosowana (namnożenie komórek,
płaska powierzchnia, ograniczona przestrzeń, wybitnie
sztuczne warunki)
- często utrata naturalnych funkcji komórki (produkcji
hormonów, ECM*, barwników)
- dedyferencjacja, zmiana fenotypu (np. chondrocyty w
fibroblasty)
*ECM- extracellular matrix; macierz pozakomórkowa,
ważna w migracji komórek
" Przestrzenna (3-D culture)
- wymaga substancji podporowych przypominajÄ…cych ECM
(kolagen, fibronektyna, agaroza  3 D porous scaffold)
- symuluje naturalne warunki
- interakcja pomiędzy komórkami
- produkcja ECM
- zachowane cechy fenotypowe
ale
- trudniejsze uzyskanie dużych ilości komórek
- ograniczenie migracji
- utrudniona dyfuzja składników pokarmowych i toksycznych
produktów metabolicznych
Schematy dwu- i trzywymiarowej hodowli (2D i 3D cultures)
" Hodowla 2D. Komórki na płaskiej " Hodowla 3D. Komórki w
powierzchni naczynia żelu (np. agarozowym)
hodowlanego
" Hodowla 2D. Komórki zadsorbowane
" Hodowla 3D. Komórki w
na porowatej 3-wymiarowej sztucznej
biosyntetycznej macierzy
powierzchni
pozakomórkowej
Cząsteczki powierzchniowe komórek
" Integryny; modulują procesy biologiczne: rozwój, gojenie ran,
migrację komórek, inwazyjność nowotworów, procesy zapalne
(białka wiążące wewnątrzkomórkowe włókna do białek ECM)
" RozpoznajÄ… specyficzne sekwencje aminokwasowe , tzw
motywy RGD, Arg-Gly-Asp lub (G)RGD(S), Gly-Arg-Gly-Asp-Ser
obecne w wielu białkach macierzy pozakomórkowej (np. w
fibronektynie, FN)
" Komórki w hodowli zaczynają produkować ECM, która w
konsekwencji ułatwia przywieranie
Cząsteczki powierzchniowe wiążą się z ligandami np. w
macierzy ECM lub w substancji stanowiÄ…cej powierzchniÄ™
hodowlanÄ… (sÄ… agonistami), co prowadzi do adhezji.
Wolne ligandy (nie zwiÄ…zane z macierzÄ… powodujÄ… efekt odwrotny,
działają jak antagoniści integryn, prowadząc do odklejania komórek
i apoptozy
" Aktywacja receptora zachodzi poprzez ligandy -
czÄ…steczki sygnalizacyjne Å‚Ä…czÄ…ce siÄ™ z receptorami.
" Po połączeniu się liganda z receptorem nie zawsze
dochodzi do jego aktywacji. PobudzajÄ…ce
właściwości ma tylko agonista (ligand, który wywoła
zmianÄ™ konformacji receptora, a w konsekwencji tego
uruchomienie kaskady zdarzeń we wnętrzu komórki -
aktywność wewnętrzna agonisty).
" Przeciwieństwem agonisty jest antagonista (ligand,
który ma zdolność do łączenia się z receptorem, ale
nie jest w stanie spowodować zmiany jego
konformacji, nie posiada więc aktywności
wewnętrznej).
Wzrost komórek nerwiaka złośliwego NG-108 na płytkach plastikowych
niepowlekanych i powlekanych lamininÄ… (BD BioCoat Laminin cellware)
Płytki niepowlekane: komórki Powlekane lamininą: komórki szybciej
luz
no przywierają, zaokrąglone przywierają, przybierają kształt
wrzecionowaty z dendrytycznymi
wypustkami
Wzrost fibroblastów BHK-21 na szkiełkach niepowlekanych
i powlekanych fibronektynÄ… (BD BioCoat Fibronectin cellware)
" Po 1 godz inkubacji pełna adhezja
na szkiełkach powlekanych
Hodowla hepatocytów na płytkach powlekanych sztuczną macierzą
pozakomórkową (skaningowy mikroskop elektronowy)