Kultury Tkankowe Zwierzęce
i Roślinne
Biotechnologia, Semestr 7
Wykład 2
Struktura i wyposażenie pracowni
hodowli komórek i tkanek
[e-mail]
Pracownia hodowli komórek
1. Głównym pomieszczeniem jest właściwa pracownia
hodowlana ( boks ), w której staramy się utrzymać w
miarę możliwości sterylne warunki.
Wyposażenie:
komory laminarne typu biohazard (pozwalają zachować
bezpieczeństwo osoby pracującej i chronić materiał
przed zakażeniem)
Inkubatory CO2
Lodówki, zamrażarki na -20 i -70oC
Szafki na sprzęt (plastikowe butelki, pipety, płytki itp.)
Mikroskop odwrócony
Woda bieżąca
Lampy bakteriologiczne (do sterylizacji pomieszczenia)
Komora laminarna typu biohazard z pionowym
przepływem powietrza
Wewnątrz
filtr węglowy
Brak wewnątrz
lampy UV
i palnika
Inkubator (cieplaarka) CO2
okulary
lampa
Soczewki
kondensora
aparat
fotograficzny
lub połączenie
obiektywy
z kamerą
Pomieszczenia, cd.
2. Śluza / przedboksie (lampa UV, umywalka, sterylne
fartuchy ochronne i obuwie)
3. Pracownia mikroskopowa (mikroskop z kontrastem
fazowym i fluorescencją, zestaw komputerowy do
rejestracji i analizy obrazu)
4. Pomieszczenie przeznaczone na bank komórek i tkanek:
zamrażarka na minus70-86oC, pojemniki z ciekłym
azotem, naczynia Dewara do przechowywania w ciekłym
azocie (-196oC) bankowanych komórek, skrzynia na
suchy lód)
5. Zmywalnia i pomieszczenie przygotowawcze sprzętu do
sterylizacji, suszarka do suchej sterylizacji szkła i
sprzętów metalowych, autoklaw, łaz
nia wodna, aparat do
podwójnej destylacji/dejonizacji wody, waga, pH-metr
Badawczy mikroskop
optyczny z
fluorescencją i
okulary
kontrastem fazowym
obiektywy
kondensor
Naczynia hodowlane i akcesoria jednorazowego
użytku (disposable equipment)
" Butelki hodowlane plastikowe (Tissue culture flasks), różnej
pojemności i powierzchni hodowlanej, zakrętki z filtrem i bez&
" Próbówki wirówkowe (10ml-50 ml okrągłodenne, stożkowe 
różne cele)
" Pipety miarowe (1-50 ml)
" Płytki hodowlane (f� 3-10 cm), Tissue culture dishes
" Płytki wielodołkowe (4-96), multiwell dishes
" Pipety automatyczne (jednokanałowe i wielokanałowe)
Materiały do produkcji naczyń hodowlanych:
" PP- polipropylen
" PE- polietylen
" PS - polistyren
" PC - poliwęglan
" CA- octan celulozy
" PTE - teflon
System sprawdzania jakości plastikowych
akcesoriów  quality assurance testing
Butelki hodowlane  Tissue culture flasks
Płytki do hodowli komórek  tissue culture dishes
Różne typy płytek wielodołkowych (multiwell dishes)
Płytki 96-dołkowe do hodowli i testów spektrofotometrycznych
Szkiełka nakrywkowe z tworzywa typu Termanox do
hodowli komórek i obserwacji mikroskopowej
Szkiełka z dzielonymi komorami (chamber slides)
 Trzy w jednym - Triple flasks - do namnażania
dużych ilości komórek
Całkowita powierzchnia
175 cm2, objętość płynu
500 ml
 Fabryki hodowlane
i drobne akcesoria
do napełniania
płytek i wyciągania
medium
Próbówki do mrożenia (bankowania) - kriopróbówki
Komory inkubacyjne na szkiełkach podstawowych
- Flasks on slides
Współczesne naczynia hodowlane i inne akcesoria
Butelka do hodowli  sferoidów Butelka do
(kolonii trójwymiarowych)  trypsynizacji
skrawków tkanki
Cell scraper (policeman) zamiast trypsyny
Płytki wielodołkowe z insertami do ko-kultywacji
Butelki do hodowli komórek
w zawiesinie; komórki są
delikatnie mieszane dzięki
obracaniu butelek na
specjalnych  rollerach
Zestaw do hodowli komórek w zawiesinie
Small Stirrer Flasks
Pojemność 250-ml z 50 100 ml
medium, na 4-miejscowym
mieszadle magnetycznym.
Butelki o większej objętości także
są w użyciu (nawet do 10 l).
Odciąganie pożywki (medium)
Sterylna pipeta pasterowska
(a) połączona wężykiem z
tworzywa z pompą
perystaltyczną (b) zasysającą
płyn do specjalnego zbiornika.
Do każdej butelki wkładamy
nową pipetę (żeby nie przenieść
komórek).
Innym sposobem jest użycie
zwykłych pipet plastikowych i
pipetora i wylewanie zużytego
medium do zlewki.
Pipetor połączony z jałową
pipetą służy do nabierania
płynów hodowlanych, trypsyny
i in.
W naszych warunkach
używamy takiego zestawu do
wyciągania zużytych podłóż z
butelek hodowlanych.
Dyspenser (Bottle-Top
Dispenser)
Nakładany na butelkę
z regulowanym
zakresem pojemności
służy do odmierzania
płynów
Automatyczne pipety jedno i wielo-kanałowe z jednorazowymi
końcówkami (tipsami)
Historyczne naczynia i sprzęt używany do hodowli
i pracy z komórkami
" Butelki szklane (korki z waty lub gumowe)
" Naczyńka Carella (korki z waty lub gumowe)
" Próbówki Lightona (ebonitowe zakrętki)
" Szklane płytki Petriego
" Szklane pipety
" Szkiełka mikroskopowe (bez matowych brzegów)
Archiwalne naczynia do hodowli komórek
Szklane naczynia
Szklana próbówka
Carrela (Carrel flasks),
Leightona ( lajtonka )
 karelki
" Obecnie także można stosować wyposażenie szklane:
pipety i naczynia hodowlane (wg znawców pierwotne
hodowle lepiej się udają na szkle niż na plastiku), są tańsze
w użyciu
" Często konieczne jest użycie szklanych butelek do
przygotowania roztworów i podłóż hodowlanych z suchych
składników
" Płytki szklane (np. w hodowlach limfocytów; słabiej
przywierają)
" Szkiełka mikroskopowe (najczęściej nakrywkowe) do
hodowli komórek
Szklane akcesoria wymagają odpowiedniego mycia i
sterylizacji !
Mycie szkła
" Szkło fabrycznie nowe (gotowanie w 1%HCl, płukanie
w wodzie, gotowanie w 1%NaOH, płukanie wodą bieżącą
i destylowaną)
" Szkło używane moczy się w detergentach, najlepiej w
obojętnych (7X-Flow), płucze w wodzie bieżącej
(wielokrotnie), w destylowanej 4-5 razy
" Wysuszone szkło sterylizuje się termicznie (160oC, 2 godz)
Procedury mycia dokładnie opisane w podręczniku
S.Stokłosowej (można stosować modyfikacje własne)
Sterylizacja - wyjaławianie
1. Antyseptyka (aseptyka)
2. Dezynfekcja
3. Sterylizacja:
- pomieszczeń, odzieży ochronnej,
- szkła,
- elementów z tworzyw sztucznych, gumowych
1. Antyseptyka (aseptyka)
" To takie zachowanie (działanie), które zapobiega
wprowadzeniu do danego materiału, z którym
pracujemy drobnoustrojów, lub działanie zmierzające do
przywrócenia jałowości zakażonym materiałom n.p.:
�� wyjaławianie powietrza, stołów laboratoryjnych, komór
laminarnych
�� dokładne mycie rąk i odkażanie rękawiczek
�� wyjaławianie co kilka miesięcy wnętrz inkubatora
" Antyseptyka to także praca w maskach w przypadku
infekcji dróg oddechowych; unikanie pracy w przypadku
infekcji grzybiczych
2. Dezynfekcja (odkażanie)
Niszczenie drobnoustrojów (szczególnie form wegetatywnych,
wirusów, grzybów z powierzchni zewnętrznych metodami
chemicznymi i/lub fizycznymi > zmniejszenie ilości
drobnoustrojów)
" Metody fizyczne dezynfekcji (często równoznaczne ze
sterylizacją):
- termiczne  gotowanie w wodzie lub dezynfekcja parą wodną
(100oC nie niszczy wirusów HBV, HCV , HDV, dawna
sterylizacja strzykawek szklanych)
- promieniowanie UVC (250nm), absorbowane przez DNA, RNA,
białka, zasady azotowe, działa bakteriobójczo i mutagennie
(sterylizacja pomieszczeń i komór laminarnych)
" Metody chemiczne dezynfekcji:
uszkadzają błony komórkowe, i DNA, denaturują białka; efekt
zależy m.in. od stężenia, temperatury, pH środowiska i
wilgotności
�� Aldehydy (formaldehyd, aldehyd glutarowy,
glioksal)  denaturują białka drobnoustrojów; niszczą
bakterie, łącznie z Mycobacterium tuberculosis i formy
przetrwalne, większość wirusów, grzyby. Detergenty wzmagają
działanie aldehydów
�� Alkohole (etylowy, izopropylowy, n-propanol) 
denaturują białka (w stęż. 70-80%); odkażanie skóry i
powierzchni roboczych
�� Fenole (głównie przeciwgrzybicze)
Metody chemiczne c.d.
�� Zasadowe barwniki (fiolet krystaliczny, zieleń
brylantowa, erytrozyna)-tworzą addukty z
kwasami nukleinowymi; do odkażania ran
�� Jod (w postaci alkoholowego roztworu 
jodyny)
�� Związki powierzchniowo-czynne
�� Środek do dezynfekcji podgrzany do 40-60oC
używany głównie do odkażania narzędzi (węże
gumowe, łączniki, z tworzyw)
3. Sterylizacja
zabiegi prowadzące do całkowitego usunięcia i zabicia
drobnoustrojów (wspomagana przez antyseptykę i dezynfekcję)
Sterylizacja pożywek: filtracja roztworów hodowlanych
doświadczalnych, zawierających aminokwasy, białka witaminy;
leków (filtry bakteriologiczne, średnica porów 0,22 �m (nie
zatrzymują mikoplazmy i wirusów)
Autoklawowanie (sterylizacja wilgotna); przegrzana para
wodna pod ciśn. 1,5-2,5 atm (1 atm =101,3 kPa), temp 121-134oC)
ciśnienie i czas w zależności od rodzaju materiału:
121oC, 1,5 atm, 15 min:
woda i roztwory (płyny fizjologiczne) nie zawierające białek,
aminokwasów i witamin objętości <100 ml
" Autoklawowanie
�� 121oC, 1,5 atm, 20 - 30 min:
rękawiczki gumowe, korki i dreny gumowe, łączniki i
rozdzielacze plastikowe lub silikonowe, końcówki do pipet
automatycznych, inne akcesoria plastikowe (szalki, próbówki
itp. PP, PE,PC), narzędzia metalowe opakowane w papier
�� 134oC, 2-2,5 atm, 30 min: bielizna w opakow. >5 kg, szkło
laboratoryjne (lekko zamknięte korkami z waty), woda i płyny
fizjol. w obj. >100 ml, gaziki, ligninę
" Sterylizacja radiacyjna- bardzo przenikliwe
promieniowanie gamma 60Co, 137Cs (butelki, płytki, próbówki,
kriopróbówki i inne elementy z tworzyw stosowane do hodowli
komórek); wysokie dawki promieniowania (bakterie są prawie
1000x mniej wrażliwe na promieniowanie niż komórki ssaków!)
" Sterylizacja promieniami UV (<300 nm, wywołuje
jonizację makrocząsteczek w komórce, podobnie jak prom.
gamma, X, naładowane cząstki), sterylizuje powierzchownie:
sterylizacja powietrza, pomieszczeń, stołów, komór
laminarnych, fartuchów
" Sterylizacja gazowa - tlenek etylenu z CO2 (60oC,
ciśnienie 4,5 atm, 3 godz); sterylizacja plastikowych
elementów do hodowli (pamiętać o odgazowaniu)
" Sterylizacja gazowa  formaldehyd z parą wodną
(w podciśnieniu, temp. 60-65oC), do sterylizacji
materiałów szczególnie zakażonych grzybami przed ich
usunięciem z hodowli
" Sterylizacja plazmowa (plazma gazowa uzyskiwana z
nadtlenku wodoru pod wpływem pola elektrycznego w
wysokiej próżni); alternatywna do sterylizacji chlorkiem
etylenu
" Wskaz
niki poprawnej sterylizacji
Utylizacja materiałów zakaz
nych
" Płyny zbierane z hodowli, resztki komórek zalewa się płynem
do dezynfekcji, po czym można wylewać do zlewu dokładnie
i obficie spłukując wodą bieżącą
" Zużyte butelki, pipety, próbówki zbiera się do specjalnych
pojemników z przeznaczeniem do spalenia (w spalarni)
" Szklane pipety używane w hodowli moczy się w detergentach
(Ludwik i inne, lub najlepiej płyn neutralny 7X:Flow) do czasu
mycia. Następnie sterylizuje się termicznie (160oC, 2 godz.)
Pasażowanie/przeszczepianie komórek adherentnych-
ćwiczenie laboratoryjne nr 1
" Pasażu dokonuje się przed uzyskaniem całkowitej
monowarstwy (80% konfluencji, wykładnicza faza wzrostu)
1. Usuwa się pożywkę z naczynia hodowlanego i przepłukuje
hodowlę małą ilością roztworu trypsyny (1-2 ml), usuwając
komórki nieprzywarte i resztki pożywki
2. Hodowlę zadaje się 1-2 ml r-ru trypsyny i inkubuje się w
cieplarce (~3 min) do odklejenia się komórek, lub w
temperaturze pokojowej
3. Przerywa się działanie trypsyny dodając 1-2 ml pożywki
4. Ewentualne agregaty komórek rozprasza się przez kilkakrotne
dość energiczne pipetowanie
5. Zawiesinę rozdziela się w zależności od potrzeb do nowych
butelek inokulując więcej lub mniej komórek (1:1, 1:2, 1:4 itp.)
6. Dodaje się odpowiednią ilość świeżego medium hodowlanego
" Ewentualne barwienie przyżyciowe i ocena żywotności
komórek (błękit trypanowy, erytrozyna B, mikroskop świetlny
" Kontrola w mikroskopie odwróconym
Obowiązkowe wyposażenie studenta do
uczestniczenia w laboratorium hodowli komórek:
1. Fartuchy ochronne  jednorazowego użytku (pozostają w
laboratorium i są kilkakrotnie sterylizowane UV)
2. Ochraniacze na obuwie (wyrzucane po każdych zajęciach)
3. Rękawiczki ochronne jednorazowego użytku
Pierwsze laboratorium 11 paz
dziernika, w Budynku Chemii
przy ul. Banacha (łącznik pomiędzy II i III skrzydłem
I piętro sala 1.07 lub 1.08)