Kultury Tkankowe Zwierzęce i
Roślinne
Wykład 5
Metody wspomaganego rozrodu
Zapłodnienie in vitro
[e-mail]
4 paz
dziernika 2010 r Komitet Noblowski Szwedzkiej
Akademii Nauk przyznał nagrodę Nobla w dziedzinie
Fizjologii i Medycyny brytyjskiemu badaczowi
Robertowi Edwardsowi
za opracowanie metody zapłodnienia in vitro
(In vitro Fertilization, IVF)
(10 milionów koron szwedzkich = 1 mln dolarów = 5 milionów zł)
" W Polsce co szósta para ma kłopoty z poczęciem dziecka
" Wina nie koniecznie leży po stronie kobiety (1:1)
" Zapłodnienie in vitro stosuje się jeżeli wyczerpane są
wszystkie możliwości leczenia niepłodności
" Zapłodnienie in vitro (in vitro ferilization, IVF)
 zapłodnienie komórki jajowej przez plemnik poza
organizmem kobiety
" Pierwsze  dziecko z próbówki urodziło się w 1978 r. w
Wielkiej Brytanii (Luisa Brown)
Spermatogeneza w krętych cewkach nasiennych jąder
1-spermatogonie (kom. macierzyste unipotencjalne)
2 -podział mitotyczny
3 -spermatocyty I rzędu
4 -podział mejotyczny I
5 -spermatocyty II rzędu przed
drugim podziałem mejotycznym
6 -spermatydy
7 -plemniki (spermie)
8 -jądro komórki podporowej
(Sertolego)
9 -cytoplazma komórki
podporowej (Sertolego)
10 - błona podstawna cewki
nasiennej krętej
(dojrzewanie męskiej komórki
płciowej trwa ~74 dni)
Nie uwidoczniono komórek śródmiąższowych (k.
Leydiga, produkujÄ… androgeny)
Budowa plemnika
zmodyfikowany aparat
Golgiego (hialuronidaza)
4,5 µm
zawiera jÄ…dro
(haploidalne)
szyjka (zawiera centrosomy)
wstawka zawiera
mitochondria
65
µm
Plemnik penetrujÄ…cy
komórkę jajową
koocowa częśd
200-300 mln/ w jednym ejakulacie
witki jest naga
" Testosteron odpowiedzialny za:
" Rozwój pierwotnych cech płciowych (w życiu płodowym
wytwarzany pod wpływem gonadotropiny kosmówkowej)
" W okresie dojrzewania (>12 l) za rozwój wtórnych cech
płciowych
" Wydzielanie testosteronu jest stymulowane przez przysadkowy
hormon gonadotropowy pobudzający komórki śródmiąższowe
(ICSH)  odpowiednik hormonu luteotropowego u kobiet (LH)
" Przysadkowy hormon folikulotropowy FSH stymuluje
dojrzewanie spermatocytów w cewkach nasiennych
" Spermatogeneza u większości mężczyzn obniża się w wieku 40-
50 lat (andropauza), aczkolwiek w postaci szczÄ…tkowej trwa do
kooca życia
Cykl jajnikowy (pęcherzyk Graafa) - początek cyklu w okresie dojrzewania
Komórki
Oocyt I rzędu
pęcherzykowe
II. Pęcherzyk jajnikowy
poczÄ…tek wzrastania
I. Pęcherzyk jajnikowy
pierwotny (~200tys)
jÄ…dro
Komora
wypełniona
płynem
Komórka
jajowa (0,2 mm)
III. Pęcherzyk
jajnikowy wzrastajÄ…cy
IV. Pęcherzyk jajnikowy dojrzewający
Podział redukcyjny i utworzenie komórki jajowej
haploidalnej (oocytu II rzędu)
Pod koniec dojrzewania pęcherzyka
oocyt I rzędu ulega podziałowi
asymetrycznemu, tworzÄ…c oocyt II
rzędu i ciałko kierunkowe I.
Natychmiast po powstaniu oocyt II
rzędu rozpoczyna następny podział
dojrzewania, który zatrzymuje się w
stadium metafazy. W tym stadium
oocyt II rzędu dostaje się do
jajowodu.
Dopiero po wniknięciu plemnika
dokonuje podziału na komórkę
jajową dojrzałą i na ciałko
kierunkowe II.
Wtedy następuje kariogamia
1.Przechodzenie komórki jajowej do jajowodu, 2.wniknięcie plemnika do jaja, 3.komórka
jajowa przed kariogamią, 4.pierwsza kariokineza, 5.dwa blastomery (1-doba po zapłodn.,
6.cztery blastomery, 7.sześd blastomerów, 8.osiem blastomerów i wejście zarodka do m.
(4-dzieo po zapłodnieniu), 9. blastula, 10.zanikanie osłonki przezroczystej jaja,
11.gastrulacja i zagnieżdżenie się zarodka w błonie śluzowej jamy macicy (6-dzieo rozwoju)
Zmiany hormonalne i fizjologiczne w czasie cyklu miesiÄ…czkowego
TEMPERATURA CIAA
A
LH=h.lutenizujÄ…cy
FSH=folikulostymulina
LH
FSH
Milijednostki/ml osocza
Etapy techniki zapłodnienia in vitro:
" Przygotowanie partnerów
" Stymulacja hormonalna kobiety
" Pobranie komórek jajowych
" Zapłodnienie komórki jajowej in vitro
" Implantacja zarodków
" Obserwacja przebiegu ciąży
" Poród
1. Przygotowanie partnerów
" Badanie stanu zdrowia (ogólne, laboratoryjne)
" Badanie nasienia (sperm penetration assay, SPA)
jakośd plemników zależy od trybu życia (palenie, alkohol 
niekorzystnie; dieta: witamina C i E, cynk - korzystnie
wpływają na żywotnośd plemników)
narażenia na czynniki toksyczne (chemiczne, węglowodory
aromatyczne, cytostatyki, promieniowanie jonizujÄ…ce,
wysoka temperatura) obniżają żywotnośd
" Kobiety palące mają większe zagrożenie niepłodnością
2.Stymulacja
" Kobieta musi przejśd kurację hormonalną  celem wytworzenie
kilkunastu komórek jajowych (niekiedy dochodzi do
 przestymulowania jajników > torbiele)
" Proces stymulacji jest monitorowany badniem USG i poziomem hormonów
" Ostatnio omija siÄ™ ten etap stymulacji hormonalnej - pobieranie
niedojrzałych komórek jajowych, które dojrzewają w hodowli
laboratoryjnej
3. Pobranie komórek jajowych:
" Zabieg wykonywany w znieczuleniu ogólnym:
nakłucie jajników pod kontrolą USG i pobranie
płynu z pęcherzyków Graafa
" W warunkach laboratoryjnych przeszukuje się płyn
pęcherzykowy w poszukiwaniu komórek jajowych
4.Połączenie gamet  in vitro
" Wybrane komórki jajowe umieszcza się w odpowiedniej
pożywce (na płytce hodowlanej) i łączy się z plemnikami
wcześniej pozyskanymi od mężczyzny (autoejakulacja, lub
niekiedy nakłucie jądra lub w ostateczności plemniki z banku)
" W hodowli dochodzi do połączenia plemników z komórkami
jajowymi
" Niekiedy wymagana jest mikromanipulacja (np. przy niskim
wskaz
niku sperm penetration assay, SPA)
" Po 16-24 godz. ocenia się ilośd zapłodnionych komórek (50-60%)
" Prowadzi się dalszą inkubację 24 godz. aby zygoty podzieliły się
2-3 razy (stadium 4-8 blastomerów)
5. Implantacja
" Zarodki przenosi się do jamy macicy (cewnikiem) w ilości 2-3
" Jeżeli w procesie stymulacji i łączenia gamet doszło do
powstania większej ilości zarodków, pozostałe zamraża się w
ciekłym azocie do ewentualnego wykorzystania w póz
niejszym
okresie
" O dalszym przebiegu decyduje natura (wymaga monitorowania
przebiegu i diagnostyki wad wrodzonych). Rozwój tak
zainicjowanej ciąży przebiega bez istotnych różnic w porównaniu
z ciążą poczętą naturalnie - w jajowodzie
" Narodziny tak poczętego dziecka nie różnią się też niczym od
narodzin każdego innego, z wyjątkiem zwiększonego odsetka
cięd cesarskich (z obawy o finał tej chronionej przez 9 mies.
ciąży)
Zapłodnienie in vitro - zagrożenia?
" Generalnie ilośd stymulacji hormonalnych możliwych do
zaakceptowania przez pacjentkÄ™ nie jest ostro limitowana
czynnikami biologicznymi. W skali jednego roku,
uwzględniając 2-3 miesięczne przerwy między cyklami,
można wykonad do trzech cykli in vitro.
" W krajach z pełną refundacją leczenia nierzadko spotyka
siÄ™ pacjentki majÄ…ce za sobÄ… ponad 20 cykli in vitro. Tam
zakooczenie leczenia następuje w chwili osiągnięcia
sukcesu, czyli ciąży zakooczonej porodem, lub wieku,
powyżej którego leczenie nie jest już refundowane, bądz

ze względów czysto medycznych, np. zbliżającej się
menopauzy.
" Wszystkie pacjentki będące w ciąży po IVF przyjmują
leki hormonalne podtrzymujące ciążę do około 10-12
tygodnia, co jest rzadziej wymagane w większości ciąż
poczętych naturalnie.
" W wyniku IVF powstaje więcej ciąż mnogich, pacjentki
przystępujące do zabiegów są zwykle starsze niż kobiety
zachodzące w ciążę w sposób naturalny, a częśd z nich
jest jeszcze dodatkowo obciążona wywiadem
położniczo-ginekologicznym.
" Większośd kobiet decyduje się na poród zabiegowy, ale
także w przypadku naturalnie poczętych ciąż mnogich
IVF - zagrożenia
1. Efekt nadmiernej stymulacji hormonalnej jajników oraz
ciąża mnoga
Przypadki. hyperstymulacji, takie, które wymagają
hospitalizacji występują w około 1-2% cykli in vitro.
Dokładna kontrola w trakcie stymulacji hormonalnej
zmniejsza obecnie to ryzyko w jeszcze większym stopniu.
2. Poród przedwczesny - jest podstawowym ryzykiem
wiążącym się z rozwojem ciąży mnogiej. Dlatego uznano, iż
liczba podawanych zarodków nie powinna przekraczad
dwóch, a podanie większej liczby zarodków może dotyczyd
jedynie sporadycznych przypadków.
2. Przyrost masy ciała, zauważany przez pacjentki, w
trakcie cyklu in vitro jest objawem przejściowym i wiąże
się z wysokim poziomem estrogenów, powodującym
zatrzymanie płynów wewnątrzustrojowych.
3. Przypadki depresji zdarzają się sporadycznie i skłaniają
pacjentkę do przerwania cyklu najczęściej na
poczÄ…tkowym etapie stymulacji.
4. Występowania nowotworów jajnika, piersi, szyjki
macicy i endometrium z leczeniem metodÄ… in vitro 
badania nie wykazały, by poddanie się tej terapii
zwiększało ryzyko onkologiczne.
Zapłodnienie in vitro  problem filozoficzno etyczny
Każda zapłodniona komórka jajowa jest potencjalnie zdolna do
zapoczątkowania istoty ludzkiej, jeżeli zagniez
dzi siÄ™ w macicy !
Każdy plemnik jest potencjalnie zdolny do zapoczątkowania życia, a
miliony są tracone podczas aktu seksualnego, którego celem nie
zawsze jest poczęcie !
Definicja początku życia istoty ludzkiej ?
Czy kilkukomórkowy zarodek poza ustrojem matki jest już
dzieckiem/człowiekiem (stanowisko Kościoła Katolickiego), czy
dopiero po wszczepieniu do jamy macicy ?
Problemy te powinny być rozstrzygane we własnym sumieniu ?
Metody alternatywne (mniej inwazyjne)
Inseminacja domaciczna (wewnÄ…trzmaciczna) - podawanie
odpowiednio przygotowanego nasienia mężczyzny do wnętrza
macicy leczonej kobiety
Technika ta pozwala na:
- istotne skrócenie drogi plemników do miejsca, w którym
winno dojśd do zapłodnienia, czyli jajowodu.
- oddzielenie plemników, które nie mogą uczestniczyd w
zapłodnieniu, bo są wadliwe, nieruchome czy wręcz nieżywe
(nie stanowią już prawidłowych komórek rozrodczych; stają
się balastem utrudniającym zapłodnienie przez zdrowy
plemnik
Mrożenie komórek jajowych metodą witryfikacji
Pierwszą w Europie ciążę z mrożonego oocytu, czyli
zamrożonej wcześniej, dojrzałej komórki jajowej, udało się
uzyskad w 1997 roku na Uniwersytecie w Bolonii.
Jedna z prywatnych klinik w Polsce wprowadziła i stosuje
rutynowo mrożenie komórek jajowych metodą witryfikacji
od września 2003 roku.
Komórki jajowe uzyskuje się po stymulacji hormonalnej
pacjentki poddanej zabiegowi zapłodnienia
pozaustrojowego. Zapłodnieniu podlega częśd komórek
jajowych, a pozostałe są zamrażane.
W tradycyjnej metodzie IVF, zapłodnieniu podlegały
wszystkie komórki jajowe. Można było uzyskad w ten
sposób nawet do kilkunastu zarodków, z których dwa lub
trzy podawano podczas transferu, a pozostałe podlegały
zamrożeniu.
W metodzie witryfikaji, po niepowodzeniu pierwszego
zabiegu, odpowiednia ilośd zamrożonych wcześniej
komórek jajowych jest poddana rozmrożeniu i zapłod-
nieniu, a rozwijajÄ…ce siÄ™ zarodki sÄ… podawane do jamy
macicy przyszłej matki
Dzięki metodzie witryfikacji można korzystad z całego
zapasu uzyskanych wcześniej komórek jajowych, ponieważ
przeżywalnośd komórek jajowych przy zastosowaniu tej
metody sięga 95%.
Odsetek ciąż uzyskiwanych przy użyciu komórek
rozmrożonych jest porównywalny z osiąganym przy użyciu
komórek świeżych.
W przypadku powodzenia zabiegu i decyzji o zakooczeniu
rozrodu zamrożone komórki jajowe mogą byd podane
innym pacjentkom lub zniszczone bez wątpliwości natury
etycznej.
Bank komórek jajowych
Mrożenie komórek jajowych metodą witryfikacji -
stworzenie w pełni anonimowego banku komórek jajowych,
analogicznego do powszechnie stosowanego banku nasienia
(wątpliwości natury etycznej; homorodzicielstwo i
heterorodzicielstwo).
Dzięki temu dawstwo komórki jajowej nie wymaga
jednoczesnego, synchronicznego leczenia dawczyni i
biorczymi, co dotychczas tworzyło dodatkowe trudności
i zniechęcało wiele kobiet, zarówno dawczyo jak i biorczyo.
Depozyt własnych komórek jajowych przed leczeniem
przeciwnowotworowym
Mrożenie komórek jajowych może okazad się bardzo ważne
w przypadku młodych kobiet z chorobą nowotworową.
Agresywne leczenie onkologiczne takie jak chemioterapia
lub radioterapia często prowadzi do trwałego uszkodzenia
jajników.
Młode kobiety, które nie rozpoczęły współżycia, lub nie są
w trwałych związkach partnerskich mogą uzyskad depozyt
swoich własnych komórek jajowych.
Tylko dzięki mrożeniu komórek jajowych mają szansę, w
przyszłości, po zakooczeniu leczenia onkologicznego na ciążę
i urodzenie dziecka.
Macierzyostwo przełożone na póz
niej
Nie tylko chemioterapia i radioterapia w istotny sposób
ogranicza płodnośd kobiet. Innym znacznie częściej
spotykanym szkodliwym czynnikiem jest upływający czas.
Wraz z wiekiem płodnośd kobiet systematycznie maleje.
Szczególnie po 35 roku życia, ze względu na słabnącą
czynnośd jajników, szanse na posiadanie dziecka
dramatycznie szybko zmniejszajÄ… siÄ™.
Dla kobiet, które z różnych przyczyn zmuszone są do
przełożenia macierzyostwa na póz
niejsze lata swojego
życia, depozyt własnych mrożonych komórek jajowych
przyszłości, gdy może okazad się pożyteczny
Wpływ wieku matki na występowanie zespołu Downa i
innych aberracji chromosomowych o znaczeniu klinicznym
Ze względu na rosnące z wiekiem ryzyko chorób powodowanych przez
aberracje chromosomowe zalecane jest badanie prenatalne czy płód nie
jest zagrożony chorobą genetyczną
BEZ KOLEJNEJ REPLIKACJI DNA I BEZ WYRAy
NEJ
Podział II mejozy
INTERFAZY NAST
PUJE DRUGI PODZIAA

MEJOTYCZNY.
W wyniku mejozy z jednej komórki diploidalnej
Metafaza II
(46 ch, 2N) powstajÄ… cztery gamety zawierajÄ…ce
pojedynczy zestaw chromosomów (haploidalne,
23 ch, 1N)
Najczęściej spotykana
nondysjunkcja chromosomu 21
Anafaza II
(zespół Downa), ch.13 (zespól
Pataua) i ch. 18 (Zespół Edwardsa)
mogÄ… zachodzid na tym etapie
mejozy