ZESZYTY PROBLEMOWE POST
PÓW NAUK ROLNICZYCH 2009 z. 534: 163-171
DYNAMIKA FORMOWANIA ZARODKÓW SOMATYCZNYCH
W KULTURACH in vitro TULIPANA
Małgorzata Maślanka, Anna Bach
Katedra Roślin Ozdobnych, Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołłątaja w Krakowie
Wstęp
Tulipan, ze względu na długotrwałą i mało wydajną drogę rozmna\
ania, jest
obiektem wielu badań, mających na celu zwiększenie plonu oraz przyspieszenie jego
uprawy. ObiecujÄ…cÄ… technologiÄ… produkcji tulipana jest somatyczna embriogeneza, ze
względu na bardzo szybki i wydajny sposób rozmna\
ania [DE VROOMEN 1997].
Somatyczne zarodki, powstające z komórek innych ni\
zygota, czyli na drodze
rozmna\
ania bezpłciowego, poprzez manipulowanie składem po\
ywki, mogą tworzyć
siÄ™ w du\
ej ilości, w stosunkowo krótkim czasie [K
PCZYC
SKA 2006]. Liczba uzyskanych
zarodków, obok ich jakości, decyduje o przydatności somatycznej embriogenezy do
masowej produkcji roślin. W przypadku tulipana nie opracowano, jak dotąd, metody
szybkiego i synchronicznego otrzymywania licznych somatycznych zarodków, pomimo
poznania ju\
mechanizmów kontrolujących te procesy.
Celem przeprowadzonych badań było określenie wpływu czasu trwania kultury
na efektywność formowania zarodków somatycznych (terminu pojawienia się
pierwszych zarodków globularnych i torpedo oraz ich liczby) u tulipana. Zbadano tak\
e
wpływ ró\
nych stÄ™\
eń auksyny na dynamikę formowania zarodków.
Materiał i metody
Badania przeprowadzono na tulipanach odmiany  Apeldoorn (nale\
Ä…cej do grupy
mieszańców Darwina) i  Rosy Wing (z grupy pojedynczych póz
nych). Jako
eksplantaty inicjalne zastosowano zalÄ…\
nie, wyizolowane z chłodzonych przez 12
tygodni, w 5°C, cebul o obwodzie 11-12 cm. Zdezynfekowane eksplantaty ciÄ™to na 1-2-
mm fragmenty (plastry) i wykładano do szalek Petriego na po\
ywki zawierajÄ…ce sole
mineralne wedÅ‚ug MURASHIGE i SKOOG [1962], 25 lub 50 µM Picloramu; 0,25-10 µM BA,
3% sacharozy, zestalone 0,7% agarem. Kultury prowadzono w ciemnoÅ›ci, w 20°C.
TworzÄ…cy siÄ™ \
ółty, embriogeniczny kalus odejmowano od tkanki matecznej,
namna\
ano na jednej z po\
ywek inicjalnych, a następnie poddano działaniu 10 lub 5
µM Picloramu oraz 1 µM BA, w celu formowania zarodków somatycznych, zgodnie
z procedurą według BACH i PTAK [2001].
W czasie 20 tygodni prowadzenia kultury określono procent eksplantatów
ró\
nicujących zarodki globularne oraz liczbę, powstałych z 1 g kalusa, zarodków w
 M. Maślanka, A. Bach
164
stadium torpedy (długości 5-10 mm), w zale\
ności od genotypu, stę\
enia auksyny i
czasu trwania kultury.
AnalizÄ™ histologicznÄ… formujÄ…cych siÄ™ struktur sporzÄ…dzono w oparciu
o preparaty mikroskopowe, wykonane metodą parafinową według FILUTOWICZA
i KUśDOWICZA [1951]. Doświadczenie wykonano w 5 powtórzeniach po 5 eksplantatów.
Wyniki opracowano statystycznie za pomocą metody analizy wariancji. Porównanie
średnich i określenie grup jednorodnych wykonano przy u\
yciu testu Duncana, z
uwzględnieniem poziomu istotności ą = 0,05.
Wyniki i dyskusja
Ró\
nicowanie zarodków w fazie rozwoju globularnego
Do rozwoju somatycznych zarodków u tulipana niezbędne jest obni\
enie stÄ™\
enia
auksyny w po\
ywce lub jej usunięcie [GUDE, DIJKEMA 1997]. Ró\
nicowanie zarodków
stymuluje równie\
obecność cytokinin, najsilniej podczas powstawania zarodków w
stadium globularnym, któremu towarzyszą intensywne podziały komórkowe
[SZWEYKOWSKA 1994]. Kultury zwykle prowadzi się w ciemności, stymulującej m.in.
rozwój zarodków globularnych [BACH, WARCHOA
2000] oraz obni\
ającej stopień
deformacji zarodków w stadium torpedy [MAŚLANKA, BACH 2007].
średnie oznaczone tymi samymi literami nie ró\
nią się istotnie na poziomie istotności ą=0,05; means marked
with the same letter du not differ significantly at the significance level Ä…=0.05
Rys. 1. Wpływ czasu trwania kultury i stę\
enia auksyny na ró\
nicowanie zarodków globularnych
u odmiany  Apeldoorn
Fig. 1. Effect of cultivation time and auxin concentration on the globular embryo diffe-
rentiation of cv.  Apeldoorn
W przeprowadzonym doświadczeniu, formowanie zarodków globularnych
zachodziło na drodze embriogenezy pośredniej, przez kalus. Ró\
nicowanie to miało
miejsce od pierwszych tygodni doświadczenia, ale nasiliło się po 2-3 miesiącach
prowadzenia kultury. W przypadku odmiany  Apeldoorn i po\
ywki z 5 µM auksyny,
najwy\
szy procent eksplantatów formujących zarodki globularne, wynoszący 76%,
odnotowano po 8 tygodniach trwania kultury. StosujÄ…c 10 µM Picloramu, wiÄ™ksze
ró\
nicowanie zarodków, równe 60%, otrzymano po 12 tygodniach od zało\
enia
 DYNAMIKA FORMOWANIA ZARODKÓW SOMATYCZNYCH ...
165
doświadczenia, w stosunku do pozostałego okresu kultury. Wraz z upływem czasu
trwania kultury obni\
ała się wydajność kalusa embriogenicznego w tworzeniu
zarodków, a po 20 tygodniach pod wpÅ‚ywem 5 µM Picloramu nie obserwowano
ró\
nicowania nowych zarodków (rys. 1).
U tulipana  Rosy Wing zaobserwowano intensywniejsze ró\
nicowanie zarodków
globularnych po 2-3 miesiącach, w stosunku do całego okresu kultywacji, niezale\
nie
od stÄ™\
enia auksyny (rys. 2).
objaśnienia jak w rys. 1; explanations see Fig. 1
Rys. 2. Wpływ czasu trwania kultury i stę\
enia auksyny na ró\
nicowanie zarodków globularnych
u odmiany  Rosy Wing
Fig. 2. Effect of cultivation time and auxin concentration on the globular embryo diffe-
rentiation of cv.  Rosy Wing
Tabela 1; Table 1
Procent eksplantatów ró\
nicujÄ…cych zarodki globularne, w zale\
ności od genotypu
i stÄ™\
enia auksyny, przez 20 tygodni prowadzenia kultury
Percentage of explants forming globular embryos, depending on genotype
and auxin concentration, for 20 weeks of cultivation
Po\
ywka; Medium Odmiana; Cultivar
Apeldoorn Rosy Wing
10 µM Picloram, 1 µM BA 39,2 b 20,8 a
5 µM Picloram, 1 µM BA 33,6 b 23,2 a
Åšrednia; Average 36,4 b 22,0 a
objaśnienia jak w rys. 1; explanations see Fig. 1
Oceniając wpływ stę\
enia auksyny na ró\
nicowanie zarodków, u obu odmian
tulipana stwierdzono, \
e badana cecha nie była zale\
na od ró\
nych stÄ™\
eń Picloramu
(tab. 1). Ró\
nicowanie zarodków globularnych uzale\
nione było natomiast od
genotypu. Odmiana  Apeldoorn efektywniej formowała początkowe stadia zarodków
(36,4% eksplantatów) ni\
 Rosy Wing (22% eksplantatów; tab. 1).
Kalus embriogeniczny obu badanych odmian tulipana, utrzymywany na po-
\
ywkach z 10 lub 5 µM Picloramu oraz 1 µM BA, stopniowo traciÅ‚ embriogeniczny
charakter i ró\
nicował coraz mniej zarodków. W kulturach kalusa przetrzymywanych
 M. Maślanka, A. Bach
166
przez dłu\
szy czas na po\
ywce z auksyną lub cytokininą następują zwykle zmiany
epigenetyczne, polegające na względnie trwałym uniezale\
nieniu siÄ™ od egzogennych
regulatorów. Procesowi temu sprzyja prowadzenie kultur w ciemności [ORLIKOWSKA
1997]. Być mo\
e kalus tulipana po kilku miesiÄ…cach kultury in vitro traci stopniowo
wra\
liwość na obecne w po\
ywce auksyny i cytokininy, albo te\
stosowane regulatory
w ni\
szych stÄ™\
eniach działają słabiej. O działaniu regulatorów roślinnych decyduje nie
tylko ich rodzaj i koncentracja, ale tak\
e wra\
liwość eksplantatu na te regulatory w
momencie aplikacji. Działanie substancji wzrostowych zale\
y tak\
e od wieku kultur
[ORLIKOWSKA 1997]. Niestety zdarza siÄ™, \
e kalus embriogeniczny ma powolny wzrost i
szybko traci kompetencję do embriogeniczności [RAGHAVAN 1997].
Ró\
nicowanie zarodków w stadium torpedy
Somatyczne zarodki tulipana w stadium torpedy, długości 5-10 mm, obser-
wowano w 8 i 12 tygodniu prowadzenia kultury, odpowiednio u odmiany  Apeldoorn i
 Rosy Wing . U obu badanych odmian więcej zarodków uformowało się po 12
tygodniach kultury, w porównaniu z pozostałym okresem trwania doświadczenia (rys.
3, 4). BOUMAN i in. [1999] otrzymywali w pełni wykształcone zarodki tulipana po 10
tygodniach na po\
ywkach niezawierajÄ…cych auksyn. BACH i PTAK [2001] natomiast
obserwowały formowanie się pierwszych zarodków w 12. tygodniu od chwili zało\
enia
kultur.
objaśnienia jak w rys. 1; explanations see Fig. 1
Rys. 3. Wpływ czasu trwania kultury i stę\
enia auksyny na liczbę zarodków w stadium torpedy
u odmiany  Apeldoorn
Fig. 3. Effect of cultivation time and auxin concentration on the number of torpedo-shaped
embryos of cv.  Apeldoorn
StÄ™\
enie auksyny nie miało wpływu na liczbę otrzymanych zarodków w stadium
torpedy. U obu badanych odmian, więcej (o ponad 30%) uformowanych zarodków na
po\
ywce z 5 µM Picloramu nie stanowiÅ‚o istotnej ró\
nicy w stosunku do po\
ywki ze
stÄ™\
eniem Picloramu równym 10 µM (tab. 2). PTAK i BACH [2007] najwiÄ™kszÄ… liczbÄ™
somatycznych zarodków tulipana uzyskały na po\
ywkach z przewa\
ającym udziałem
Picloramu nad BA.
 DYNAMIKA FORMOWANIA ZARODKÓW SOMATYCZNYCH ...
167
objaśnienia jak w rys. 1; explanations see Fig. 1
Rys. 4. Wpływ czasu trwania kultury i stę\
enia auksyny na liczbę zarodków w stadium torpedy
u odmiany  Rosy Wing
Fig. 4. Effect of cultivation time and auxin concentration on the number of torpedo-shaped
embryos of cv.  Rosy Wing
Tabela 2; Table 2
Liczba zarodków w stadium torpedy, z 1 g kalusa, w zale\
ności od genotypu i stę\
enia auksyny,
przez 20 tygodni prowadzenia kultury
Number of torpedo-shaped embryos, from 1 g of callus, depending on genotype and auxin
concentration, for 20 weeks of cultivation
Po\
ywka; Medium Odmiana; Cultivar
Apeldoorn Rosy Wing
10 µM Picloram, 1 µM BA 5,32 ab 1,6 a
5 µM Picloram, 1 µM BA 7,96 b 2,6 a
Åšrednia; Average 6,64 b 2,1 a
objaśnienia jak w rys. 1; explanations see Fig. 1
Podobnie jak w przypadku ró\
nicowania zarodków globularnych, liczba
uzyskanych zarodków w stadium torpedy tak\
e zale\
ała od genotypu rośliny. Średnio
6,64 zarodków otrzymano z 1 g kalusa tulipana  Apeldoorn w ciągu 20 tygodni,
niezale\
nie od po\
ywki. Odmiana  Rosy Wing uformowała w tych samych warunkach
trzykrotnie mniej zarodków (tab. 2). Porównana przez autorów [BACH, PTAK 2002]
odmiana  Apeldoorn równie\
charakteryzowała się większą efektywnością procesu
somatycznej embriogenezy w stosunku do odmiany  Red Matador (mieszaniec
Darwina). Z kolei w badaniach PODWYSZYC
SKIEJ i in. [1997] odmiana  Apeldoorn okazała
się mieć najsłabsze zdolności do ró\
nicowania, w porównaniu z innymi odmianami
tulipana.
Analiza histologicza
Analiza histologiczna otrzymanych regularnych, dwubiegunowych struktur,
z uformowanym liścieniem, pasmem wiązek przewodzących i merystemem pędowym
potwierdziła, \
e w przeprowadzonych badaniach istotnie formowały się zarodki
 M. Maślanka, A. Bach
168
somatyczne, które swoją budową odpowiadały zarodkom zygotycznym (fot. 1).
Niestety, zregenerowane zarodki tulipana nie posiadały korzenia. Wzdłu\
somatycznych
zarodków tulipana PODWYSZYC
SKA i MARASEK [2003] równie\
zaobserwowały podłu\
ne
pasma wiązek naczyniowych, nie odnotowały natomiast formowania się korzonka
zarodkowego. Brak korzeni u somatycznych zarodków tulipana mo\
na tłumaczyć
wysokÄ… temperaturÄ… (20-23°C) kultur in vitro i obecnoÅ›ciÄ… cytokinin, które opóz
niajÄ…
ich rozwój [PODWYSZYC
SKA, MARASEK 2003].
Fot. 1. Przekrój podłu\
ny przez somatyczny zarodek tulipana (pow. 30×, li - liÅ›cieÅ„, mp -
merystem pędowy)
Photo 1. Longitudinal section of the tulip somatic embryo (magnification 30×, li - cotyledon,
mp - shoot meristem)
Wnioski
1. Długość okresu prowadzenia kultury odgrywała istotną rolę w somatycznej
embriogenezie tulipanów. Wzrost ró\
nicowania zarodków globularnych ob-
serwowano do 8-12 tygodnia kultury in vitro, a formowanie zarodków w stadium
torpedy nasiliło się po 3 miesiącach kultury.
2. StÄ™\
enie auksyny w zakresie 5 i 10 µM nie miaÅ‚o istotnego wpÅ‚ywu na ró\
-
nicowanie zarodków globularnych i formowanie torped.
3. Wydajność somatycznej embriogenezy zale\
ała od genotypu. Zarodki globularne
ró\
nicowało średnio 36% eksplantatów  Apeldoorn i 22%  Rosy Wing . Tulipan
 Apeldoorn uformował większą liczbę zarodków somatycznych (średnio 6,6) ni\

 DYNAMIKA FORMOWANIA ZARODKÓW SOMATYCZNYCH ...
169
 Rosy Wing (średnio 2,1) z 1 g kalusa.
4. Analiza histologiczna potwierdziła formowanie zarodków somatycznych
w stadium torpedy.
Literatura
BACH A., PTAK A. 2001. Somatic embryogenesis and plant regeneration from ovaries of
Tulipa gesneriana L. in in vitro cultures. Acta Horticulturae 560: 391-394.
BACH A., PTAK A. 2002. Nowa metoda mikrorozmna\
ania tulipana (Tulipa gesneriana L.)
z tkanek zalÄ…\
ni. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 483: 13-19.
BACH A., WARCHOA
M. 2000. Effect of light quality on proliferation of embryogenic
callus of Hyacinthus orientalis cv. Delft s Blue. Acta Biologica Cracoviensia 42: 17.
BOUMAN H., LANGENS M., SCHOO W., DIJKEMA M. 1999. Somatic embryogenesis of tulip.
Acta Biologica Cracoviensa 41: 34.
DE VROOMEN C.O.N. 1997. Farm management aspects of somatic embryogenesis for tulip
bulb production. Acta Horticulturae 430: 383-388.
FILUTOWICZ A., KUśDOWICZ A. 1951. Mikrotechnika roślinna. PWRiL, Warszawa.
GUDE H., DIJKEMA M.H.G.E. 1997. Somatic embryogenesis in tulip. Acta Horticulturae
430: 275-280.
K
PCZYC
SKA E. 2006. Kiełkowanie i konwersja somatycznych zarodków in vitro. Bio-
technologia 4(75): 78-94.
MAŚLANKA M., BACH A. 2007. Wpływ kwasu abscysynowego oraz światła na wzrost
i rozwój zarodków somatycznych tulipana (Tulipa gesneriana L.). Zesz. Probl. Post.
Nauk Rol. 523: 155-161.
MURASHIGE T., SKOOG F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue culture. Plant Physiology 15: 473-497.
ORLIKOWSKA T. 1997. Regulatory roślinne w kulturach in vitro, w: Regulatory wzrostu i
rozwoju roślin. Zastosowanie w ogrodnictwie, rolnictwie, leśnictwie i w kulturach
tkanek. Jankiewicz S.L. Praca zbiorowa, PWN, Warszawa: 219-247.
PODWYSZYC
SKA M., MARASEK A. 2003. Effects of thidiazuron and paclobutrazol on
regeneration potential of tulip flower stalk explants in vitro and subsequent shoot
multiplication. Acta Societatis Botanicorum Poloniae 72(3): 181-190.
PODWYSZYC
SKA M., MARASEK A., GABRYSZEWSKA E. 1997. Indukcja tworzenia pędów
przybyszowych i zarodków somatycznych w kulturach in vitro tulipana. Zeszyty Nau-
kowe AR w Krakowie 318: 195-198.
PTAK A., BACH A. 2007. Somatic embryogenesis in tulip (Tulipa gesneriana L.) flower
stem cultures. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant 43: 35-39.
RAGHAVAN V. 1997. Molecular embryology of flowering plants. Somatic embryogenesis.
Cambridge University Press: 467-499.
SZWEYKOWSKA A. 1994. Procesy ró\
nicowania w kulturach tkanek i komórek roślinnych.
Prace Ogrodu Botanicznego Polskiej Akademii Nauk 5/6: 9-18.
 M. Maślanka, A. Bach
170
SÅ‚owa kluczowe: tulipan, somatyczna embriogeneza, zarodki globularne, torpedo
Streszczenie
Kalus embriogeniczny tulipanów odmian  Apeldoorn i  Rosy Wing , uzyskany
z eksplantatów zalą\
ni, wykładano na po\
ywki z obni\
oną zawartością substancji
wzrostowych, w stosunku do po\
ywki namna\
ającej, w celu formowania zarodków
somatycznych. W czasie 20 tygodni prowadzenia kultury tkanki embriogenicznej, na
po\
ywkach z 10 i 5 µM Picloramu, okreÅ›lano procent eksplantatów ró\
nicujÄ…cych
zarodki w fazie rozwoju globularnego w zale\
ności od genotypu, stę\
enia auksyny i
czasu trwania kultury. Określano równie\
liczbę, powstałych z 1 g kalusa, zarodków w
stadium torpedy.
Największy procent eksplantatów ró\
nicujÄ…cych zarodki globularne odnotowano
po 8 i 12 tygodniach prowadzenia kultury, wynoszÄ…cy odpowiednio 62% i 50% dla
odmiany  Apeldoorn oraz 32% i 30% dla odmiany  Rosy Wing . Równie\
po 3
miesiącach kultury uzyskano najwięcej zarodków w stadium rozwoju torpedo (blisko 14
szt. u  Apeldoorn i 4 szt. u  Rosy Wing ), po tym czasie obni\
ała się liczba
pozyskiwanych zarodków. Formowanie zarodków somatycznych uzale\
nione było od
genotypu badanej rośliny. Średnio 6,64 zarodków otrzymano z kalusa odmiany
 Apeldoorn w ciÄ…gu 20 tygodni, niezale\
nie od po\
ywki, co stanowiło trzykrotną,
istotnÄ… przewagÄ™ nad odmianÄ…  Rosy Wing .
DYNAMICS OF SOMATIC EMBRYO FORMATION IN TULIP
in vitro CULTURES
Małgorzata Maślanka, Anna Bach
Department of Ornamental Plants, Agricultural University, Kraków
Key words: tulip, somatic embryogenesis, globular and torpedo-shaped embryos
Summary
Embryogenic callus of tulips cv.  Apeldoorn and  Rosy Wing , obtained from
ovary explants, was put on medium with a lower level of growth regulators, as
compared to the proliferation medium, in order to produce somatic embryos. During 20
weeks of the embryogenic tissue cultivation, treated with 10 and 5 µM Picloram, the
effect of genotype, auxin concentration and cultivation time on the globular embryo
differentiation were investigated. The number of torpedo-shaped embryos obtained from
1g of callus were also examined.
The highest percentage of explants forming globular embryos were observed after
8 and 12 weeks of cultivation. For  Apeldoorn it was 62 and 50%, and for  Rosy Wing
32 and 30%, respectively. After three months of the embryogenic callus cultivation, the
highest number of torpedo-shaped embryos (about 14 for  Apeldoorn and 4 for  Rosy
Wing ) were obtained. However, during the prolongation of culture the embryo number
decreased.
Somatic embryo formation closely depended on the genotype. During 20 weeks
of cultivation,  Apeldoorn tulip produced, on the average, 6,64 embryos, independently
of medium composition. It trebled the results of  Rosy Wing .
 DYNAMIKA FORMOWANIA ZARODKÓW SOMATYCZNYCH ...
171
Dr in\
. Małgorzata Maślanka
Katedra Roślin Ozdobnych
Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołłątaja
al. 29 Listopada 54
31-425 KRAKÓW
e-mail: [e-mail]