Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej
Katedra Technologii Leków i Biochemii
Kultury tkankowe i komórkowe roślin i zwierząt
Mikrorozmna\
anie roślin prowadzonych w kulturach in vitro
Wstęp.
Mikrorozmna\
anie jest metodą rozmna\
ania wegetatywnego w kulturze
in vitro, u\
ywaną do masowego mno\
enia roślin na skalę produkcyjną. Dynamicznie
rosnące komercyjne znaczenie tej gałęzi produkcji roślinnej znajduje
odzwierciedlenie w jej współczesnej nazwie: przemysł in vitro (ang. in vitro industry,
the micropropagation industry).
Metoda kultury in vitro była doskonalona od początku XX wieku,
lecz rozmna\
anie roślin na skalę produkcyjną z jej zastosowaniem stało się mo\
liwe
dopiero od 1965 roku, kiedy to Murashige w USA opracował sposób klonalnego
rozmna\
ania storczyków. Metodę tę zaadoptowano do rozmna\
ania innych wa\
nych
gospodarczo roślin, głównie ozdobnych i sadowniczych. Obecnie jest ona najszerzej
wykorzystywaną techniką w biotechnologii. Znalazła zastosowanie przede wszystkim
w produkcji takich roślin, które trudno rozmna\
ają się wegetatywnie za pomocą
metod tradycyjnych (rośliny ozdobne, drzewa leśne, odmiany heterozygotyczne),
oraz roślin elitarnych, o du\
ej wartości jednostkowej. Tylko w niewielkim stopniu
słu\
y ona dotychczas w rozmna\
aniu roślin rolniczych (ziemniaków, zbó\
, roślin
tropikalnych. Mikrorozmna\
anie mo\
na te\
wykorzystać do rozmna\
ania form
poliploidalnych czy aneuploidalnych, których rozmna\
anie generatywne daje
niejednolite potomstwo).
Liczba gatunków rozmna\
anych za pomocą kultury in vitro wynosi obecnie
około 300, natomiast na świecie produkuje się za pomocą kultury in vitro około
800 mln sztuk roślin, z czego 90% stanowią rośliny ozdobne. Ocenia się,
\
e produkcja europejska wynosi około 200 mln sztuk rocznie, a najwa\
niejszym
producentem europejskim jest Holandia (62 mln sztuk rocznie), następnie Francja,
Polska, Włochy i Niemcy. Oprócz krajów europejskich, czołowymi producentami
roślin w laboratoriach in vitro są USA (110 mln szt.) i Indie (130 mln szt.). W krajach
tych głównym produktem mikrorozmna\
ania są ozdobne rośliny doniczkowe
o dekoracyjnym ulistnieniu, a tak\
e rośliny wa\
ne gospodarczo np. ziemniaki, byliny,
rośliny przyprawowe.
W Polsce działa obecnie około 20 laboratoriów zajmujących się
mikrorozmna\
aniem, głównie roślin ozdobnych (gerbera, ró\
anecznik, azalia,
storczyk, fikus, lilia, chryzantema, gloksynia, goz
dzik, paproć, primula), a tak\
e
borówki wysokiej, truskawki, \
urawiny i je\
yny.
Krajowa produkcja sadzonek in vitro jest jedną z największych w Europie i
szacunkowo wynosi około 70  100 mln sztuk na rok. Zaspokaja ona potrzeby
rynkowe naszego kraju, ale w większości jest eksportowana do Holandii, Anglii,
Izraela, Węgier, Czech, Białorusi, Bułgarii, Turcji, USA oraz na Ukrainę, Litwę i
A
otwę.
Laboratoria włoskie dostarczają na rynek około 20 mln sztuk roślin
sadowniczych, szczególnie winorośli i brzoskwiń. Laboratoria belgijskie specjalizują
się w produkcji ozdobnych roślin drzewiastych (Rhododendron).
Rozmna\
anie wegetatywne roślin w kulturach in vitro mo\
na prowadzić w
oparciu o:
a) pobudzanie rozwoju pąków bocznych (metoda najlepiej poznana)
b) formowanie pąków przybyszowych bezpośrednio lub pośrednio przez kalus
c) embriogenezę somatyczną
Embriogeneza somatyczna to proces biologiczny, podczas którego w
warunkach in vitro formują się zarodki z komórek wegetatywnych. Otrzymane w ten
sposób zarodki mogą posłu\
yć do produkcji sztucznych nasion.
Sztuczne nasiona to specjalnie spreparowane zarodki somatyczne (komórki
somatyczne, zaczątki rośliny) zdolne do regeneracji na skalę komercyjną,
umieszczone w osłonce ochronno  od\
ywczej.
Sposób prowadzenia kultury.
Bardzo istotne znaczenie w procesie mikrorozmna\
ania roślin ma skład
po\
ywki (głównie zawartość hormonów) oraz jej rodzaj (stała czy płynna). Najczęściej
stosuje się po\
ywkę według Murashige a i Skooga (1962) lub jej modyfikację,
rzadziej po\
ywkę B5 według Gamborga i in. (1968).
W procesie mikrorozmna\
ania mo\
na wyró\
nić następujące etapy:
1. zało\
enie kultury  obejmuje wyło\
enie sterylnych eksplantatów pierwotnych
na po\
ywkę stymulującą wytwarzanie pąków lub cebulek przybyszowych.
2. namna\
anie  najczęściej prowadzi się na po\
ywkach z wysoką zawartością
cytokinin indukujących tworzenie nowych pędów (mikrocebulek). Wytworzone
pędy mogą być ponownie wykładane na taką samą po\
ywkę, gdzie proces ten
się powtarza. Subkulturę najczęściej zakłada się co 4 tygodnie i przeprowadza
od 10 do 15 razy.
3. ukorzenianie pędów  przeprowadza się w zale\
ności od gatunku rośliny
zarówno in vitro, jak i in vivo. Stosuje się często po\
ywki z wysokim stę\
eniem
auksyn, obni\
oną zawartością soli mineralnych oraz dodatkiem węgla
aktywnego.
Celem mikrorozmna\
ania jest uzyskanie du\
ej liczby genetycznie
jednolitych roślin. W trakcie trwania kultury in vitro mo\
e być zachowana stabilność
genetyczna materiału roślinnego lub mo\
e wystąpić spontaniczna zmienność (tzw.
zmienność somaklonalna), w wyniku której regenerowane rośliny mogą wykazywać,
na pewien czas lub na trwałe, inne cechy ni\
wyjściowy materiał rodzicielski.
W mikrorozmna\
aniu zmienność jest wadą, ale stwierdzono, \
e mo\
e ona być
nowym z
ródłem zmienności genetycznej mo\
liwym do wykorzystania w hodowli
twórczej. Zmienność somaklonalna pozwala znacznie poszerzyć zakres zmienności
genetycznej roślin uprawnych, co jest szczególnie wa\
ne przy ograniczonej puli
genowej lub w przypadku gatunków u\
ytkowych, które utraciły zdolność do
rozmna\
ania generatywnego. Zmiany w kulturach in vitro mogą dotyczyć tak\
e
takich właściwości roślin, których nie mo\
na osiągnąć na drodze konwencjonalnej.
Zaletą zmienności somaklonalnej jest tak\
e mo\
liwość uzyskania roślin ró\
niących
się tylko jedną cechą przy zachowaniu innych cech odmianowych. Jej wykorzystanie
jest równie\
tańszą od innych metodą manipulacji genetycznej.
Zalety i wady mikrorozmna\
ania.
Podstawową zaletą stosowania tej techniki jest mo\
liwość uzyskania w krótkim
czasie bardzo du\
ej ilości roślinek z materiału wyjściowego. Liczba namno\
onych
roślinek zale\
y od odmiany, rodzaju eksplantatu, warunków fizycznych kultury,
składu po\
ywki oraz liczby przeprowadzonych subkultur. Np. teoretyczna wydajność
namna\
ania ze średniej wielkości cebuli w kulturze wytrząsanej wynosi 2000
mikrocebulek w ciągu 45 dni.
Stosowanie do mikrorozmna\
ania kultur merysystemów wierzchołkowych
stwarza mo\
liwość uwalniania materiału hodowlanego od wirusów i innych
patogenów. Im mniejszy jest izolowany merystem (0,5 do 1 mm), tym większa
skuteczność eliminacji wirusa. W celu zwiększenia prawdopodobieństwa otrzymania
zdrowych roślin stosuje się często kulturę merysytemów łącznie z termoterapią
lub chemoterapią.
Inną korzyścią stosowania tej techniki jest mo\
liwość przechowywania
zregenerowanych roślinek przez kilka miesięcy w obni\
onej temperaturze. Pozwala
to na spokojną, rozło\
oną w czasie produkcję in vitro i wysadzanie roślin
w optymalnym terminie. Stosuje się równie\
długoterminowe przechowywanie in vitro
merysystemów lub pędów przez okres 2-5 lat w banku genów.
Kolejną zaletą mikrorozmna\
ania jest łatwy transport rozmno\
onego
materiału. Szacunkowo około 40 000 roślinek mo\
na umieścić w paczce wa\
ącej
15 kg. Ułatwia to transport i międzynarodową wymianę materiału roślinnego.
Trudności, z jakimi spotyka się w trakcie mikrorozmna\
ania:
a) bakteryjne i grzybowe ska\
enie eksplantatów pierwotnych;
b) witryfikacja (zeszklenie) zregenerowanych roślin;
c) trudności ukorzeniania i adaptacji do warunków normalnej uprawy;
d) występowanie niekorzystnych fizjologicznych modyfikacji wśród namno\
onych
roślin (np. słaby wigor tych roślin, słaby rozwój systemu korzeniowego,
opóz
nienie kwitnienia).
Część praktyczna.
Celem ćwiczenia jest mikrorozmna\
anie roślin, pochodzących z hodowli
in vitro zało\
onych przez studentów na wcześniejszym laboratorium.
Do mikrorozmna\
ania wykorzystane zostaną merystemy wierzchołka pędu
i fragmenty łodygi.
Materiał roślinny:
3 mm eksplantaty wierzchołkowe dowolnej rośliny
1  3 mm fragmenty łodygi
Materiały sterylne:
Płytki Petriego
Penseta, skalpel
Po\
ywka MS bez hormonów
Po\
ywka MS zawierająca auksynę (NAA  kwas naftalenooctowy, 0.1 mg/l)
oraz cytokininę (BAP  6  benzyloaminopurynę, 0.5 mg/l), pH 5.8
Wykonanie ćwiczenia:
Ćwiczenie wykonuje się pod wyciągiem laminarnym z nawiewem sterylnego
powietrza.
1. Za pomocą sterylnej pensety, dobrze opalonej w płomieniu palnika, wyjąć
roślinę ze słoika i umieścić ją na płytce Petriego.
2. Odciąć przy pomocy skalpela około 3 mm merystem wierzchołkowy
oraz 1- 3 mm fragment łodygi, a resztę rośliny umieścić z powrotem w słoiku.
3. U\
ywając dobrze opalonej pensety wyło\
yć pobrane eksplantaty pierwotne
na po\
ywkę MS: merystem wierzchołkowy na po\
ywkę MS bez hormonów,
a fragment łodygi na po\
ywkę MS z hormonami.
4. Słoiki zabezpieczyć dodatkowo parafilmem, dobrze opisać i umieścić
w fitotronie na około 8 tygodni.
5. Obserwować wygląd roślin, liczbę roślin uzyskanych z eksplantatu, szybkość
powiększania się hodowli.
Przygotowanie sprawozdania.
1. Opisać sposób wykonania ćwiczenia.
2. Rola jednego dowolnie wybranego fitohormonu we wzroście i rozwoju roślin.
3. Wymienić znane (poza mikrorozmna\
aniem) rodzaje kultur in vitro. Opisać
którąś z nich.
4. Opisać sposoby uwalniania roślin od patogenów.
Literatura uzupełniająca:
1. Biotechnologia roślin. S. Malepszy, PWN 2004.
2. Wprowadzenie do biotechnologii w genetyce i hodowli roślin. Praca zbiorowa
pod kierownictwem S. Malepszego, Wydawnictwo SGGW-AR, Warszawa
1990.
3. www.horticentre.pl - Skierniewicki Portal Ogrodniczy