1.1 Podstawowe definicje; główne kierunki przemian
rozwojowych roślinnych tkanek in vitro
Określenie kultury in vitro, najdosłowniej rozumiane, oznacza hodowle prowadzone w szkle (w
zamkniętych naczyniach). W praktyce jednak przez roślinne kultury in vitro będziemy rozumieć
hodowle roślin (a częściej ich niewielkich fragmentów - organów, tkanek, komórek, lub
protoplastów) prowadzone na sztucznych podłożach (pożywkach) w warunkach jałowości. W
tym samym, bardzo ogólnym sensie bywa stosowany termin hodowle tkankowe. Wydaje się, że
istotę rzeczy jeszcze lepiej ujmowało określenie stosowane kiedyś: roślinne czyste kultury, niestety
termin ten praktycznie wyszedł już z użycia.
Techniki kultur in vitro, stanowią jeden z głównych działów nowoczesnej biotechnologii roślin
(obok inżynierii genetycznej i blisko z nią związanej diagnostyki molekularnej) i służą celom
praktycznym np. masowemu rozmnażaniu roślin, ich doskonaleniu (hodowli nowych odmian), albo
pozyskiwaniu z nich cennych metabolitów np. surowców do produkcji leków czy kosmetyków.
Metody te odgrywają również ważną rolę w badaniach podstawowych, głównie z dziedziny
fizjologii, biochemii oraz biologii molekularnej roślin.
Kultury in vitro przeciwstawia się hodowlom prowadzonym w warunkach naturalnych,
niesterylnych np. uprawie polowej czy szklarniowej, które bywają nazywane kulturami ex vitro lub
in vivo. Także w uprawach hydroponicznych mamy do czynienia z warunkami ex vitro. Korzenie
roślin są w tym przypadku częściowo zanurzone w wodnej pożywce, częściowo zaś "zakotwiczone"
w porowatym podłożu unieruchamiającym roślinę i umożliwiającym sprawną wymianę gazową.
Uprawy hydroponiczne przypominają kultury in vitro zastosowaniem sztucznych pożywek, ale
różnią się od nich brakiem izolacji hodowanego obiektu od zewnętrznego środowiska. Kultury
hydroponiczne są sposobem uprawy całych roślin, natomiast w kulturach in vitro, przynajmniej w
ich wstępnej fazie, hodujemy zwykle niewielkie fragmenty roślin (np. odcinek korzenia lub łodygi,
wycinek blaszki liściowej, pylnik lub zalążek), którym trzeba zapewnić nieco bardziej złożoną
pożywkę.
Każdą część rośliny wykorzystywaną jako materiał wyjściowy do założenia roślinnej kultury in
vitro nazywa się ogólnie eksplantatem. Dla uzyskania wzrostu kultury wystarczy dowolny
eksplantat, byle zawierał żywe komórki z nieuszkodzonym materiałem genetycznym (zdolne do
odróżnicowania i podziałów). Jednakże zarówno szybkość wzrostu, jak i procesy rozwojowe zależą
od zastosowanego rodzaju eksplantatu pierwotnego (a także od rodzaju pożywki i warunków
hodowli). Ze względu na konieczność zapobiegania zakażeniom, lepiej nadają się do hodowli
nadziemne części roślin, podobnie lepsze, bo zdrowsze są rośliny pochodzące z uprawy
szklarniowej niż polowej. Rośliny z których pobierane będą eksplantaty mogą być wcześniej
opryskane układowym fungicydem (środkiem grzybobójczym), jakkolwiek rzadko kiedy jest to
niezbędne.
Zwykle eksplantat pobierany jest z fizjologicznie młodych, w znacznym stopniu
niezróżnicowanych tkanek roślinnych, bo dużo łatwiej jest uzyskać w nich podziały komórkowe i
wzrost kultury. Dobrze jeśli wyjściowy materiał roślinny jest w fazie intensywnego wzrostu, a nie
fizjologicznego spoczynku (łatwiej więc zakładać hodowle wiosną niż jesienią czy zimą).
Jeśli eksplantat pobierany jest z roślin rosnących w warunkach niesterylnych, to nazywamy go
eksplantatem pierwotnym. Natomiast eksplantatem wtórnym nazywamy fragment rośliny (lub
tkanki) pochodzący z kultury in vitro i użyty do zapoczątkowania nowej hodowli in vitro
(przeszczepiony na nową pożywkę, na przykład dlatego, że w dotychczasowej zaczęły już
wyczerpywać się składniki odżywcze). Proces odświeżania kultury przez przeszczepianie jej
fragmentu na nową pożywkę nazywamy pasażowaniem. W przypadku hodowli komórek,
prowadzonych w płynnych pożywkach, zamiast terminu eksplantat wtórny stosuje się pojęcie
inoculum. Hodowle płynne (w płynnych pożywkach) również poddawane są pasażowaniu, a liczba
tych zabiegów (tj. pasaży) od chwili założenia danej hodowli jest jednym z podstawowych
parametrów charakteryzujących kulturę. Wydaje się, że komórki, tkanki i organy roślinne mogą być
utrzymywane w hodowlach in vitro przez dowolnie długi czas. Na przykład wzrost korzeni
pomidora podtrzymywano in vitro przez wiele lat, systematycznie pasażując (co kilka tygodni)
wierzchołkowy odcinek rosnących korzeni.
Wzrost jest typowym wynikiem hodowli eksplantatu, objawem wydłużania się komórek, a także
podziałów, zwłaszcza jeśli eksplantat zawiera tkankę merytematyczną. Nawet jednak jeśli
eksplantat początkowo zawiera wyłącznie tkanki stałe, wyspecjalizowane i nie dzielące się, to pod
wpływem warunków hodowli, a zwłaszcza występujących w pożywce regulatorów wzrostu,
niektóre komórki mogą ulec fizjologicznemu przeprogramowaniu i odzyskać zdolność podziałów.
Proces ten nazywamy odróżnicowaniem. Komórki roślinne, mają zdolność powrotu do stanu
merystematycznego, o ile jądro komórkowe i układ błon cytoplazmatycznych nie uległy zbyt
silnemu uszkodzeniu. Odróżnicowanie zaczyna się od odbudowy struktur komórkowych,
zniszczonych przez enzymy lizosomalne podczas fazy spoczynkowej komórek. Zdolności
odróżnicowania nie mają człony rurek sitowych i naczyń, w których jądra zaczęły degenerować, a
także włókna, o ścianach komórkowych grubości powyżej 2 źm. Większość jednak komórek
roślinnych ma taką zdolność. W wyniku odróżnicowania może dochodzić do powstania w
eksplantacie nowych skupisk komórek merystematycznych (centrów merystematycznych). Jeśli
podziały wielu komórek zachodzą w sposób nieskoordynowany, to prowadzą do powstania
guzowatej narośli, zawierającej głównie komórki miękiszowe i merystematyczne oraz bezładnie
rozrzucone pomiędzy nimi komórki innych typów. Taką narośl, nie mającą uporządkowanej
budowy wewnętrznej, nie osłoniętą tkanką okrywającą, nazywamy kalusem. W warunkach in vivo
narośl podobna do kalusa może tworzyć się spontanicznie w pobliżu miejsc skaleczenia rośliny,
stanowiąc tzw. tkankę przyranną, zabliz
niającą ubytek tkanki rośliny. Niektóre komórki
merystematyczne mogą wtórnie tracić zdolność podziałów i przyjmować postać typową dla tkanek
stałych. Zjawisko to nazywamy różnicowaniem. Różnicowanie komórek zapoczątkowuje proces
powstawania tkanek stałych, zwany histogenezą. Hodowle kalusa są dogodnym układem
doświadczalnym do badania regulacji powyższych przemian rozwojowych przez metabolity,
regulatory wzrostu, fizyczne warunki hodowli itp. Stosunkowo wyraz
nym przemianom
morfologicznym ulegają komórki przekształcające się w drewno. Ten proces, zwany ksylogenezą,
jest prawdopodobnie najczęściej badaną w kulturach in vitro formą histogenezy.
W kalusie, a czasami bezpośrednio w tkankach eksplantatu pierwotnego, mogą się też rozwijać
zawiązki całych organów. Takie tworzenie się organów od nowa (a nie poprzez pobudzenie wzrostu
drobnych zawiązków, istniejących już w eksplantacie pierwotnym) nazywamy organogenezą. Jeśli
więc na pożywce umieścimy pąk jakiejś rośliny i uda nam się pobudzić jego rozwój in vitro i
przekształcanie się w pęd, to będziemy mogli zaobserwować wzrost i histogenezę, ale nie
organogenezę (tkanki pędu wprawdzie rozrastają się tu, ale z uformowanego już w roślinie
macierzystej zawiązka, w tym przypadku pąka). Natomiast jeśli użyjemy jako eksplantatu
pierwotnego np. kawałka blaszki liściowej albo wycinka wyrośniętej części korzenia i w wyniku
hodowli otrzymamy pędy lub korzenie, to będziemy świadkami organogenezy, ponieważ eksplantat
pierwotny nie zawiera zawiązków tych organów i muszą one powstawać od nowa. Wyróżnia się
dwie główne formy organogenezy w zależności od ich wyniku - pędową (zwaną też kaulogenezą) i
korzeniową (czyli ryzogenezę). Jeśli organogeneza poprzedzona jest powstaniem kalusa, to nazywa
się ją pośrednią, natomiast o organogenezie bezpośredniej mówimy, gdy nowe organy powstają już
w tkankach eksplantatu pierwotnego, bez wyraz
nego namnożenia się kalusa. W niektórych
kulturach zawiązki pędu i korzenia powstają w sposób skoordynowany, tworząc dwubiegunowe,
drobne struktury przypominające roślinne zarodki, jakie normalnie rozwijają się w nasionach.
Proces ten może zachodzić zarówno w hodowlach tkanek rozrodczych (generatywnych) jak i
wegetatywnych (somatycznych) i nazywany jest embriogenezą. W naturalnych warunkach
embriogeneza i rozwój nasion poprzedzone są zwykle zapłodnieniem. W kulturach in vitro bardzo
często embriogenezę zapoczątkowuje nie proces zapłodnienia, ale odpowiednie warunki hodowli
(przede wszystkim skład pożywki). Wszelkie zarodki rozwijające się z pominięciem procesu
zapłodnienia nazywamy zarodkami apomiktycznymi. Zarodki takie, jeśli powstają z żeńskich
komórek generatywnych (nie zapłodnionych!), nazywane są zarodkami partenokarpicznymi. Z
męskich gamet (lub innych komórek męskiego gametofitu, którym u roślin kwiatowych są
kiełkujące ziarna pyłkowe) powstają zarodki zwane androgenicznymi. Natomiast z komórek
somatycznych tworzą się zarodki somatyczne, zwane też embrioidami. Z zarodków, w
sprzyjających okolicznościach, powstają młode rośliny, które czasem (całkiem fachowo!) nazywane
są roślinkami (ang. plantlets). To samo "czułe" określenie bywa stosowane w odniesieniu do
wszelkich innych drobnych roślin regenerujących w warunkach in vitro. Jeśli zarodki pozostają na
pożywce pobudzającej embriogenezę, to na ich powierzchni mogą się tworzyć potomne zarodki
somatyczne, które bywają wtedy nazywane zarodkami przybyszowymi.
1.2 Pożywki
Ostatnia aktualizacja: 11.01.2008