Kultury Tkankowe Zwierzęce
i Roślinne
Biotechnologia, Semestr 7
Wykład 1
Wprowadzenie do hodowli komórek i tkanek;
Historia, rodzaje hodowli, linie komórkowe,
podłoża hodowlane
[e-mail]
Materiały i literatura przedmiotu
"  Hodowla komórek i tkanek
pod redakcją Stanisławy Stokłosowej , Wyd. PWN,
Warszawa 2004
" Wykłady i laboratoria
" Podstawa zaliczenia:
- Zaliczenie ćwiczeń laboratoryjnych
- Kolokwia bieżące w czasie laboratoriów
- Kolokwium zaliczeniowe z całości materiałów
po zakończeniu wykładów
Tematy wykładów
" 1. Wprowadzenie do hodowli komórek i tkanek, organizacja
pracowni hodowli komórek i tkanek, sprzęt, aparatura,
drobne wyposażenie; definicje, pasażowanie komórek linii
ustalonych
" 2. Linie komórkowe, typy hodowli, zakładanie hodowli
pierwotnych, pasażowanie, bankowanie
" 3. Hodowle komórkowe w badaniach biologicznych: metody
analizy w toksykologii: testy klonogenne, barwienie
przyżyciowe, aktywność metaboliczna
" 4. Hodowle komórkowe w badaniach biologicznych: metody
analizy genotoksyczności (test mikrojądrowy, analiza
wymiany chromatyd siostrzanych, badanie pęknięć nici DNA)
Tematy wykładów c.d
" 5. Hodowle komórkowe w badaniach biologicznych:
metody analizy apoptozy i nekrozy
" 6. Hodowle narządowe (hodowle organotypowe)
" 7. Komórki macierzyste: hodowle, potencjalne
wykorzystanie w medycynie
Tematy wykładów c.d.
" 8. Hodowle komórkowe w immunologii: w produkcji
przeciwciał monoklonalnych
" 9. Hodowle komórkowe w immunologii: w procesie
produkcji szczepionek przeciwwirusowych
" 10. Hodowle komórkowe w terapii genowej; wytwarzanie
leków metodami inżynierii genetycznej
Tematy wykładów c.d
" 11. Pozaustrojowe uzyskiwanie zarodków ssaków;
hodowle komórek rozrodczych
" 12. Hodowle komórek roślinnych
Uwaga: tematy wykładów nie muszą pojawić się w podanej
kolejności
Kolkwium zaliczeniowe
Tematy ćwiczeń laboratoryjnych
" 1. Hodowle komórek utrwalonych linii; zapoznanie się ze
sprzętem i aparaturą, opanowanie zasad przygotowania podłóż i
prowadzenia hodowli, wykonanie pasażu komórek
" 2. Klonogenne systemy testowe (opis testu - teoretyczny;
posiewanie ilościowe komórek)
" 3. Ocena przeżywalności/proliferacji komórek klonogennych
rosnących w postaci przywartej do podłoża, liczenie kolonii 
praktyczne)- sprawozdanie na zaliczenie
" 4. Ocena pęknięć pojedynczej i podwójnej nici DNA oraz
uszkodzeń oksydacyjnych metodą elektroforezy pojedynczych
komórek w żelu agarozowym ( metoda kometowa ) wykonanie
elektroforezy. Kolokwium zaliczeniowe z dotychczasowego
materiału z ćwiczeń i wykładów
" 5. Mikroskopowa rejestracja i analiza komet lub analiza
zarejestrowanych wcześniej komet  sprawozdanie na zaliczenie
" 6. Test mikrojądrowy (opis testu - teoretyczny ; mikroskopowa
ocena preparatów uzyskanych z hodowli napromieniowanych
komórek  praktycznie). Kolokwium zaliczeniowe końcowe
Hodowla tkanek
Jest to metoda umożliwiająca utrzymanie in vitro w stanie żywym
i sprawnym metabolicznie komórek, fragmentów tkanek
(eksplantów), lub narządów co najmniej przez 24 godz.
Należy rozróżnić pojęcia  hodowla tkanek i  hodowla komórek:
Nazwa  hodowla tkanek powinna obejmować: hodowle
przestrzenne, narządowe, modele i konstrukty tkanek i narządów
(n.p. skóry).
Nazwa  hodowla komórek faktycznie powinna dotyczyć hodowli
komórek wyizolowanych z tkanek (dyspersyjnych), zarówno
hodowli pierwotnych jak i ustalonych i ciągłych linii
komórkowych.
Hodowla wycinka tkanki nerwowej w kropli wiszącej
(Ross Harrison)
Historia hodowli tkanek
" Faktyczne początki hodowli tkanek stworzył Ross.G.Harison w
1907 r. Hodował w kropli surowicy wycinki (eksplanty) tkanki
nerwowej żaby; obserwował wzrost aksonów.
Zakończenie aksonu
Zakończenie
aksonu
perykarion
Oligodendrocyt
Komórka Schwanna;
Lemocyt
(Neuryt)
(Neuryt)
Jądro komórki
Komórka nerwowa (neuron, neurocyt); Wielkość; kilka -120 m�m;
akson do 50 cm
Historia hodowli tkanek c.d.
" Kilka lat póz
niej (1910) chirurg francuski, Alexis Carrel
wprowadził zasady aseptyki (jałowego pobierania wycinków
tkanek, używanie sterylizowanego szkła i pożywek, pracę w
wysterylizowanych boksach).
" Tworzył on pierwsze podłoża do hodowli wycinków tkanek
przez mieszanie plazmy krwi kurzej z płynem zarodkowym
embrionów kurzych.
" Zaprojektował i wprowadził
do hodowli specjalne szklane
naczynia, tzw. naczyńka Carrela.
Współcześnie używana do hodowli komórek butelka
(cell culture flask)
Hodowla pierwotna: zapoczątkowana pobraniem komórek
lub tkanek bezpośrednio z organizmu (dyspersja tkanki;
niejednorodna populacja, np. komórki nowotworowe
zanieczyszczone głównie fibroblastami)
Linia komórkowa (ustalona): powstaje przez przeniesienie
części hodowli pierwotnej do odrębnej hodowli. Jeżeli materiał
daje się potem wielokrotnie przenosić ("pasażować") do
kolejnych hodowli, mówimy o tzw. ustalonej linii komórkowej.
Tożsamość komórek musi być potwierdzona testami
immunocytochemicznymi)
Klon komórkowy: jest to populacja komórek wywodząca się z
jednej komórki macierzystej i powstała na drodze jej
wielokrotnych podziałów.
" Linie ustalone (established cell lines):
- ciągłe (ang. permanent line, continuous cell lines): komórki
nowotworowe, unieśmiertelnione linie komórek normalnych
(przez spontaniczną transformację lub transfekcję, np. SV40)
- linie o ograniczonym czasie przeżycia (np. fibroblasty*,
keratynocyty*)
* Linie komórek wyprowadzone z płodu żyją znacznie dłużej niż
wyprowadzone z organizmu dorosłego
Klon komórek (kolonia) wywodzących się z jednej komórki
wyjściowej. Obraz z mikroskopu świetlnego odwróconego ,
oryginalne powiększenie 400x
Podłoża hodowlane
" Pożywki (media) podstawowe:
" BME, basal medium Eagle s,
" MEM, minimal Eagle s medium
" DMEM, Dulbecco modified Eagle s medium
" RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute)
" Pożywki wzbogacone (przystosowane do hodowli niektórych
linii komórkowych:
" DMEM / F12 HAM
" Mc Coy
" HAM F10
" TCM 199 (pożywka Parkera)
Skład pożywek hodowlanych
" Zbuforowane płyny fizjologiczne (sole mineralne utrzymujące
odpowiednie ciśnienie osmotyczne i pH); Earle s balance salt
solution, EBSS; bufor fosforanowy, PBS (DPBS); Hanks
balanced salt solution, HBSS); dodatkowo regulacja pH za
pomocą NaHCO3 i HEPES (<20mM)
" y
ródło energii: glukoza, niekiedy fruktoza, galaktoza i glutamina
(stymuluje produkcję ATP)
" Aminokwasy (także peptydy i białka: fibronektyna, transferyna,
albumina, alfa-, gamma globuliny)
" Witaminy (szczególnie z grupy B)
" mikroelementy (Zn, Cu, Se, Fe)
" Hormony i czynniki wzrostowe
" Kwasy tłuszczowe
Zbuforowane roztwory soli (roztwory fizjologiczne)
Sole wapnia i magnezu
Pierwsze płyny hodowlane (podtrzymujące)
Pierwsze płyny hodowlane (podtrzymujące)
c.d.
Liquid Powder
c.d.
DMEM cd
Suplementy - zalety i ograniczenia
" Surowica płodowa (fetal /foetal calf serum, FCS; fetal bovine
serum, FBS); surowice z dojrzałych zwierząt: końska, świńska,
kozia, królicza, jagnięca, ludzka
- mitogeny np. PDGF, EGF, IGF, VEGF (proliferacja komórek i/lub
różnicowanie)
- hormony: insulina, hydrokortyzon (może działać mitogennie i
cytostatycznie)
- albuminy (białka nośnikowe dla lipidów, witamin, wiąże jony
metali ciężkich, działa buforująco i ochronnie)
- kwasy tłuszczowe
- transferyna (przenosi żelazo)
- czynniki adhezyjne (fibronektyna, kollageny, laminina, fetuina)
- inhibitory proteaz (globuliny a�-antytrypsynowe, makroglobuliny a�)
- TGF-b�
Surowica - ograniczenia
- Różnice składu pomiędzy seriami (sprawdzanie każdej serii)
- Ryzyko zakażenia wirusami, mykoplazmą
- Ryzyko przeniesienia prionów gąbczastego zwyrodnienia mózgu
(bovine spongiform encephalopathy, BSE, choroba Creutzfeldta-
Jakoba) w przypadku prowadzenia hodowli na użytek kliniczny !
Na pewno wolna od BSE jest surowica nowozelandzka i
australijska, (tam nie wystąpiło BSE)
inne muszą być testowane!
- Najczęściej potrzebna jest inaktywacja termiczna (56oC, � godz),
(inaktywuje nadmiar immunoglobulin i czynniki dopełniacza, nie
niszczy czynników wzrostowych ?)
Choroby prionowe- zakaz
ne gąbczaste encefalopatie
(transmissible spongiform encephalopaties)
" U człowieka: CJD (Creutzfeldt-Jakob disease)
" U bydła: BSE (bovine spongiform encephalopaty)
" U owiec: scrapie (choroba kłusowa, trzęsawka)
" Czynnikiem zakaz
nym jest zmutowane białko PrPsc
(prawidłowe białko PrPc)
Zmutowane białko PrPsc jest oporne nawet na temp.
360oC, oporne na denaturację alkoholową aldehydową,
enzymy trwienne, proteazy.
Białko PrPsc pojawia się w różnych tkankach, ale
najwięcej w mózgowiu i w śledzionie, powodując
destrukcję komórek
Możliwe przeniesienie międzygatunkowe (?)
Metryczka dołączona do surowicy musi zawierać:
Numer katalogowy i nazwę firmy
Żródło pochodzenia (kraj, kontynent)
Datę produkcji
Datę ważności
Wykonane testy w kierunku BSE i infekcji
wirusowych!
(a) Skażenie bakteryjne, hodowli (b) Skażenie drożdżakami
Skażenie hodowli pleśniami (grzybami)
(d) Wzrost mikoplazmy na specjalnym agarze (makroskopowo);
(b) Kolonie mikoplazmy widziane w mikroskopie skaningowym
(g)
Mikoplazma rosnąca na powierzchni zainfekowanych komórek;
(f) elektronowy mikroskop skaningowy, (g) mikroskop świetlny
Zainfekowana wirusem komórka najczęściej
ginie z powodu:
1. Zahamowania ekspresji genów będącej wynikiem
integracji genomu wirusa z genomem komórki
2. Syntetyzowania kwasu nukleinowego wirusa i białek dla
kapsydu
3. Zmian metabolicznych wywołanych ekspresją
dodatkowej informacji genetycznej
4.  Wyczerpania komórki
W zainfekowanej wirusem komórce in vitro zachodzą
zmiany cytopatyczne (cytopatogenne):
1. Utrata kształtu wielokątnego i wypustek, zaokrąglenie
1. Utrata adhezji, oderwanie od podłoża
2. Pęknięcie błony i liza komórki, lub apoptoza
3. Fuzja komórek (błony zlewają się, powstaje wielojądrowe
syncytium)
4. Tworzą się tzw. ciałka inkluzyjne zawierające cząstki
wirusowe
Pożywki bez surowicy (serum free media, SFM)
" Podłoża o zmniejszonej zawartości surowicy stosuje się w
hodowlach pierwotnych (nie zawsze) lub ze względu na
wymagania eksperymentów
" substancje zastępcze: albuminy i alfa-globuliny (wyosobnione
frakcje najczęściej z surowicy cieląt)
" czynniki wzrostu, np. EGF, KGF (keratynocyty-fibroblasty,
wzajemna stymulacja), FGF (wiążą się z receptorami na
komórkach
" Hormony (insulina, estrogeny)
Podłoża selektywne np.
eliminujące fibroblasty,
pożywki pobudzające różnicowanie komórek
Wady:
Pożywki bez surowicy są droższe niż standardowe
Wzrost komórek jest wolniejszy
Inkubatory dla hodowli w pożywkach bez surowicy
powinny zawierać atmosferę z 10% CO2 ( z surowicą 5%)
" Niekiedy konieczne jest powlekanie powierzchni
sztuczną macierzą pozakomórkową ECM (kolagen,
fibronektyna, laminina, vitronektyna), np. hodowle
pierwotne;
" ECM nie tylko ułatwia przyleganie komórek;
czynniki te wiążą się z receptorami powierzchniowymi
komórek, co uruchamia sygnały pobudzające
proliferację komórek, ale także różnicowanie
Hodowla ustalonych linii komórek adherentnych
(wzrost typu monolayer) - protokół
" Odbankowanie (szybkie rozmrożenie w pojemniku z
wodą ~37oC, w cieplarce)
" Odwirowanie komórek dla usunięcia medium
konserwującego (czasem lepiej nie wirować!)
" Zawieszenie komórek w odpowiednim medium do
hodowli
" Ewentualne barwienie przyżyciowe i ocena żywotności
komórek w komorze do liczenia (r- r błękitu trypanowego,
erytrozyny B)
" Wysiewanie do naczynia hodowlanego (butelki, płytki)
" Kontrola w mikroskopie odwróconym
" Po kilku dniach dokonuje się przeszczepu (pasażu) na
nowe naczynia hodowlane
Adhezja komórek
" Wczesna adhezja, early adhesiveness (komórki przylegają
lecz nie rozprzestrzeniają się)
" Pośrednia adhezja, intermediate adhesiveness (komórki
rozprzestrzeniają się; brak wypustek i  kontaktu
ogniskowego - focal adhesion)
" Póz
na adhezja, late adhesiveness (rozprzestrzenianie,
widoczne wypustki włókienkowe i ogniskowy kontakt
adhezyjny)
Podobny mechanizm migracji działa w warunkach in vitro 
tworzy się ogniskowy (punktowy) kompleks adhezyjny przy
udziale białek: integryn, aktyny, vinkuliny, paxiliny i tensyny
Zależność adhezji od wielkości inoculum
" % I max jest miarą maksymalnej liczby komórek, które
przywierają do podłoża wyrażoną w procentach wielkości
inoculum (ilości komórek posiewanych). Nie wszystkie komórki
z danego inokulum zdolne są do adhezji !
k-szybkość proliferacji
td  czas podwojenia
komórek
t1/2  połowa czasu
niezbędnego do uzyskania
%I max
Kinetyka wzrostu komórek w hodowli
Faza lag = faza
opóz
nienia
(czas adhezji)
Pasażowanie/przeszczepianie komórek adherentnych-
ćwiczenie laboratoryjne nr 1
" Pasażu dokonuje się przed uzyskaniem całkowitej
monowarstwy (80% konfluencji, wykładnicza faza wzrostu)
1. Usuwa się pożywkę z naczynia hodowlanego i przepłukuje
hodowlę małą ilością roztworu trypsyny (1-2 ml), usuwając
komórki nieprzywarte i resztki pożywki
2. Hodowlę zadaje się 1-2 ml r-ru trypsyny i inkubuje się w
cieplarce (~3 min) do odklejenia się komórek, lub w
temperaturze pokojowej
3. Przerywa się działanie trypsyny dodając 1-2 ml pożywki
4. Ewentualne agregaty komórek rozprasza się przez kilkakrotne
dość energiczne pipetowanie
5. Zawiesinę rozdziela się w zależności od potrzeb do nowych
butelek inokulując więcej lub mniej komórek (1:1, 1:2, 1:4 itp.)
6. Dodaje się odpowiednią ilość świeżego medium hodowlanego
" Ewentualne barwienie przyżyciowe i ocena żywotności
komórek (błękit trypanowy, erytrozyna B, mikroskop świetlny
" Kontrola w mikroskopie odwróconym
Nieliczne komórki przywarte do dna butelki w kilka
godzin po posianiu widziane w mikroskopie z
kontrastem fazowym (nie barwione);
Nieliczne komórki przywarte do dna butelki w kilka
godzin po posianiu widziane w mikroskopie z
kontrastem fazowym (nie barwione);
Komórki nowotworowe 24 godz. po przeszczepie
Kilkudniowa hodowla komórek nowotworowych (prawie
100% zagęszczenie/konfluencja) widziane w mikroskopie
z kontrastem fazowym (nie barwione);
Komórki fibroblastów ludzkich w hodowli widziane w
mikroskopie z kontrastem fazowym (nie barwione);
hodowla co najmniej tydzień po przeszczepie,
stłoczona (wejście w fazę stacjonarną)
Fibroblasty  komórki występujące w różnego typu
tkance łącznej
Przykład tkanki łącznej
Fibroblasty ludzkie linii NHDF w hodowli. Kontrast-fazowy,
oryginalne powiększenie 600x
Komórki raka jelita grubego linii HCT116 . Mikroskop
odwrócony, oryginalne powiększenie 200x
Fibroblasty ludzkie linii NHDF w hodowli. Utrwalone na płytce,
wybarwione barwnikiem fluorescencyjnym (DAPI), mikroskop
fluorescencyjny Axiophot, powiększenie 400x
Komórki białaczki szpikowej linii K562 rosnące w zawiesinie
(mikroskop odwrócony)
Bankowanie komórek
" Komórki zabankowane w odpowiednim podłożu mogą być
przechowywane przez wiele lat (w parze ciekłego azotu, -196oC)
" Medium krioprotekcyjne (n.p. 70% surowicy, 15%DMSO, 15%
odpowiedniego dla danej linii); zamiast DMSO glicerol
" Temperatura schładzania ~1oC/min
(<2 h w temp -20oC, 24 h w - 70oC, w -196oC wiele miesięcy i lat)
" Gęstość komórek do mrożenia 106-107/ml
" Transport komórek zabankowanych  suchy lód (zamrożony
CO2, temp. -78oC)
Kwarantanna
Każda nowa linia jaką wprowadzamy do pracowni
hodowlanej powinna być poddana kwarantannie, tzn.
hodowana oddzielnie, a następnie poddana testom na
obecność mykoplazmy.
Podobnie ostrożnie należy postępować z materiałem
ludzkich tkanek (wycinków, biopsji).
Technika zliczania komórek w komorze B�rkera
(hemocytometrze)
Wygląd zewnętrzny
hemocytometru
(komory B�rkera,
komory Neubauera)
siatka
Zautomatyzowane liczenie  liczniki komórek (cell counter)
Wygląd siatki w komorze B�rkera
Siatka komory B�rkera  liczenie komórek
Czerwonych nie liczymy!
Liczymy komórki w 5 kwadratach ograniczonych potrójnymi liniami w
obu siatkach komory (czyli w 10 kwadratach, których objętość w sumie
wynosi 1�l), a zatem:
Suma komórek z 10 kwadratów x 1000 = liczba komórek w 1 ml