Katedra Biochemii Farmakologii i
Toksykologii Wydział Medycyny
Weterynaryjnej Uniwersytetu
Przyrodniczego we Wrocławiu
Toksykokinetyka -
biotransformacja trucizn
opracował prof. dr Marcin Świtała
Materiały wykładowe z przedmiotu
Toksykologia weterynaryjna (tydzieo 2 w3. /2011)
Trucizna po dostaniu siÄ™ do ustroju przechodzi w procesach
metabolicznych zmiany jakościowe
Przekształcanie się cząsteczki ksenobiotyku w tych procesach
nazywamy jej biotransformacjÄ…
Przemiany metaboliczne którym podlegają ksenobiotyki dzieli się na :
1. reakcje pierwszej fazy: utlenianie, redukcja, hydroliza
(modyfikacje czÄ…steczki ksenobiotyku w tych reakcjach sprzyjajÄ…
powstaniu grup funkcyjnych , które mogą wchodzid w procesy
sprzęgania)
2. reakcje drugiej fazy - sprzęganie
(w reakcjach tych powstają metabolity wykazujące dużą
polarnośd cząsteczek, co pozwala na ich łatwiejsze wydalenie
z organizmu)
W organizmie przemianom metabolicznym nie ulegajÄ… :
-zwiÄ…zki bardzo silnie polarne ( np. kwas szczawiowy, kwasy sulfonowe,
kwas ftalowy, aminy czwartorzędowe), które nie mogą wejśd do
wnętrza komórek gdzie zachodzi większośd przemian metabolicznych .
Zwiazki te Å‚atwo wydalajÄ… siÄ™ przez nerki
- większośd bardzo lotnych związków (cyklopropan, eter etylowy) -
szybko wydalajÄ… siÄ™ z organizmu
- związki silnie lipofilne - kumulujące się w tkance tłuszczowej
Mechanizmy biotransformacji trucizn -
Miejscem większości reakcji biotransformacji są mikrosomy.
Są to elementy gładkiej siateczki endoplazmatycznej zawierające białka
enzymatyczne. Najbogatsze w mikrosomy jest retikulum plazmatyczne
wÄ…troby.
Biotransformacja przybiegad może również w nerkach , płucach, jelicie
cienkim, łożysku, skórze, osoczu, gonadach, siatkówce oka.
Enzymy mikrosomalne biorą udział w reakcjach utleniania, redukcji
oraz reakcjach sprzęgania.
Najczęściej ksenobiotyki ulegają reakcji utlenienia. Enzymami,
przeprowadzajÄ…cymi tÄ… reakcjÄ™ sÄ… monooksygenazy.
We frakcji mikrosomalnej występuje łaocuch transportu elektronów
składający się z
A - cytochromu P-450 (hemoproteina złożona z białka apoproteiny i
żelazoprotoporfiryny IX. Cytochrom łączy substrat i przeprowadza
reakcję utleniania dzięki przejściu Fe+3 w Fe+2,
B - reduktazy NADPH-cytochrom P-450 (flawoproteina przenoszÄ…ca
elektrony NADPH na cytochrom) i
C - czynnika lipidowego ( łączącego układ)
ksenobiotyk
Częśd gładka siateczki endoplazmatycznej hepatocytu zawierające mikrosomalne białka
enzymatyczne (Niesink i wsp. 1996)
Reakcja utleniania przebiega w myśl równania
SH +NADPH +H+ +O2 SOH + NADP+ + H2O
gdzie
SH jest substratem
SOH produktem hydroksylacji
(jeden z atomów cząsteczki tlenu łączy się z substratem -drugi
redukuje siÄ™ tworzÄ…c wodÄ™)
Reakcje utleniania - największa grupa reakcji metabolicznych I fazy
- przebiegad mogÄ… w mikrosomach przy udziale monooksygenaz lub poza
mikrosomami
Reakcje mikrosomalne to:
Øð - reakcje hydroksylacji - zwiÄ…zków
Øð - reakcje dealkilacje (N-dealkilacja,
Øð - reakcje deaminacji
Øð - reakcje utlenienia amin z wytworzeniem amoniaku
Øð - reakcje epoksydacji (ze zwiÄ…zkami zawierajÄ…cymi podwójne wiÄ…zania)
Øð - reakcje S-oksydacji
Øð - reakcje desulfiracji oksydatywnej
reakcje jednoelekronowe z wytworzeniem wolnych rodników
Reakcje pozamikrosomalne to
reakcja utlenienia alkoholi do aldehydów i kwasów np. w mitochondriach
Reakcje redukcji
Zachodzą pod wpływem reduktaz mikrosomalnych , a warunkach
beztlenowych mogą byd przeprowadzone przez cały łaocuch transportu
elektronów z cytochromem C-450 (w formie zredukowanej Fe +2)
Reakcjom redukcji ulegajÄ… zwiÄ…zki nitrowe i azowe
Reakcje hydrolizy
Enzymy przeprowadzajÄ…ce te reakcje to : esterazy, amidazy
Enzymy te wykazują małą specyficznośd i występują w osoczu, wątrobie,
nerkach, śledzionie, sercu, mięśniach
Reakcjom hydrolizy ulegajÄ…:
estry, amidy, hydrazyny, karbaminiany, cyjanki
Czynniki wpływające na procesy metaboliczne I fazy :
1. genetyczne (różnice międzygatunkowe)
2. fizjologiczne (płed, ciąża, stan odżywienia)
3. środowiskowe (zimno, hałas )
Reakcje II fazy - reakcje sprzęgania
Reakcji sprzęgania ulegają:
1. metabolity utworzone w procesach I fazy lub
2. bezpośrednio ksenobiotyki o dużej hydrofilności
Produkty reakcji II fazy to zazwyczaj kwasy organiczne o pKa 3 - 4,
które w warunkach fizjologicznych występują w formie zjonizowanej i
łatwo ulegają wydaleniu z moczem lub żółcią.
Ksenobiotyki lub ich metabolity (z I fazy) ulegają następującym
reakcjom w procesach II fazy.
Øð reakcji sprzÄ™gania z kwasem glukuronowym
Øð reakcji sprzÄ™gania z kwasem siarkowym
Øð metylacji
Øð acetylacji
Øð sprzÄ™ganiu z aminokwasami najczęściej z glicynÄ…
Øð reakcji z glutationem do wytworzenia kwasów
merkapturowych
Øð reakcji tworzenia tiocyjanianów
Reakcje sprzęgania zachodzi dwuetapowo
I etap to aktywacji układu, w którym substancja endogenna wchodząca w
reakcję jest aktywowana pod wpływem związków wysokoenergetycznych
np. UTP, ATP
II etap Å‚Ä…czenia (sprzegania) z metabolitem I fazy
Procesy te zachodzą głównie w mikrosomach i biorą w nich udział
odpowiednie transferazy
Typy reakcji sprzęgania a rodzaje podstawników lub grup związków alifatycznych
lub aromatycznych, które biorą w nich udział
Sprzęganie z kwasem glukuronowym
Etap I.
synteza UDPGA (kwasu alfa-urydynodifosforoglukuronowego)
zachodzi dwuetapowo we frakcji cytoplazmatycznej,
substraty to : glukozo-1-fosforan, UTP, 2 czÄ…steczki NAD
COOH
OR
o
Etap II
OH
przemieszczenie grupy glukuronylowej z UDPGA
O-glukuronidy
OH
na ksenoniotyk (UDP-glukuronotransferaza)
OH
zachodzi we frakcji mikrosomalnej wÄ…troby, nerek, jelita cienkiego,
COOH
śledziony, skóry, mózgu
SR
o
OH
Produktami tej reakcji mogÄ… byd:
S-glukuronidy
OH
O-glukuronidy typu eterowego (z alkoholami, fenolami)
OH
O-glukuronidy typu estrowego (z kwasami karboksylowymi)
COOH
S-glukuronidy (zwiÄ…zki z grupÄ… sulfhydrylowÄ… np. tiofenoli)
NR
o
N-glukuronidy (zwiÄ…zki z aminami, sulfonamidami, karbaminianami)
OH
N-glukuronidy
OH
OH
W organizmie występuje także beta-glukuronidaza, która hydrolizuje
niektóre połączenia kw. glukuronowy-ksenobiotyk
Wydalane z żółcią glukuronidy często hydrolizują do macierzystych
związków i są zwrotnie wchłaniane.
W połączeniu z kwasem glukuronowym wydalają się endogenne związki
sterydowe i bilirubina
Reakcje sprzęgania z kwasem glukuronowym nie zachodzą u ryb, mają
drugorzędne znaczenie u kota. Są słabo wydolne u noworodków i
podczas chorób wątroby.
Połączenia z kwasem glukuronowym są lepiej rozpuszczalne w wodzie od
substancji macierzystych i szybciej wydalają się z moczem i żółcią
O
O
Sprzęganie z kwasem siarkowym
R O S O
R NH S O
O
O
Etap I
synteza PAPS (5'-fosfosiarczanu 3'-fosfoadenozyny) siarczany ksenobiotyków
zachodzi dwuetapowo we frakcji cytoplazmatycznej,
substraty to: siarczan pochodzący z przemian aminokwasów siarkowych i ATP.
Etap II
przemieszczenie grupy siarczanowej z PAPS na ksenobiotyk (sulfotransferaza)
zachodzi w mikrosomach wątroby, nerek, jelita cienkiego, mózgu, nadnerczy i gonad
Produktami tej reakcji mogÄ… byd: siarczany eterowe (estry z alkoholami lub fenolami)
lub sulfaminiany (z aminami aromatycznymi)
W tej formie wydalajÄ… siÄ™ z organizmu: heparyna i aminy biogenne, cholina,.
Liczba reakcji sprzęgania z kwasem siarkowym jest ograniczona pulą siarczanów
występujących w organizmie. Reakcje te zachodzą u wszystkich gatunków zwierząt,
a u świni proces ten wykazuje najmniejszą intensywnośd.
Połączenia z kwasem siarkowym są lepiej rozpuszczalne w wodzie od substancji
macierzystych i szybciej wydalają się z moczem i żółcią
Sprzęganie z kwasem octowym (acetylacja)
Jest najczęstszą reakcją sprzęgania amin aromatycznych, hydrazydów, sulfonamidów i
części amin alifatycznych
R-NH . COCH3
octan ksenobiotyku
Etap I - synteza acetylokoenzymuA (CH3CO.S.CoA)
zachodzi we frakcji cytoplazmatycznej, substraty to: octan, ATP i CoA
Etap II
przemieszczenie grupy octanowej z acetyloCoA na ksenobiotyk (N-acetylotransfe-
raza) zachodzi w mikrosomach wątroby, nerek, jelit, płuc, śledziony
Produktami tej reakcji sÄ… octany (acetylometabolity)
Istnieje kilka typów N acetylotransferaz. U ludzi wyróżnia się grupy osób
wolnoacetylujących i szybkoacetylujących. Ma to znaczenie dla efektów leczenia lekami
podlegającymi acetylacji (sulfonamidy, izoniazyd). Istnieją różnice międzygatunkowe w
sposobie i intensywności acetylacji. np. człowiek tworzy N4 pochodne sulfonamidów,
pies natomiast N1-pochodne
Częśd zacetylowanych amin ulega w organizmie deacetylacji. Szczególnie aktywnie
proces ten przebiega u psa.
Acetylacja może lecz nie musi prowadzid do powstania metabolitów lepiej
rozpuszczalnych w wodzie.
Sprzęganie z glutationem
CONH CH2 COOH
SH CH2 CH
glutation jest trójpeptydem zbudowanym
NHCO CH2 CH2 CHNH2 COOH
z cysteiny, kwasy glutaminowego i glicyny
glutation
Reakcja z glutationem może mied charakter
- prostego sprzężenia (S-arylotransferaza)
- lub przebiegad wieloetapowo do powstania kwasów merkapturowych
Najczęściej połączenia z glutationem tworzą wodory aromatyczne i ich
chlorowcopochodne oraz halogenowe nitroalkany
Glutation chroni przed toksycznym działaniem wolnych rodników gdyż ma
zdolnośd wiązania elektrofilnych połączeo ksenobiotyków powstających w
mikrosomach w wyniku procesów jednoelektronowych
Sprzęganie z aminokwasami
Sprzeżeniu z aminokwasami ulegają aromatyczne lub heterocykliczne
kwasy karboksylowe oraz kwasy arylooctowe.
I etap to aktywacja ksenobiotyku (kwasu) przez połączenie z
koenzymem A zachodzi w mitochondriach wÄ…troby i nerkach, przy
udziale ATP (mało swoistośd)
II etap to połączenie aktywowanego ksenobiotyku z aminokwasem
wiÄ…zaniem peptydowym
U ssaków, gadów i płazów obok glicyny sprzęganie może zachodzid z
glutaminą, ornityną, seryną, argininą, tauryną i lizyną - u ptaków głównie
z ornitynÄ…
Sprzęganie z grupą metylową (metylacja)
ma mniejsze znaczenie w inaktywacji ksenobiotyków.
Donorem grupy metylowej jest SAM - S adenozynometionina.
Grupa ta przenoszona jest na zwiÄ…zki przez metylotransferazy
Metylacji ulegajÄ… aminy, alkohole, fenole, merkaptany a nawet
zwiÄ…zki arsenu
Metylacja nie zwiększa przepuszczalności ksenobiotyków ani ich
wydalania z organizmu.
Tworzenie tiocyjanianów
Cyjanki nieorganiczne są sprzęgane z siarką i tworzą tiocyjaniany
(rodanki), które są 200 razy mniej toksyczne niż cyjanki.
Reakcję tę, przebiegającą głównie w wątrobie, katalizuje głównie
siarkotransferaza tiosiarczanowa (rodanaza)
y
ródłem siarki są tiosiarczany, tiosulfoniany lub nadsiarczki rzadziej
cysteina.
CN + S2O3 SCN + SO2
Indukcja i inhibicja enzymów mikrosomalnych
Indukcja enzymatyczna to zwiększenie aktywności enzymów prowadzących
przemiany metaboliczne ksenobiotyków, głównie mikrosomalnych, pod
wpływem substancji obcych tzw. induktorów biorących równocześnie
udział w procesach biotransformacyjnych.
Cechy typowe induktora to duża lipofilnośd oraz długi okres biologicznego
półtrwania.
Zdolnośd indukcji enzymatycznej monooksygenaz mikrosomalnych wykazuje
ok. 300 substancji o zróżnicowanej budowie.
Wyróżnia się dwie grupy induktorów:
1. o stosunkowo dużej swoistości substratowej, których działaniu towarzyszy:
- zwiększenie aktywności enzymów mikrosomalnych wątroby w tym
cytochromu P-450, reduktazy NADPH-cytochrom P-450, transferazy
glukuronylowej
- proliferacja gładkiej siateczki śródplazmatycznej
- zwiększenie zawartości fosfolipidów i białka mikrosomalnego
- zwiększenie masy wątroby
Zalicza siÄ™ do nich fenobarbital oraz aminofenazon, fenylobutazon, meprobamat,
imipraminÄ™, glutetimid, insektycydy polichlorowe (DDT), heksachlorobenzen,
polichlorowane bifenyle, etanol.
Fenobarbital pobudza np. biotransformacjÄ™ digitoksyny, pochodnych kumaryny,
kortyzolu, przy dłuższym stosowaniu również własny metabolizm (autoindukcja)
2. o małej swoistości substratowej
- pobudzajÄ…ce procesy hydroksylacji aromatycznej
- pobudzajÄ…cych syntezÄ™ cytochyromu P-448
- nie wywołujących proliferacji siateczki ani aktywacji reduktazy NADPH
Należy do nich np. benzopiren
Inhibicja enzymów mikrosomalnych
prowadzi do zahamowania przemian ksenobiotyków.
Może byd ona wynikiem:
1. procesów niszczenia siateczki środplazmatycznej i obniżenia poziomu
cytochromu P-450 przez działanie tzw. wolnych rodników (np. CCl4)
2. tworzenia kompleksów z cytochromem P-450 (CO, zw. fosforooganiczne
Skutki biotransformacji ksenobiotyków
1. Detoksykacja
2. Aktywacja metaboliczna
1. Detoksykacja
Detoksykacją nazywamy te procesy metaboliczne, które prowadzą do
powstania produktu o słabszym działaniu toksycznym w porównaniu z
substancją macierzystą lub pozbawionego aktywności biologicznej
Taki charakter majÄ… zazwyczaj produkty powstajÄ…ce w procesach
sprzęgania z kwasem glukuronowym, siarkowym, glicyną, glutationem
oraz reakcje hydrolizy.
Większośd produktów reakcji utleniania i redukcji również ma mniejsze
właściwości toksyczne niż substraty.
2. Aktywacja metaboliczna
Aktywacją metaboliczną nazywamy takie procesy metaboliczne, które
prowadzą do powstania produktu o silniejszym działaniu toksycznym w
porównaniu z substancją macierzystą .
Przykłady takich reakcji:
- utlenienie insektycydów fosforoorganicznych
-utlenienie metanolu do formaldehydu
Szczególnie niebezpieczne są silnie reaktywne metabolity takie jak
chinony, związki epoksydowe, wolne rodniki, które tworzą toksyczne
metabolity tlenu. W wyniku peroksydacji lipidów niszczą błony
biologiczne komórek oraz łączą się trwale z kwasami nukleinowymi i
białkami wywołując skutki cytotoksyczne, mutagenne rakotwórcze.