ELEKTYW: Witaminy i przeciwutleniacze w żywności i napojach
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
ĆWICZENIE 3: CHROMATOGRAFIA PLANARNA
Chromatografia jest to metoda chemicznej analizy instrumentalnej, w której
dokonuje się podziału substancji (w przeciwprądzie) między fazę nieruchomą i fazę
ruchomą. Fazę nieruchomą może stanowić bibuła filtracyjna, cienka warstwa
adsorbentu naniesiona na płytkę lub wypełnienie kolumny. Fazę ruchomą stanowi
natomiast roztwór ciekły. W metodzie tej wykorzystywana jest:
1) różnica w zdolności adsorpcyjnej fazy stacjonarnej względem różnych
składników znajdujących się w fazie ruchomej;
2) różnica wielkości współczynnika podziału składników rozdzielanych;
3) różnica wielkości cząsteczek separowanych składników;
4) zatrzymywanie jonów na podłożu jonitowym.
Stopień rozdziału można zwiększyć dobierając zarówno odpowiedni
rozpuszczalnik (eluent), jak i substancjÄ™ tworzÄ…cÄ… fazÄ™ stacjonarnÄ…. Obraz analizy
chromatograficznej otrzymany bezpośrednio w fazie stacjonarnej (np. barwne plamy
w chromatografii planarnej pochodzące od poszczególnych składników) lub wykres
przedstawiający wyniki analizy w postaci pików odpowiadających rozdzielanym
składnikom (uzyskany dzięki zastosowaniu odpowiedniego detektora) nosi nazwę
chromatogramu. Chromatografia może być stosowana do badań jakościowych,
ilościowych i dla celów preparatywnych.
Zalety chromatografii cienkowarstwowej
" próbki przygotowywane tą techniką nie muszą być bardzo staranne, a
niewielkie zanieczyszczenia nie stanowiÄ… istotnej przeszkody
" próbkę można nanosić na płytkę w dużej objętości, dlatego nie ma potrzeby
zagęszczania roztworów
" na jednej płytce można analizować dużą liczbę próbek jednocześnie 
znacznie szybciej niż HPLC
" nie potrzeba dobierać rozpuszczalnika do detektora
" możliwe jest porównanie składników próbek ze wzorcami
" w wielu przypadkach można obserwować przebieg rozdziału i po osiągnięciu
zadowalającego poziomu przerwać proces
" cena jednej analizy jest o około 80% niższa niż HPLC
ELEKTYW: Witaminy i przeciwutleniacze w żywności i napojach
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
Nanoszenie próbek
Próbki nanosi się w postaci plamek (rozdział analityczny) lub pasm (rozdział
preparatywny).
1  płytka chromatograficzna,
2  linia startu,
3  czoło fazy ruchomej,
4  eluent,
tka
5  komora chromatograficzna,
A  odległość od linii startu do
środka plamki,
B  odległość od linii startu do czoła
fazy ruchomej
Linia startu (10-20 mm od brzegu płytki) nie może być zanurzona w eluencie. Próbę
można nanosić ręcznie (za pomocą mikrostrzykawki lub mikropipety) lub stosując
automatyczne aplikatory (100nl - 100ml).
Komory do chromatografii cienkowarstwowej
Wykorzystuje się zwykle prostopadłościenne lub
cylindryczne, szczelnie zamykane komory szklane.
Wewnątrz umieszcza się kilka lub kilkanaście płytek, z
zastrzeżeniem, ze nie mogą się stykać ze sobą.
Na dno komory wlewa się rozpuszczalnik, aby płytki
były zanurzone 5-10 mm. (nie może być zanurzona linia
startu próbek). W dużych komorach ściany wykłada się
bibułą  wysycenie atmosfery parami rozpuszczalnika
zapewnia krótszy czas chromatografowania i lepszy rozdział.
ELEKTYW: Witaminy i przeciwutleniacze w żywności i napojach
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
Wizualizacja chromatogramów
Po rozwinięciu chromatogram suszy się. W
przypadku, gdy składniki analizowanej
mieszaniny sÄ… barwne otrzymuje siÄ™
chromatogram w postaci barwnych plamek.
Powinny być okrągłe, nierozmyte, rozłożone
równomiernie między linią startu, a czołem
fazy ruchomej, bez  ogonów .
Jeśli składniki analizowanej substancji są bezbarwne wówczas należy
wywołać chromatogram. Do wywoływania używa się odczynników chemicznych
reagujących z plamkami rozdzielonych związków bezpośrednio po zadziałaniu lub po
ogrzaniu, np. 1200C. PÅ‚ytki spryskuje siÄ™ reagentem lub zanurza w roztworze.
Prócz odczynników w postaci ciekłej wykorzystuje się czasem związki gazowe
np. amoniak, pary jodu lub bromu.
Substancję identyfikowaną można porównywać ze wzorcem na podstawie
porównania ich współczynników RF.
b
RF =
a
RF (retardation factor)  stosunek drogi migracji substancji chromatografowanej (od
punktu startu do środka plamki) do drogi przebytej przez fazę ruchomą (od startu do
ELEKTYW: Witaminy i przeciwutleniacze w żywności i napojach
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
czoła). Najdokładniejsze wartości osiąga się dla RF w zakresie od 0,1 do 0,7. W tym
przedziale substancje nie muszą być chromatografowane na tej samej płytce, jednak
rodzaj płytki i warunki analizy muszą być identyczne.
Ta sama wartość RF nie stanowi 100% pewności identyczności. Należy
przeprowadzić rozwijanie w innych warunkach i potwierdzić uzyskane wcześniej
wyniki.
Do identyfikacji można wykorzystać densytometr i porównać dane z wzorcami.
Przy nieznanej substancji rozdziela siÄ™ jÄ… preparatywnie i identyfikuje
poszczególne składniki innymi metodami, np. spektrofotometrycznie.
ELEKTYW: Witaminy i przeciwutleniacze w żywności i napojach
Cześć praktyczna
___________________________________________________________________________
ĆWICZENIE 3: CHROMATOGRAFIA PLANARNA
Cel ćwiczenia
1. Ocena jakościowa karotenoidów pochodzenia roślinnego.
Materiały
1. PÅ‚ytki TLC
2. Mikropipeta
3. Szpinak
4. Marchew
5. Heksan, aceton, faza ruchoma: heksan : aceton  70 : 30
Przebieg ćwiczenia
1. Rozdrobnić liście szpinaku oraz korzeń marchwi na drobne kawałki.
2. Przenieść do moz
dzierza około 2 g próbki i rozcierać z 2 ml acetonu.
Następnie dodać jeszcze 3 ml acetonu, rozetrzeć i przesączyć przez sączek
karbowany do suchej i czystej probówki.
3. Moz
dzierz przepłukać jeszcze 2 ml acetonu i przelać zawartość na sączek.
4. Do probówek dodać po 2 ml heksanu, wytrząsnąć i po rozdzieleniu warstw,
odebrać pipetą do probówek Eppendorf warstwę heksanu.
5. Na płytkach z żelem krzemionkowym narysować linię startową miękkim
ołówkiem ok. 1 cm od krawędzi płytki.
6. Nanieść  plamki startowe przygotowanych ekstraktów w heksanie za pomocą
mikrostrzykawki, w iloÅ›ci 20 µl (dla ekstraktu ze szpinaku) i 100 µl (dla
ekstraktów z marchwi). Plamki nanosić, przy jednoczesnym odparowywaniu
rozpuszczalnika za pomocÄ… nawiewu powietrza.
7. Po wysuszeniu, płytki rozwijać za pomocą mieszaniny heksan : aceton w
proporcjach: 70 : 30.
ELEKTYW: Witaminy i przeciwutleniacze w żywności i napojach
Cześć praktyczna
___________________________________________________________________________
8. Zaznaczyć na płytce linię czoła i określić wartości Rf (Rf = a/b, gdzie a-droga
przebyta przez środek plamy analizowanej substancji, droga czoła fazy
ruchomej) dla poszczególnych  plamek
Opracowanie wyników
" Wszystkie wartości Rf zestawić w tabeli.
" Zidentyfikować związki wiedząc, że kolejność elucji przebiega następująco:
o Karoten  żółty
o Feofityna a  szary
o Feofityna b  oliwkowo-zielony
o Chlorofil a  niebiesko-zielony
o Luteina  żółty
o Chlorofil b  zielony
o Ksantofile - żółty
" Porównać skład barwników roślinnych liści szpinaku i korzenia marchwi.
Sprawozdania powinno zawierać
1. Krótki wstęp teoretyczny.
2. Cel przeprowadzonego ćwiczenia.
3. Tabelę z wynikami pomiarów i obserwacjami.
4. DyskusjÄ™ i wnioski.