TESTY IMMUNOFLUORESCENCYJNE
TESTY IMMUNOFLUORESCENCYJNE
wykorzystują przeciwciała znakowane barwnikami fluorescencyjnymi:
izotiocyjanian fluoresceiny,
FITC
po wzbudzeniu emituje kolor zielony
izotiocyjanian tetrametylorodaminy,
TRITC
po wzbudzeniu emituje kolor czerwony
Cząsteczki barwnika przyłączone są do cząsteczek immunoglobulin kowalencyjnie
(poprzez grupy aminowe lizyny).
Test immunofluorescencyjny bezpośredni
bakteria
Wykrywa w surowicy/ plwocinie/ wymazie
pacjenta obecność antygenu/ bakterii.
Wynik pozytywny: fluorescencja
obserwowana pod mikroskopem
fluorescencyjnym
Wynik negatywny: brak antygenu = brak
fluorescencji
przeciwciała znakowane
fluorescencyjnie
CDC/Dr. William Cherry
Test immunoflurescencyjny. Bakterie Legionella pneumophila
TESTY IMMUNOFLUORESCENCYJNE
TESTY IMMUNOFLUORESCENCYJNE
Test immunofluorescencyjny pośredni
Wykrywa w surowicy/ plwocinie/ wymazie pacjenta przy pomocy znakowanych
fluorescencyjnie przeciwciał immunoglobuliny, które uprzednio związały się ze
swoistym antygenem. Charakteryzują się większą czułością.
Wynik pozytywny: fluorescencja obserwowana pod mikroskopem fluorescencyjnym
Wynik negatywny: brak przeciwciał = brak fluorescencji
Wykrywanie autoprzeciwciał
Diagnostyka kiły
przeciwjÄ…drowych
(układowe schorzenia autoimmunizacyjne)
T. pallidum
Skrawek
tkanki
Dodajemy surowicÄ™ pacjenta
Przeciwciała
Przeciwciała
pacjenta
pacjenta
Dodajemy przeciwciała
znakowane fluorescencyjnie
przepłukujemy
ANA test
Jeśli pacjent
był/jest zakażony
kiła, obserwuje się
świecenie krętków
JÄ…dro
Krętek kiły
komórkowe
https://courses.stu.qmul.ac.uk/smd/kb/pathology
www.primer.ru/std/gallery_std/ treponema.htm
/funmedpics/pathtes2.htm
TESTY IMMUNOENZYMATYCZNE
TESTY IMMUNOENZYMATYCZNE
wykorzystujÄ… reakcje enzymatyczne do uwidocznienia reakcji
immunologicznej.
Cząsteczki enzymu związane są kowalencyjnie z przeciwciałami lub z biotyną.
Najczęściej stosowane enzymy:
" peroksydaza chrzanowa
immunoglobulina
z czÄ…steczkÄ… enzymu
" alkaliczna fosfataza
Po dodaniu do próbki substratu - chromogenu, enzym przekształca go w barwny
produkt. W miejscu związania się przeciwciał pojawia się kolorowy precypitat.
Testy immunoenzymatyczne charakteryzują się większą czułością niż testy immunofluorescencyjne,
ponieważ jedna cząsteczka enzymu związana z przeciwciałami może katalizować powstanie wielu
czÄ…steczek produktu.
Najczęściej stosowane substraty:
chromogen
" DAB
kolorowy
" AEC
precypitat
" 4-chloro-1-naftol
Aby zwiększyć czułość reakcji immunoenzymatycznej można stosować przeciwciała
znakowane awidyną (białko jaja kurzego) lub streptawidyną (białko Streptomyces
griseus), które wykazuje silne powinowactwo do biotyny (witamina H). Enzymem
znakuje się wówczas biotynę.
wykrywajÄ… antygen in situ (w tkankach) - testy immunohistochemiczne
wykrywają antygen lub przeciwciała w roztworze - test ELISA
TESTY IMMUNOHISTOCHEMICZNE
TESTY IMMUNOHISTOCHEMICZNE
Utrwalony
skrawek tkanki
Dodajemy swoiste
przeciwciała
Po każdym etapie preparat
przepłukuje się buforem
Dodajemy znakowane enzymem
obcogatunkowe przeciwciała wiążące
immunoglobuliny swoiste wobec antygenu
Dodajemy chromogen
W miejscu zwiÄ…zania siÄ™
swoistych przeciwciał powstaje
nierozpuszczalny barwny produkt
ZASTOSOWANIE TECHNIK
ZASTOSOWANIE TECHNIK
IMMUNOHISTOCHEMICZNYCH
IMMUNOHISTOCHEMICZNYCH
Wykrywanie czynnika zakaz
nego w tkankach Wykrywanie określonego białka w tkankach
można śledzić ekspresję określonego genu
można stwierdzić obecność w tkankach
w tkankach
określonego czynnika zakaz
nego
Obecność wirusa syncytium nabłonka dróg
oddechowych (Respiratory syncytial virus, RSV)
w tkance płucnej niemowlęcia pobranej post mortem
Wyraz
nie widoczne zakażone komórki nabłonkowe
Obecność enzymu indukowalnej syntazy tlenku
oskrzeli.
azotu w naskórku objętym łuszczycą. Widoczne
mikroropnie Munro.
© 2005 Novocastra Laboratories Ltd
Wykrywanie markerów różnicowania Wykrywanie określonego białka w komórkach
można śledzić ekspresję określonego genu
można śledzić ekspresję określonego genu
w komórkach hodowanych in vitro
w komórkach hodowanych in vitro
Obecność syntazy tlenku azotu
w keratynocytach i melanocytach
Markery różnicowania melanocytów
ELISA
ELISA
Jeden z najczęściej stosowanych testów immunologicznych.
Test ELISA Przeprowadza się w specjalnych płytkach, które mają zwykle 96 studzienek -
wgłębień.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Wgłębienia opłaszczone
sÄ… substancjÄ… 
A
antygenem bÄ…dz

B
swoistymi przeciwciałami
C
D
E
F
G
H
Po naniesieniu kolejnych próbek,
każdorazowym płukaniu
i dodaniu roztworu chromogenu,
wynik odczytuje siÄ™ w
specjalnych czytnikach ELISA,
spektrofotometrach, które
mierzÄ… absorbancjÄ™.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
Studzienki w rzędzie nr 1 i nr 2 - kontrola pozytywna, próbki
o znanym stężeniu
Studzienki w rzędzie nr 3 i 4 - kontrola negatywna
Studzienki w rzędach 5-12 - próbki
ZASADA DZIAA
ANIA TESTU ELISA
ZASADA DZIAA
ANIA TESTU ELISA
Po każdym etapie preparat inkubuje się,
a następnie przepłukuje buforem
Do studzienek opłaszczonych
antygenem dodajemy swoiste
przeciwciała
Dodajemy znakowane enzymem
obcogatunkowe przeciwciała
wiążące immunoglobuliny swoiste
wobec antygenu
Dodajemy chromogen
Powstaje rozpuszczalny
barwny produkt
Na tym etapie studzienek nie przepłukuje się,
tylko mierzy w czytniku absorbancjÄ™ roztworu