WST
P
Diagnostyka serologiczna jest oparta na reakcjach antygenu i przeciwciała.
Diagnostyka serologiczna zakażeń bakteryjnych odnosi się więc zarówno do
poszukiwania w płynach ustrojowych swoistych przeciwciał jak również
poszukiwania obecności antygenów bakteryjnych przy wykorzystaniu, znanych,
swoistych przeciwciał poli- lub monoklonalnych.
DIAGNOSTYKA SEROLOGICZNA W
Ponieważ diagnostyka zakażeń bakteryjnych opiera się głównie na badaniach
WYBRANYCH ZAKAŻENIACH
bakteriologicznych, w większości przypadków w celu wykazania istniejącego,
BAKTERYJNYCH
czynnego zakażenia nie zachodzi konieczność wykonywania badań
serologicznych.
Dr hab. Waldemar Rastawicki, prof. NIZP-PZH
Nie mniej jednak, w przypadkach chorobowych, w których nie ma możliwości
Zakład Bakteriologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego 
wyizolowania z próbek materiału klinicznego żywych drobnoustrojów lub też ich
Państwowego Zakładu Higieny w Warszawie
DNA, diagnostyka serologiczna stanowi cenne uzupełnienie badań
[e-mail]
bakteriologicznych.
Warszawa 30 stycznia 2014
Immunoglobuliny: klasa IgG, IgA, IgM, IgD, IgE
Średnie wartości miana przeciwciał dla somatycznego antygenu pałeczek
Y. enterocolitica O3 i wydzielniczych białek Yop w próbkach surowicy
osób z jersiniozą
Charakterystyka immunoglobulin klasy G:
4 podklasy: IgG1 - 66%, IgG2 - 23%,
IgG3 - 7%, IgG4 - 4%
1400
LPS Yop
1200
bakteryjne antygeny białkowe
1000
stymulują wytwarzanie głównie IgG1
800
a w mniejszym stopniu IgG3, IgG2 i
IgG4 600
400
antygeny polisacharydowe
200
stymulujÄ… przede wszystkim
przeciwciała IgG2 oraz znacznie 0
słabiej IgG1 i IgG3 IgG IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
Metody wykrywania kompleksów antygen-przeciwciało Metody wykrywania kompleksów antygen-przeciwciało
Odczyny immunologiczne dla przeciwciał i rozpuszczalnych
" Techniki precypitacyjne i immunodyfuzyjne: technika ta antygenów:
oparta jest na wielowarstwowej naturze cząsteczki przeciwciała.
" Test immunoezymatyczny ELISA: antygen osadzony jest
Kompleksy antygen-przeciwciało są rozpuszczalne przy
na powierzchni z tworzywa, kulkach lub filtrze w celu
stężeniach antygenu i przeciwciała będących powyżej i poniżej
wychwycenia i oznaczenia swoistych przeciwciał spośród
strefy równowagi. Metody: np. immunodyfuzja radialna,
innych przeciwciał obecnych w surowicy pacjenta.
immunoelektroprecypitacja
Przeciwciała drugorzędowe, z kowalencyjnie związanym
" Immunohistologia  odczyny dla antygenów związanych z enzymem (np. peroksydazą chrzanową) wykrywają
komórką: antygeny na powierzchni komórki lub w komórce przyłączone do antygenu przeciwciała pacjenta. Oznaczenie
mogą być wykrywane przy użyciu metod spektrofotometryczne, opierające się na intensywności
immunofluorescencyjnych i immunoenzymatycznych (EIA) koloru powstającego w wyniku przekształcenia
odpowiedniego substratu przez enzym (np. nadtlenku
wodoru) pozwala na ocenę poziomu swoistych przeciwciał.
1
Miano przeciwciał
Odczyn immunoenzymatyczny ELISA (pośredni):
Odczyn dot - ELISA:
Odczyt reakcji barwnej
Barwnik
O2
Substrat - H2O2
Wynik reakcji w odczynie dot-ELISA próbki surowicy uzyskanej od
Antyglobulina ludzka sprzężona z peroksydazą
osoby z jersiniozą ( surowica dodatnia ) i próbki surowicy uzyskanej
od osoby zdrowej ( surowica ujemna ) z białkami wydzielniczymi
Surowica pacjenta
pałeczek Yersinia.
Znany antygen przyczepiony do ścianek
dołka płytki polistyrenowej
Reakcje w odczynie western-blot
Metody wykrywania kompleksów antygen-przeciwciało
Odczyny immunologiczne dla przeciwciał i rozpuszczalnych Zestaw western- Zestaw western- Zestaw western-
antygenów: blotting firmy blotting firmy
blotting firmy
Mikrogen Euroimmun
Virotech
2. Test western-blot: jest odmianÄ… metody ELISA.
W metodzie tej białka drobnoustroju rozdzielone
elektroforetycznie przenoszone sÄ… na odpowiedniÄ…
membranÄ™ (nitroceluloza, nylon). Po inkubacji z surowicÄ…
pacjenta, unieruchomione białka wiążą swoiste przeciwciała
i są uwidaczniane z użyciem związanego z enzymem
przeciwciała drugorzędowego. Tak więc, odczyn ten pozwala
na połączenie analizy profilu białek wydzielniczych z
serologicznym potwierdzeniem występowania w badanej
próbce surowicy swoistych przeciwciał dla poszczególnych
frakcji białkowych.
Metody wykrywania kompleksów antygen-przeciwciało Metody wykrywania kompleksów antygen-przeciwciało
Odczyny immunologiczne dla przeciwciał i rozpuszczalnych
Odczyny immunologiczne dla przeciwciał i rozpuszczalnych
antygenów:
antygenów:
4. Test radioimmunoenzymatyczny (RIA): wyznakowane
3. Test immunofluorescencji: w metodzie pośredniej, znany
radioaktywnie (np. jodem 125) przeciwciało lub antygen
antygen jest najpierw utrwalany na szkiełku mikroskopowym
używane są do ilościowego określenia kompleksów antygen-
poprzez aceton, alkohol lub ogrzewanie. Następnie następują
przeciwciało. Może być wykonany jako test wychwycenia
dwie inkubacje - pierwsza z surowicÄ… pacjenta
(jak w przypadku ELISA) lub jako test kompetencyjny, w
(przeciwciała nieznakowane) i druga z przeciwciałami
którym przeciwciało w surowicy pacjenta jest oznaczane na
znakowanymi fluorochromem, będącymi antyglobuliną dla
podstawie jego zdolności do współzawodnictwa i wypierania
pierwszych przeciwciał (np. kozie przeciwciało
wyznakowanego radioaktywnie przeciwciała z kompleksów
wyznakowane izotiocyjanianem fluoresceiny).
antygen-przeciwciało.
2
Jersinioza
Metody wykrywania kompleksów antygen-przeciwciało
Jersinioza jest to ostra lub przewlekła choroba zakaz
na, wywoływana
Odczyny immunologiczne dla przeciwciał i rozpuszczalnych
przez Gram-ujemne pałeczki należące do gatunku Y. enterocolitica i
antygenów:
Y. pseudotuberculosis rodziny Enterobacteriaceae.
5. Odczyn wiązania dopełniacza: w teście tym próbka
surowicy pacjenta reaguje z przygotowanym laboratoryjnie
Y. enterocolitica O3
antygenem. Kompleksy antygen-przeciwciało następnie
Y. enterocolitica O5,27
wiążą, aktywują i zużywają dopełniacz dodawany do
Y. enterocolitica O8
odczynu. W przypadku braku szukanych przeciwciał, wolny
Y. enterocolitica O9
dopełniacz jest wiązany przez kolejny kompleks antygen-
(biotyp 1B, 2, 3, 4)
przeciwciało (czerwone krwinki barana opłaszczone
przeciwciałami). W przypadku obecności wolnego
dopełniacza następuje liza erytrocytów (ujemny wynik
Y. pseudotuberculosis I (rzadziej II-IV)
odczynu  brak swoistych przeciwciał w surowicy pacjenta)
(brak zróżnicowania na biotypy)
Jersinioza Jersinioza
Kliniczne postacie jersiniozy:
Rezerwuarem Y. enterocolitica sÄ… sÄ…
przede wszystkim świnie, oraz w
mniejszym stopniu, inne zwierzęta
1. Postać jelitowa
gospodarskie.
2. Postać pseudowyrostkowa
3. Rumień guzowaty
4. Reaktywne zapalenie stawów
Rezerwuarem pałeczek
Y. pseudotuberculosis są 5. Postać posocznicowa
głównie gryzonie, zające i
6. Inne postacie np. zapalenie
dzikie króliki, u których
gardła, ropnie narządów
wywołują rodencjozę (tzw.
wewnętrznych
gruz
licÄ™ rzekomÄ…).
Jersinioza Jersinioza
Występowanie przeciwciał dla różnych serotypów pałeczek Yersinia w
1. Odczyn aglutynacji probówkowej i hemaglutynacji biernej:
próbkach surowicy osób chorych w latach 2000-2012
stosunkowo niska czułość i swoistość
subiektywność w odczycie wyniku reakcji (brak
możliwości standaryzacji)
odczyny te wykrywają głównie przeciwciała
klasy IgM !
2.Odczyn immunofluorescencji
3. Odczyn ELISA i western-blot (test referencyjny)
3
Jersinioza
Jersinioza
Antygeny pałeczek Yersinia wykorzystywane w komercyjnych Dynamika przeciwciał dla antygenów pałeczek Yersinia w
poszczególnych klasach immunoglobulin
testach serologicznych:
IgM
wydzielnicze białka Yop, kodowane przez plazmid zjadliwości pYV
Minus:
IgG
brak możliwości określenia gatunku oraz grupy serologicznej pałeczek
Yersinia odpowiedzialnych za stymulacjÄ™ antygenowÄ…
IgA
IgA
Antygeny pałeczek Yersinia wykorzystywane w rutynowych
badaniach serologicznych w NIZP-PZH:
wydzielnicze białka Yop, kodowane przez plazmid zjadliwości pYV
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
antygeny somatyczne (LPS) uzyskane z pałeczek Y. enterocolitica O3, Tygodnie
O8, O9, i Y. pseudotuberculosis I
IgA jersinioza niepowikłana IgA jersinioza powikłana zap. stawów
IgG IgM
Salmoneloza, dur brzuszny i dur rzekomy
Jersinioza
Salmonelozy są to choroby wywoływane pałeczkami
Dynamika przeciwciał dla somatycznego antygenu Y. pseudotuberculosis
Salmonella innymi niż Salmonella Typhi i Paratyphi.
I i białek wydzielniczych Yop w przebiegu jersiniozy u 28-letniej
pacjentki z objawami rumienia guzowatego i reaktywnego
Dur brzuszny jest to zachorowanie wywołane
zapalenia stawów
pałeczką duru brzusznego S.Typhi.
Dury rzekome sÄ… to zachorowania spowodowane
12000 Miano przeciwciał 10000 Miano przeciwciał
pałeczkami duru rzekomego S. Paratyphi A, B lub C.
IgA IgG IgM IgA IgG IgM
9000
10000
8000
Y.pst. I Yop
7000
8000
Badania serologiczne:
6000
6000 5000
4000
odczyn aglutynacji probówkowej (odczyn Widala)
4000
3000
odczyn hemaglutynacji biernej (OHB)
2000
2000
1000 odczyn immunoenzymatyczny ELISA
0 0
inne, szybkie testy serologiczne
20 29 35 83 137 195 368 453 735 20 29 35 83 137 195 368 453 735
Salmoneloza, dur brzuszny i dur rzekomy
Salmoneloza, dur brzuszny i dur rzekomy
Odczyn Widala:
Odczyn aglutynacji probówkowej Widala:
Surowica badana - szereg dwukrotnych rozcieńczeń od 1:50 do 1:3200 Aglutynacja O - na dnie probówki osad w postaci błonki lub grudek,
mocno przylegający do dna. Po wstrząśnięciu
rozpada siÄ™ w drobnoziarnistÄ… zawiesinÄ™.
Antygeny- zawiesiny bakteryjne do aglutynacji:
Aglutynacja H - na dnie probówki osad przypominający kłaczek
Salmonella Typhi O i H
waty. Po wstrząśnięciu rozpada się całkowicie.
Salmonella Paratyphi A O i H
Salmonella Paratyphi B O i H
Tylko równoczesne wystąpienie aglutynacji w odpowiednio wysokim
Salmonella Paratyphi C O i H
rozcieńczeniu surowicy z zawiesiną O (e" 200) i H (e" 400) danego gatunku
Salmonella Enteritidis ( zawiesina H )
pałeczek Salmonella, przy braku aglutynacji z innymi zawiesinami
Salmonella Typhimurium i i 1,2
( nieuzasadnionej schematem antygenowym), uprawnia do rozpoznania
Proteus vulgaris OX19
zakażenia.
4
Miano przeciwciał
Salmoneloza, dur brzuszny i dur rzekomy
Salmoneloza, dur brzuszny i dur rzekomy
Odczyn hemaglutynacji biernej (OHB):
Odczyn hemaglutynacji biernej (OHB):
możliwość wystąpienia fałszywie dodatnich wyników. Identyczny
Surowica badana - inaktywacja w temp. 56o C i wstępna absorpcja z
antygen 9,12 występujący w antygenie O S. Typhi występuje u wszystkich
zawiesinÄ… krwinek baranich.
pałeczek Salmonella z grupy D. Konieczne jest więc potwierdzenie w
odczynie Widala podwyższonego poziomu przeciwciał dla rzęskowego
Antygen - krwinki baranie opłaszczone antygenem O i Vi S. Typhi
antygenu d
w przebiegu duru brzusznego przeciwciała dla antygenu Vi w mianie
Za diagnostycznie znamienny można uznać wynik OHB uzyskany:
e" 80 stwierdza się tylko u 60% chorych. Występują one natomiast u
- z antygenem O S.Typhi przy rozcieńczeniu badanej surowicy e" 320
95% nosicieli, osiągając miano wielokrotnie wyższe niż u osób chorych
- z antygenem Vi S. Typhi przy rozcieńczeniu badanej surowicy e" 40
Salmoneloza, dur brzuszny i dur rzekomy Salmoneloza, dur brzuszny i dur rzekomy
Odczyn immunoenzymatyczny ELISA:
TyphidotÚö - szybki test do wykrywania
Úö
Úö
Úö
przeciwciał klasy IgG i IgM dla białka 50 kDa.
Ten szybki test immunoenzymatyczny
W NIZP- PZH w serodiagnostyce salmonelozy wykorzystujemy obecnie
charakteryzuje się 75% swoistością i 95%
odczyn immunoenzymatyczny (ELISA). Jako antygen wykorzystujemy
czułością w wykrywaniu zakażeń S. Typhi
lipopolisacharydy uzyskane z pałeczek Salmonella należących do grupy
serologicznej B i D.
Multi-test Dip-S-Tics (Panbio INDX)  szybki test
Z powodu wysokiego poziomu tła oraz licznych reakcji krzyżowych
immunoenzymatyczny oparty na wiÄ…zaniu siÄ™ swoistych
konieczne jest śledzenie dynamiki przeciwciał w dwóch próbkach surowicy
przeciwciał obecnych w badanych próbkach surowicy do LPS
uzyskanych w odstępie 10-14 dni. W celu wykazania, pałeczki której grupy
pałeczek S. Typhi
serologicznej były odpowiedzialne za zakażenie, możliwe jest
wykonywanie absorpcji surowicy zawiesiną pałeczek Salmonella.
Kampylobakterioza
Salmoneloza, dur brzuszny i dur rzekomy
Komercyjny test TUBEX ( IDL Biotech )
Szybki test, oparty na konkurencji pomiędzy przeciwciałami klasy IgM Ostra, odzwierzęca choroba zakaz
na wywołana przez bakterie z rodzaju
obecnymi w surowicy pacjenta a monoklonalnymi przeciwciałami dla Campylobacter, do której dochodzi najczęściej w następstwie spożycia
LPS S. Typhi przyczepionymi do cząsteczek kolorowego lateksu w skażonej wody i żywności. Przebiega pod postacią ostrego zapalenia
wiązaniu się do antygenu (LPS) znajdującego się na powierzchni żołądkowo-jelitowego lub zapalenia jelit. Sporadycznie może wystąpić
cząsteczek magnesu. w postaci uogólnionej, jako bakteriemia, ropnie narządowe, septyczne
zapalenia stawów czy też zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych.
Przeciwciała monoklonalne dla LPS S. Typhi
Ze względu na krótki okres trwania choroby w klasycznej postaci
kampylobakteriozy, badania serologiczne wykonywane są głównie
Przeciwciała
LATEKS w surowicy w przypadku:
pacjenta dla
LPS S. Typhi
przewlekłych biegunek
LPS
LPS
LPS
zespół Guillaina-Barrego
LPS
CzÄ…steczka
Cząsteczka zapalenia stawów
LPS
magnesu
magnesu
LPS
zespół Reitera
5
Kampylobakterioza Kampylobakterioza
W przebiegu kampylobakteriozy wytwarzane są surowicze przeciwciała
Serologiczne badanie przy podejrzeniu kampylobakteriozy może być klasy IgA, IgM, i IgG. Przeciwciała klasy IgA dla antygenów pałeczek C.
prowadzone w kierunku poszukiwania swoistych przeciwciał w próbce jejuni pojawiają się w surowicy około piątego dnia od zakażenia osiągając
surowicy lub poszukiwania swoistego antygenu w próbce kału maksymalny poziom w drugim tygodniu choroby. Przeciwciała tej klasy
można wykryć na diagnostycznie znamiennym poziomie w surowicy osób
z przebytą kampylobakteriozą do trzech miesięcy od początku objawów
klinicznych.
W serodiagnostyce kampylobakteriozy znalazły zastosowanie:
Poziom przeciwciał klasy IgG narasta powoli, lecz utrzymuje się na
odczyn wiązania dopełniacza
wysokim poziomie nawet do kilku-kilkunastu miesięcy. Uważa się, że w
odczyn immunoenzymatyczny ELISA
celu potwierdzenia ostrej infekcji jelitowej, najwyższą wartość
odczyn western-immunoblotting
diagnostyczną ma wykazanie znamiennego przyrostu poziomu przeciwciał
szybkie testy immunochromatograficzne
klasy IgA i IgM, rzadziej klasy IgG, w dwóch próbkach surowicy
uzyskanych w odstępie 2 tygodni. W przypadku powikłań
kampylobakteriozy przyjęto, iż największe znaczenie ma wykazanie
serokonwersji przeciwciał klasy IgA i IgG.
Kampylobakterioza Kampylobakterioza
Aktualnie dostępnych jest na rynku szereg testów komercyjnych, np:
- Serion ELISA Classic Campylobacter IgA/IgG/IgM firmy Virion/ Serion
Wyniki wykrywania komercyjnym
(antygen to uzyskane w warunkach natywnych, termostabilne białko o masie
testem recomLine Campylobacter
45 kDa, będące głównym białkiem błony zewnętrznej)
IgA/IgG firmy Mikrogen przeciwciał
dla rekombinowanych białek pałeczek
- Anty  Campylobacter jejuni IgA/IgG firmy Euroimmun (mieszanina
C. jejuni i C.coli w próbkach surowicy
antygenów C. jejuni szczepu ATCC 33291, w tym głównie białka o masie
uzyskanych od dwóch osób z
45 kDa)
zespoÅ‚em Guillaina Barrégo.
- recomWell Campylobacter IgA/IgG firmy Mikrogen (rekombinowane
białka C. jejuni i C. coli, takie jak: PEB4, OMP18, P39).
-recomLine Campylobacter IgG/ IgA firmy Mikrogen (odczyn western-
immunobloting. Oznaczanie poziomu przeciwciał dla rekombinowanych
białek C. jejuni i C. coli tj. MOMP, PEB4, PEB2, PEB1, OMP18 i P39.
Rokosz-Chudziak N. Ocena przydatności rekombinowanych białek oraz komórkowych antygenów
Campylobacter jejuni w serodiagnostyce kampylobakteriozy u ludzi. Rozprawa doktorska, NIZP-PZH,
2013.
Zakażenia Helicobacter pylori
Zakażenia Helicobacter pylori
Testy inwazyjne:
H. pylori to Gram-ujemne, spiralnie skręcone,
urzęsione pałeczki odpowiedzialne za - histologiczne badanie bioptatu, posiew, test ureazowy
wywoływanie nieswoistego, przewlekłego
zapalenia żołądka, prowadzącego często do
powstania wrzodów . Testy nieinwazyjne:
Do zakażenia dochodzi na drodze kontaktu - wykrywanie przeciwciał klasy IgA, IgG i IgM w surowicy
bezpośredniego już we wczesnym etapie życia.
- wykrywanie poziomu przeciwciał klasy IgG w ślinie i w moczu
Zakażenie H. pylori występuje powszechnie na
całym świecie, chociaż stwierdza się różnice w - wykrywanie antygenu w kale (tzw. test kałowy)
częstości infekcji w poszczególnych krajach.
- test oddechowy z podaniem mocznika znakowanego aktywnym
Częściej zakażenia tą bakterią stwierdza się w
węglem
krajach rozwijajÄ…cych siÄ™, gdzie dotyka co
najmniej 70% osób, a tylko ok. 30% populacji w - wykrywanie obecności DNA H. pylori w płytce nazębnej metodą
krajach wysokorozwiniętych. PCR
6
Zakażenia Helicobacter pylori
Zakażenia Helicobacter pylori
U osób zakażonych H. pylori, pojawiają się swoiste przeciwciała zarówno w
Testy serologiczne: surowicy jak i w ślinie i moczu, skierowane między innymi na: ureazę,
toksynę wakuolizującą (VacA) oraz na białkowe produkty kompleksu genu
- odczyn hemaglutynacji biernej
CagA.
- immunofluorescencji
Najwyższą wartość diagnostyczną ma wykazanie podwyższonego poziomu
- odczyn wiązania dopełniacza
przeciwciał klasy IgG w surowicy. Po skutecznej eradykacji, nieznaczny
- odczyn aglutynacji lateksowej (25%) spadek stężenia IgG występuje dopiero po 6 miesiącach, a 50%
spadek po 12 miesiącach. Tak więc, badanie poziomu przeciwciał odczynem
- szybkie testy
ELISA nie nadaje się do szybkiej kontroli skuteczności antybiotykoterapii.
immunochromatograficzne
Bardziej przydatną metodą do tego celu jest poszukiwanie w kale antygenów
- odczyn immunoenzymatyczny H. pylori (tzw. test kałowy).
(ELISA)
Testy serologiczne, ze względu na niskie koszty i stosunkowo wysoką
- odczyn western-blot
czułość, są przydatne do skriningowych badań pacjentów zgłaszających się
po raz pierwszy do leczenia.
Zakażenia Listeria monocytogenes Zakażenia Listeria monocytogenes
L. monocytogenes jest drobnoustrojem patogennym Listerioza stanowi dość często przyczynę poronień,
dla ludzi i zwierząt oraz etiologicznym czynnikiem martwych urodzeń, wad wrodzonych oraz urodzeń
listeriozy występującej w postaci zachorowań dzieci uszkodzonych z niską masą urodzeniową.
sporadycznych i epidemicznych. Do zakażenia Choroba ta w około 2% przypadków jest przyczyną
dochodzi przeważnie w wyniku spożycia skażonej poronień i porodów przedwczesnych lub obumarcia
żywności, głównie miękkich serów, surowych płodu. Wczesna postać u dziecka objawia się jako
warzyw, ryb, mleka. posocznica, póz
na, powyżej 5 dnia życia, jako
zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych.
Listerioza najczęściej objawia się jako zapalenie
opon mózgowo-rdzeniowych, bakteriemia, U matki choroba przebiega jako grypopodobna
zakażenie okołoporodowe. W przebiegu zakażenia infekcja lub zapalenie dróg moczowych.
może dojść do zapalenia wsierdzia, wątroby,
otrzewnej, żołądka i jelit.
Zakażenia Listeria monocytogenes Zakażenia Listeria monocytogenes
Podstawą rozpoznania listeriozy jest izolacja pałeczek L. monocytogenes Za wynik dodatni przyjmuje się wystąpienie aglutynacji przy
z próbek materiału klinicznego. rozcieńczeniu surowicy równym lub wyższym 256. Jednakże, za
wiarygodne rozpoznanie aktualnego zakażenia należy przyjąć co
Rozróżnia się 13 różnych serotypów pałeczek L. monocytogenes, spośród
najmniej czterokrotny przyrost miana swoistych przeciwciał w
których najczęściej za zakażenia odpowiedzialne są serotypy 1/2a, 1/2b i
dwóch próbkach surowicy uzyskanych w różnych okresach choroby.
4b. Dominującymi antygenami somatycznymi tych serotypów są antygeny
cząstkowe I, II, III oraz V. Antygen V występuje również u zjadliwych Ze względu na możliwość występowania licznych reakcji
szczepów pałeczek L. ivanovii. krzyżowych interpretacja wyników badań serologicznych w kierunku
listeriozy powinna być prowadzona z dużą ostrożnością, zawsze w
W praktyce, badania serologiczne ograniczają się głównie do
powiÄ…zaniu z objawami klinicznymi i danymi epidemiologicznymi.
poszukiwania odczynem mikroaglutynacji przeciwciał dla somatycznych
antygenów cząstkowych: I-II i V.
7
Tularemia Tularemia
Tularemia występuje u ssaków, ptaków, płazów, ryb a nawet u
Kliniczne postacie zakażenia wywołanego przez Francisella tularensis:
bezkręgowców. Naturalnym rezerwuarem F. tularensis są króliki,
wiewiórki, nornice, myszy, szczury i inne gryzonie.
1. Postać wrzodziejąco-węzłowa
2. Postać węzłowa
3. Postać anginowa
4. Postać żołądkowo-jelitowa
5. Postać płucna
6. Postać oczno-węzłowa
7. Postać durowa
Ludzie zarażają się poprzez ukąszenia owadów (np. kleszczy), kontaktu z
.
zakażonymi tkankami zwierząt, skażoną ziemią, spożyciem zakażonej
wody lub żywności jak też drogą aerogenną.
Tularemia
Tularemia
Aglutynacja szkiełkowa:
Laboratoryjna diagnostyka tularemii:
Reakcja zlepna zachodzÄ…ca po zmieszaniu surowicy immunizowanych
1. Preparaty mikroskopowe
królików o wysokim mianie przeciwciał z zawiesiną bakteryjną. Służy do
2. Preparaty histologiczne
szybkiego potwierdzania wzrostu F. tularensis na podłożach stałych.
3. Hodowla
4. Metody genetyczne
5. Próba biologiczna
6. Badania serologiczne
a. poszukiwanie antygenu
b. poszukiwanie przeciwciał
Tularemia
Tularemia
Aglutynacja probówkowa:
Immunofluorescencja bezpośrednia:
Jest to najczęściej używany test serologiczny wykorzystywany do
Reakcja pomiędzy króliczymi przeciwciałami znakowanymi
poszukiwania swoistych przeciwciał w surowicy osób podejrzanych o
fluoresceiną i antygenami pałeczek F. tularensis. Przy użyciu tej
tularemię. Odczyn jest przeprowadzany w probówkach z kolejnymi,
metody można poszukiwać swoistego antygenu w hodowli
dwukrotnymi rozcieńczeniami badanej surowicy (1/25, 1/50 itd.)
bakteryjnej, wymazach z wrzodów, tkankach, krwi i plwocinie.
8
Tularemia Tularemia
Aglutynacja probówkowa: Aglutynacja probówkowa:
Dla oceny aglutynacji należy stosować 5 - stopniową skalę:
Do probówek zawierających rozcieńczenia próbki surowicy
diagnostycznej, surowicy kontrolnej ujemnej, surowicy kontrolnej
+++ silna aglutynacja o charakterze grudkowym, płyn nad osadem
dodatniej oraz kontroli antygenu dodaje siÄ™ po jednej kropli (50 µl)
całkowicie przejrzysty
zawiesiny pałeczek Francisella tularensis zabitych formaliną.
++ liczne grudki na dnie probówki, płyn lekko opalizujący
Po dokładnym wymieszaniu zawartości probówki wstawia się do
+ nieliczne grudki na dnie probówki, płyn lekko mętny
cieplarki o temp. 37° C +/- 2° C na 18 - 20 godzin. +/- Å›lad aglutynacji, pÅ‚yn caÅ‚kowicie mÄ™tny podobnie jak w
kontroli antygenu bez surowicy
W przypadku wystÄ…pienia aglutynacji na dnie
- brak aglutynacji, płyn całkowicie mętny podobnie jak w
probówki stwierdza się osad w postaci grudek,
kontroli antygenu bez surowicy
który mocno przylega do dna probówki, a po
wstrząśnięciu rozpada się w drobnoziarnistą
Za miano przeciwciał przyjmuje się odwrotność najwyższego
zawiesinę. Podczas odczytu uwzględnia się
rozcieńczenia próbki surowicy, przy którym wystąpiła aglutynacja
również stopień przezroczystości płynu nad
oceniana co najmniej na +
osadem.
Tularemia
Tularemia
Test lateksowy:
Mikroaglutynacja:
W badaniach serologicznych, do
Odczyn ten wykonywany jest na metapleksowych płytkach w
poszukiwania swoistych przeciwciał
studzienkach o dnie w kształcie litery U. Jako antygenu używa się
można wykorzystać test lateksowy,
zawiesiny całych komórek F. tularensis zabitych formaliną i barwionych
np. produkowany przez firmÄ™ Becton
safraninÄ….
Dickinson. Reakcje zlepne uzyskane
w surowicy rozcieńczonej 1:20 lub
Za wynik dodatni przyjmuje się wyżej uważane są za wyniki dodatnie.
czterokrotny przyrost lub spadek
miana przeciwciał w dwóch
Odczyn western-immunoblotting:
próbkach surowicy uzyskanych
Poszukuje się przeciwciał dla
w odstępie co najmniej 14 dni
poszczególnych białek F.tularensis,
lub miano przeciwciał e" 128.
w tym głównie dla białek błony
zewnętrznej, o masie 17 i 43 KDa.
Tularemia Porównanie częstości wykrywania przeciwciał dla antygenów
F. tularensis w 90 badanych próbkach surowicy odczynem ELISA NIZP-
PZH i komercyjnym zestawem ELISA firmy Virion/Serion.
Zestaw ELISA opracowany we własnym zakresie (ELISA NIZP-
PZH). Odczyn wykonuje się na polistyrenowych płytkach Maxi Sorp
firmy Nunc, poszukując przeciwciał w klasie IgA, IgG i IgM.
Klasa badanych Liczba (odsetek) próbek z wynikiem w odczynie ELISA: Liczba (odsetek)
Antygenem jest zawiesina pałeczek F. tularensis rozbitych
przeciwciał próbek z
wynikiem
ultradz
więkami.
NIZP-PZH + NIZP-PZH + NIZP-PZH  NIZP-PZH 
zgodnym
Virion/Ser. + Virion/Ser.  Virion/Ser.+ Virion/Ser. 
Odczyn ELISA umożliwia wykazanie podwyższonego poziomu
przeciwciał w klasie immunoglobulin G, utrzymujących się zazwyczaj we
IgG
39 (43,3%) 3 (3,3%) 1 (1,1%) 47 (52,2%) 86 (95,5%)
krwi osób zakażonych znacznie dłużej od pozostałych immunoglobulin.
Pozwala to na określenie częstości występowania zakażeń, nie dających
IgM
ostrych objawów klinicznych, u osób zamieszkujących tereny endemiczne 38 (42,2%) 1 (1,1%) 1 (1,1%) 50 (55,5%) 88 (97,7%)
dla F. tularensis.
Zestaw ELISA Francisella tularensis IgG/IgM firmy Virion/Serion (nr
kat. ESR142G/M). Umożliwia zbadanie poziomu przeciwciał klasy IgG i
Rastawicki W, Wolaniuk N. Porównanie przydatności komercyjnego zestawu ELISA firmy
IgM dla lipopolisacharydu uzyskanego z pałeczek F. tularensis. Virion/Serion, zestawu ELISA opracowanego we własnym zakresie oraz odczynu aglutynacji
probówkowej w serodiagnostyce tularemii. Med Dośw Mikrobiol 2013; 65:255-261.
9
Twardziel
Twardziel
Twardziel (scleroma lub rhinoscleroma) jest endemicznie występującą, Zmiany chorobowe, początkowo najczęściej w postaci atroficznych
przewlekłą chorobą zakaz
ną wywoływaną przez pałeczki Klebsiella ognisk błony śluzowej górnych dróg oddechowych, z upływem czasu
rhinoscleromatis. prowadzą do rozwoju nacieków, guzów twardzielowych i zmian
zniekształcających nos i górną wargę.
Choroba występuje obecnie na świecie bardzo
rzadko. Dawniej występowała endemicznie głównie
na terenach Europy środkowo-wschodniej
(szczególnie: Węgry, Rumunia, Rosja, Słowacja,
Czechy) w tym także we wschodnich
województwach Polski.
Obecnie nie rejestruje siÄ™ w Polsce nowych
Jest to rodzaj przewlekłego, swoistego zapalenia wytwórczego górnych przypadków zachorowań, chociaż w latach
dróg oddechowych. Najczęściej dotyczy ona jamy nosowej także jamy 1973-1998 u 36 (7,4%) osób, wśród 484 badanych,
ustnej, gardła, krtani, rzadko tchawicy i oskrzeli. Jest chorobą zaraz
liwÄ…. stwierdzono diagnostycznie znamienny poziom
przeciwciał dla antygenu K rhinoscleromatis.
Twardziel Krztusiec
Diagnostyka twardzieli opiera się głównie na badaniach serologicznych,
wykonywanych od szeregu lat odczynem wiązania dopełniacza (OWD).
W odczynie tym wykrywa się przeciwciała klasy IgM i w mniejszym Krztusiec jest ostrą, zakaz
nÄ…
stopniu klasy IgG. chorobą dróg oddechowych,
głównie wieku dziecięcego,
W Zakładzie Bakteriologii NIZP-PZH opracowano odczyn ELISA z wywoływaną przez drobne,
somatycznym antygenem uzyskanym ze szczepu K. rhinoscleromatis Gram-ujemne pałeczki
Rh32. W surowicy chorych na twardziel wykrywa się przeciwciała dla
Bordetella pertussis.
somatycznego, zlokalizowanego w LPS bakteryjnym, czÄ…stkowego
antygenu 2a pałeczek Klebsiella. Poziom przeciwciał jest skorelowany z
długotrwałością procesu chorobowego, jego aktywnością i rozległością
Według definicji WHO krztusiec to choroba charakteryzująca się kaszlem
zmian miejscowych.
utrzymującym się powyżej 2 tygodni, której towarzyszy jeden z
następujących objawów:
Odczyn ELISA w porównaniu do OWD charakteryzuje się znacznie
- napadowy kaszel
wyższą czułością co umożliwia wcześniejsze wykrycie swoistych
- ,,pianie na wdechu lub wymioty po kaszlu, bez innej znanej
przeciwciał i pozwala na określenie poziomu przeciwciał osobno w
przyczyny.
poszczególnych klasach immunoglobulin.
Objawy kliniczne krztuśca
Diagnostyka krztuśca
W pierwszej fazie krztuśca, czyli w 1-3 tygodniu od zakażenia, występuje
Hodowla - Wśród metod stosowanych w diagnostyce krztuśca a
łagodny kaszel, nasilający się w nocy, nieżyt gardła, katar, czasem
rekomendowanych przez WHO, nadal złotym standardem w
gorączka, która trwa średnio 1-4 tygodni. Zwykle nie odróżnia się
laboratoryjnym potwierdzeniu przypadku pozostaje hodowla.
początkowych objawów krztuśca od innych infekcji górnych dróg
oddechowych. W tej fazie krztusiec jest najbardziej zakaz
ny, a jego
PCR - Obecnie, w wielu laboratoriach zajmujÄ…cych siÄ™ diagnostykÄ…
leczenie najskuteczniejsze.
krztuśca na świecie, hodowla zastępowana jest przez metody oparte o
technikę PCR. Jest to metoda bardziej czuła w porównaniu do hodowli
W kolejnej fazie, trwającej 7-14 dni, pojawiają się typowe dla krztuśca,
oraz bardziej swoista w porównaniu do metod serologicznych.
powtarzające się, ciężkie napady kaszlu.
Powinna być ona metodą z wyboru w diagnostyce krztuśca u małych
dzieci.
W ciągu kolejnych 2-8 tygodni napady kaszlu ustępują stopniowo. Sam
kaszel o różnym nasileniu może utrzymywać się wiele tygodni.
Serodiagnostyka - odczyn mikroaglutynacji, odczyn wiÄ…zania
dopełniacza, odczyn pośredniej immunofluorescencji, odczyn
U starszych dzieci oraz dorosłych zakażenia przebiegają często łagodnie
hemaglutynacji biernej, odczyn neutralizacji na linii komórkowej
i rzadko sÄ… rozpoznawane przez lekarzy. odczyn western-immunoblotting, odczyn immunoenzymatyczny
ELISA
10
Odpowiedz
immunologiczna w przebiegu krztuśca
Diagnostyka krztuśca
Przeciwciała klasy IgM pojawiają się najwcześniej w przebiegu krztuśca i
świadczą zazwyczaj o ostrej fazie choroby. Ponieważ nie przechodzą przez
łożysko, wykrycie ich u nieszczepionych dzieci świadczy o zakażeniu. Testy
ELISA wykrywające IgM charakteryzują się niską czułością i swoistością
(możliwe reakcje krzyżowe).
Przeciwciała IgG pojawiają się zwykle w 2-3 tygodniu od zakażenia, a ich
najwyższy poziom występuje między 8 a 10 tygodniem choroby. Nieznacznie
podwyższony poziom przeciwciał może utrzymywać się przez wiele lat po
przebytej infekcji. Matczyne przeciwciała klasy IgG mogą przechodzić przez
łożysko i być obecne u dzieci do 6 miesiąca życia.
Przeciwciała klasy IgA stymulowane są głównie podczas naturalnego
zakażenia. Ponieważ przeciwciała klasy IgA są słabo produkowane u małych
dzieci, uzyskanie ujemnego wyniku badania nie wyklucza zakażenia
pałeczkami krztuśca (niska czułość).
wg. Dalby T. Sampling and transport for pertussis PCR; Turku 25-27.04.2012
Serodiagnostyka krztuśca
Serodiagnostyka krztuśca
Antygeny w odczynach serologicznych:
Swoiste przeciwciała dla antygenów krztuścowych produkowane są
-toksyna krztuścowa (PT)
zarówno w przebiegu zakażenia jak i po szczepieniu ochronnym. Z tego
-włókienkowa hemaglutynina (FHA)
powodu nie jest możliwe rozróżnienie odpowiedzi poszczepiennej od
-pertaktyna (PRN)
trwającej infekcji podczas badania jednorazowo uzyskanej próbki
-fimbrie (FIM)
surowicy od pacjenta szczepionego w ciÄ…gu ostatniego roku.
-toksyna cyklazy adenylowej (ACT)
-endotoksyna lub fragmenty błony komórkowej (lizat komórek)
Z tego względu najlepszym potwierdzeniem aktualnego zakażenia w
badaniach serologicznych jest wykazanie diagnostycznie znamiennego
Najbardziej swoistym antygenem jest toksyna krztuścowa. Pozostałe
przyrostu lub spadku poziomu przeciwciał w co najmniej dwóch próbkach
antygeny mogą dawać reakcje krzyżowe z przeciwciałami dla
surowicy uzyskanych w różnych okresach choroby.
B. parapertussis, Haemophilus sp., M. pneumoniae, E. coli.
Serodiagnostyka krztuśca
Serodiagnostyka krztuśca
Poziom diagnostycznie znamienny (cut-off) określa się najczęściej na
EU Pertstrain group działająca przy ECDC zaleca wyłącznie
podstawie badania surowicy kontrolnej cut-off dołączonej przez
poszukiwanie przeciwciał klasy IgG dla toksyny krztuścowej odczynem
producenta do danego zestawu ELISA. W tym przypadku wynik badania
ELISA. Za diagnostycznie znamienny w odczynie ELISA przyjęli oni
podaje siÄ™ zazwyczaj w umownych jednostkach np. NTU (Novatec Units)
100% wzrost lub 50% spadek poziomu przeciwciał w dwóch, kolejnych
czy VE (Virotech Units).
próbkach surowicy uzyskanych w odstępie 2-4 tygodni.
Bardziej poprawną metodą, umożliwiającą standaryzację testu, jest
W przypadku, kiedy nie ma możliwości uzyskania powtórnych próbek,
podawanie wyniku badania w jednostkach międzynarodowych (EU/ml),
zachodzi konieczność interpretacji wyniku na podstawie poziomu
wyliczonych poprzez interpolację wartości OD surowicy badanej na
przeciwciał oznaczonego w jednorazowo uzyskanej próbce. W takim
krzywej wykreślonej przy użyciu standardów o znanym poziomie
przypadku za dodatni wynik badania przyjmuje się wartość
przeciwciał określonych w jednostkach międzynarodowych.
przekraczajÄ…cÄ… poziom diagnostycznie znamienny.
11
Serodiagnostyka krztuśca Serodiagnostyka krztuśca
Wiarygodność poziomu cut-off ma zasadnicze znaczenie dla czułości i
W piśmiennictwie spotkać się można z różnymi wartościami cut-off w
swoistości testu ELISA. Cut-off ustala się zazwyczaj na wysokości
zależności od kraju w którym przeprowadzano badania. Generalnie, w
średniej arytmetycznej lub geometrycznej (x) wartości wyników przypadku badania przeciwciał klasy IgG dla toksyny krztuścowej
wartość ta waha się od 40 IU/ml do 125 IU/ml, natomiast w
uzyskanych podczas badania osób klinicznie zdrowych, powiększoną o
przypadku klasy IgA od 10 IU/ml do 20 IU/ml.
dwa lub trzy odchylenia standardowe (SD).
W celu standaryzacji wyników badań serologicznych w kierunku
W celu poprawnego ustalenia tego poziomu, niezwykle istotne jest aby
krztuśca dostępna jest surowica standardowa (WHO International
osoby te stanowiły reprezentatywną w danym kraju grupę dla danego
Standard 06/140) zawierająca określone stężenie przeciwciał klasy IgA
kierunku badania. Czasami zachodzi konieczność ustalenia kilku
i IgG dla toksyny krztuścowej, włókienkowej hemaglutyniny i białka
poziomów cut-off, w zależności od wieku badanych osób.
pertaktyny.
Algorytm postępowania w diagnostyce zakażeń Bordetella
ELISA Czułość Swoistość
pertussis metodÄ… ELISA
Czułość i swoistość
(%) (%)
różnych testów
Dane według:
ELISA (klasa IgA) Dr. Merk IgA 53 74
M. Riffelmann i wsp. Performance of commercial enzyme-linked immunosorbent
assays for detection of antibodies to Bordetella pertussis. Journal of Clinical
Virion/Serion IgA 68 67
Microbiology. 2010; 48: 4459-4463
Dane według:
Virotech IgA 69 70
M. Riffelmann i wsp.
Performance of commercial ELISA anty-PT IgG
Virotech PT IgA 71 84
enzyme-linked
immunosorbent assays for
Euroimmun IgA 73 94
detection of antibodies to
<40 IU/ml 40-100 IU/ml 40-100 IU/ml >=100 IU/ml
Bordetella pertussis. Journal
Novagnost IgA 72 75
of Clinical Microbiology.
2010; 48: 4459-4463
IBL IgA 64 68
IgA-PT<12 IU/ml
IgA-PT>=12 IU/ml
brak aktualnego aktualne
brak aktualnego
aktualne
Novatec IgA 68 75
zakażenia zakażenie
zakażenia
zakażenie
Częstość występowania przeciwciał dla lipopolisacharydów
Częstość występowania przeciwciał dla lipopolisacharydów
pałeczek Bordetella parapertussis u osób
pałeczek Bordetella parapertussis u osób
z przewlekłym kaszlem w Polsce
z przewlekłym kaszlem w Polsce
Zakażenia pałeczkami B. parapertussis jak i B. pertussis wywołują
podobne objawy chorobowe i nie jest możliwe ich rozróżnienie w Do badań użyto 1192 próbek surowicy, uzyskanych od osób z objawami
badaniach klinicznych. Przyjmuje się, że 20-30% osób z przewlekłym infekcji układu oddechowego, objawiającej się między innymi przewlekłym
kaszlem, klinicznie podejrzanych o krztusiec, może być zakażonych kaszlem, podejrzanych w badaniu klinicznym o krztusiec oraz 258 próbek
pałeczkami B. parapertussis. krwiodawców.
Ponieważ jak dotychczas nie wykonuje się w Polsce badań laboratoryjnych Badania przeprowadzono na płytkach metapleksowych firmy Nunc
w kierunku parakrztuśca nie jest znana częstość jego występowania w oznaczając poziom przeciwciał klasy IgA, IgG i IgM. Do opłaszczenia
naszym kraju. Jest to o tyle istotne, że zarówno acelularne oraz płytek użyto oczyszczonego preparatu antygenu somatycznego
peÅ‚nokomórkowe szczepionki przeciwkrztuÅ›cowe nie zabezpieczajÄ… przed (endotoksyny) paÅ‚eczek B. parapertussis w stężeniu użytkowym 25 µg/ml.
zakażeniem pałeczkami B. parapertussis.
Przeprowadzone badania wykazały występowanie przeciwciał u ponad 12%
badanych osób dowodząc, że pałeczki parakrztuśca są istotnym czynnikiem
bakteryjnym powodującym zapalenie układu oddechowego u osób w Polsce.
12
Legioneloza Legioneloza
Badania laboratoryjne:
Jest to zakaz
na choroba wywoływana przez
Gram-ujemne pałeczki należące do rodzaju
1. Izolacja i hodowla drobnoustrojów z próbek materiału klinicznego
Legionella. Opisano ponad 18 gatunków i 37
serotypów chorobotwórczych dla człowieka, z
2. Badania genetyczne przy użyciu metody PCR
których najczęściej zakażenia wywołuje
L. pneumophila sg.1.
3. Badania serologiczne:
Wyróżnia się trzy postacie kliniczne:
- oznaczanie obecności antygenu w moczu metodą ELISA lub
immunochromatograficznÄ…
- postać płucną (typowa choroba legionistów)
- wykrywanie obecności bakterii w tkankach metodą bezpośredniej
- postać pozapłucna łagodna (gorączka Pontiac)
lub pośredniej immunofluorescencji
- postać pozapłucna ciężka
- oznaczanie stężenia swoistych przeciwciał w próbkach surowicy
Legioneloza
Legioneloza
Oznaczanie antygenu:
Poziom przeciwciał dla antygenów L. pneumophila oznacza się
najczęściej odczynem ELISA (np. firmy Euroimmun). Przeciwciała te
Około 80% chorych z zapaleniem płuc wywołanym przez
pojawiają się po upływie tygodnia od zachorowania i osiągają
L. pneumophila już od pierwszego dnia choroby przez okres
najwyższe stężenie w 3-4 tygodniu. Przeciwciała zanikają zazwyczaj
około 2-3 tygodni wydala z moczem swoisty antygen.
po 2-3 miesiącach, jednak niekiedy można je wykryć w próbce
Czułość i swoistość metody ELISA w poszukiwaniu
surowicy nawet po upływie 12-18 miesięcy.
antygenu wynosi ponad 95%.
W serodiagnostyce legionelozy można stosować również test
immunofluorescencji pośredniej (IFA, indirect fluorescent antibody).
Swoistość szybkich testów
Odczytu dokonuje się przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego.
immunochromatograficznych
jest bardzo wysoka natomiast
Ograniczenia w serodiagnostyce legionelozy dotyczą głównie
czułość niższa niż testu ELISA.
możliwości występowania reakcji krzyżowych w przypadku zakażeń
Testy te mogą być wykonane
bakteryjnych wywołanych przez Pseudomonas, Haemophilus, czy
w ciÄ…gu kilkunastu minut.
pałeczki Campylobacter.
Mykoplazmoza
Kliniczny obraz mykoplazmozy
Mykoplazmoza jest ostrÄ…, zakaz
ną chorobą dróg oddechowych,
M. pneumoniae wywołuje łagodne bezgorączkowe lub gorączkowe schorzenia
wywoływaną przez Mycoplasma pneumoniae. Patogen ten należy do grupy
górnych dróg oddechowych, śródmiąższowe lub odoskrzelowe zapalenie płuc
wolno żyjących drobnoustrojów całkowicie pozbawionych ściany
jak również objawy ze strony innych układów i narządów. Do najczęściej
komórkowej.
opisywanych chorób ze strony górnych dróg oddechowych w przebiegu
M. pneumoniae rośnie wyłącznie na specjalnie wzbogaconym podłożu
mykoplazmozy zaliczyć należy zapalenie gardła, krtani i tchawicy oraz ostre
zawierającym w swym składzie wyciąg mięsny, pepton, surowicę końską
zapalenie oskrzeli i oskrzelików.
oraz wyciąg ze świeżych drożdży piekarniczych. Na podłożu stałym
kolonie przybierajÄ… charakterystyczny wyglÄ…d  sadzonych jaj .
W przebiegu zakażenia układu oddechowego wywołanego przez M. pneumoniae
może dojść do powikłań w różnych narządach organizmu człowieka (zapalenia
opon mózgowo-rdzeniowych, zapalenia mózgu, zapaleń wielonerwowych,
zapalenia trzustki i wątroby, zapalenie mięśnia serca i osierdzia, zapalenie
stawów, zmiany skórne w postaci rumienia wielopostaciowego, wysiękowego,
guzowatego oraz zespołu Stevens  Johnsona).
13
Epidemiologia mykoplazmozy
Epidemiologia mykoplazmozy
40
35
Zakażenia wywoływane przez M. pneumoniae odznaczają się dwiema 30
znamiennymi cechami: 25
20
" częstym występowaniem ognisk epidemicznych w zamkniętych
15
środowiskach, w których dzieci i młodzież pozostają w długotrwałym i
10
bliskim kontakcie (np. internaty szkolne i akademickie)
5
0
" wyraz
ną tendencją do występowania fal epidemicznych co 4-7 lat,
1970 1975 1980 1985 1990 1995 2000 2005 2010
których szczyty przypadają na okres jesieni i zimy
Odsetek osób z serologicznie potwierdzonym zakażeniem wywołanym przez
M. pneumoniae w latach 1970-2010 w Polsce
S.Kałużewski, W. Rastawicki. Med Dośw Mikrobiol 2011; 63: 241-254
Immunologiczna odpowiedz
na zakażenia M. pneumoniae Immunologiczna odpowiedz
na zakażenia M. pneumoniae
W przebiegu zakażenia wywołanego M. pneumoniae u chorych
pojawiają się swoiste przeciwciała klasy IgM, IgG i IgA oraz w
wydzielinie oskrzeli  przeciwciała klasy IgA.
Specyficzne przeciwciała klasy IgA i IgM pojawiają się w surowicy osób
chorych na mykoplazmowe zapalenie płuc jako pierwsze, już około 7 dnia
Równolegle ze swoistymi przeciwciałami we krwi u 35-80% osób,
choroby i osiągają najwyższy poziom pomiędzy 10 i 30 dniem choroby.
głównie dzieci i młodzieży, narasta miano tzw. nieswoistych
makroglobulin (IgM) wykrywanych jako: zimne aglutyniny, aglutyniny
Przeciwciała klasy IgG pojawiają się dopiero w drugim tygodniu choroby,
dla paciorkowca MG, przeciwciała przeciw lipidom tkankowym,
osiągając wysoki poziom w czwartym tygodniu od początku objawów
komórkom mięśni gładkich itd.
klinicznych. Stwierdzono, że wysoki poziom przeciwciał klasy IgG może
utrzymywać się w surowicy ozdrowieńców przez wiele miesięcy i z tego
W przebiegu zakażenia wywołanego przez M. pneumoniae odpowiedz

powodu nie może być on wyznacznikiem ostrej fazy choroby.
humoralna człowieka na antygeny mykoplazmowe zależy od wieku
badanych osób. U ludzi młodych w wieku do 20 lat obserwuje się przede
wszystkim znaczny wzrost przeciwciał klasy IgM natomiast u ludzi
starszych z reguły obserwuje się przyrost miana przeciwciał w klasie IgA
i IgG, przy stosunkowo niższym wzroście w klasie IgM.
Laboratoryjna diagnostyka mykoplazmozy
Laboratoryjna diagnostyka mykoplazmozy
W serodiagnostyce mykoplazmozy przez wiele lat stosowany był odczyn
1. Metody hodowlane  wymaga użycia specjalistycznych pożywek. Niska
wiązania dopełniacza (OWD) z antygenem komórkowym oraz odczyn
czułość oraz bardzo długi okres inkubacji.
immunoelektroprecypitacji w żelu agarozowym (OIEP).
2. Metody genetyczne
3. Metody serologiczne:
Diagnostycznie znamienny jest co najmniej 4-krotny przyrost poziomu
- odczyn immunofluorescencji
przeciwciał lub wykrycie ich przy jednorazowym badaniu w OWD w
- badanie poziomu zimnych aglutynin
mianie 60 lub wyższym oraz w OIEP powyżej 2.
- test hamowania metabolizmu
- odczyn hemaglutynacji biernej
Aktualnie w rutynowej serodiagnostyce mykoplazmozy najczęściej
- odczyn radioimmunoprecypitacji
wykorzystuje się odczyn immunoenzymatyczny ELISA, w którym jako
- odczyn immunoelektroprecypitacji
antygen wykorzystuje się swoiste białka M. pneumoniae pełniące funkcje
- odczyn wiązania dopełniacza
adhezyn: białko o masie 160-180 kDa, oznaczone symbolem P1, białko o
- odczyn immunoenzymatyczny ELISA
masie 119 kDa, białko 89-90 kDa oraz białko o masie 30-32 kDa.
- odczyn western-immunoblotting
- szybkie testy aglutynacyjne i chromatograficzne
.
14
Osetek wyników dodatnich
Laboratoryjna diagnostyka mykoplazmozy Laboratoryjna diagnostyka mykoplazmozy
W serodiagnostyce mykoplazmozy testem potwierdzenia jest odczyn
western-immunoblotting. Szczególnie istotne jest wykazanie w badanej
próbce surowicy obecności przeciwciał dla głównej adhezyny M.
W handlu dostępnych jest wiele
pneumoniae, białka P1.Białko to możemy uzyskać metodami inżynierii
komercyjnych zestawów
genetycznej.
western-blot, między innymi
firmy Virotech, w którym
producent zastosował aż 12
różnych antygenów, uzyskanych
zarówno metodami natywnymi
jak i rekombinacjÄ… genetycznÄ….
Test ten charakteryzuje się w porównaniu do PCR 92% czułością i 92,6-100%
białko P1
swoistością. (Dumke i wsp. Diagn Microbiol Infect Dis 2012,73:200-3)
Wpływ wielokrotnego, cyklicznego zamrażania i
Laboratoryjna diagnostyka mykoplazmozy
rozmrażania próbki surowicy na poziom przeciwciał klasy
IgA, IgG i IgM
W ostatnim czasie coraz większą
popularność zdobywają szybkie
120
Klasa IgA Klasa IgG Klasa IgM
testy aglutynacyjne czy też
110
chromatograficzne.
100
Testy te mogą być używane jedynie
90
we wstępnej diagnostyce a wyniki
dodatnie uzyskane przy ich użyciu
80
powinny być potwierdzane testem 1 2 3 4 5 6 7 8
Numer serii próbek surowicy uzyskanych od osób z mykoplazmozą
ELISA lub western-immunoblotting
Uzyskane wyniki wykazały, że nawet 30-krotne zamrożenie i rozmrożenie
próbki surowicy nie ma istotnego wpływu na poziom przeciwciał klasy IgA, IgG
i IgM dla antygenów bakteryjnych.
(Rastawicki i wsp. Med Dośw Mikrobiol 2012, 64: 79-85)
Czynnik reumatoidalny
Czynnik reumatoidalny
Obecny w surowicy osoby badanej czynnik RF może reagować z
mykoplazmowymi przeciwciałami klasy IgG związanymi na płytce z antygenem
M. pneumoniae.
Czynnik reumatoidalny (rheumatoid factor, RF) jest to autoprzeciwciało
skierowane przeciwko domenom CH2 i CH3 regionu Fc immunoglobuliny
W takim przypadku w może dojść do fałszywie dodatnich wyników w klasie IgM
klasy G.
(koniugat będzie łączył się z czynnikiem RF i dawał reakcje barwne nawet przy
całkowitym braku swoistych mykoplazmowych przeciwciał klasy IgM)
Najczęściej (85%) występuje w klasie IgM, ale może też występować jako
przeciwciało w klasie IgG, IgA lub IgE, jednak RF w innych klasach niż
Ponadto istnieje możliwość zastąpienia przeciwciał IgM, słabo wiążących się z
IgM nie ma znaczenia diagnostycznego.
antygenem, przez silniej wiążące przeciwciała IgG skutkujące wynikami
fałszywie ujemnymi w klasie IgM.
RF występuje u około 80% pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem
stawów, a także w przypadku innych chorób reumatycznych.
W celu uniknięcia tych nieswoistych reakcji w przypadku oznaczania przeciwciał
klasy IgM, powinno się wstępnie absorbować czynnik reumatoidalny oraz
przeciwciała klasy IgG z surowicy osoby badanej.
15
Indeks przeciwciał