MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI ĆWICZENIA 1
Sterylizacja i dezynfekcja to nie sÄ… synonimy!
Sterylizacja  całkowite usunięcie drobnoustrojów łącznie z formami przetrwalnikowymi.
Dezynfekcja  zniszczenie form wegetatywnych drobnoustrojów chorobotwórczych lub psujących
żywność, nie musi niszczyć przetrwalników.
Pasteryzacja  dziaÅ‚anie na drobnoustroje temperaturÄ… poniżej 100ÚC.
Sterylizacja - dziaÅ‚anie na drobnoustroje temperaturÄ… powyżej 100ÚC.
Upperyzacja  w przypadku mleka, momentalne ogrzanie mleka do temperatury 135-150ÚC i
natychmiastowym jego ochłodzeniu.
podstawowa aparatura mikrobiologiczna
Urządzenia do jałowienia w wysokiej temperaturze:
- autoklaw:
" metalowy kocioł
" podwójne ściany, podwójne dno, szczelna pokrywa, docisk na śruby
" system grzewczy (elektryczny lub gazowy)
" przyrzÄ…dy kontrolne (manometry, termometry, wodowskazy)
" zawór bezpieczeństwa
" kurek odpowietrzajÄ…cy
" czynnik jałowiący  przegrzana para wodna pod zwiększonym ciśnieniem
" etapy sterylizacji: 1. nagrzewanie
2. sterylizacja właściwa temperatura na stałym poziomie
3. chłodzenie do temperatury otoczenia
" parametry: temperatura: 110-121ÚC
czas: 15  60 minut (zależy od objętości pożywki)
" używanie autoklawu wymaga szczególnych zasad ostrożności
" do jałowienia pożywek, sprzęt itp.
- aparat Kocha:
" budowa prostsza niż autoklawu
" czynnik jaÅ‚owiÄ…cy  bieżąca para wodna o temp. 100ÚC
" do sterylizacji pożywek, które nie mogą być sterylizowane w wyższej temp.
" czas sterylizacji: 15  60 minut (zależy od objętości i rodzaju materiału)
" w takich warunkach ginÄ… jedynie formy wegetatywne
" do caÅ‚kowitej sterylizacji stosuje siÄ™ tyndalizacjÄ™ (3-krotne ogrzewanie w 100ÚC)
- suszarki:
" do prac analitycznych, do jałowienia szkła laboratoryjnego
" czynnik jałowiący suche, gorące powietrze
" dla lepszych efektów temperatura: 160  170ÚC przez 1-2 h
" swobodny obieg powietrza
1
urządzenia do hodowli drobnoustrojów
- termostat (cieplarka):
" urządzenia do hodowli drobnoustrojów na pożywkach
" utrzymują stałą, określoną temperaturę wewnątrz komór
" optymalna temperatura
bakterie i promieniowce  32ÚC
drożdże i grzyby - 28ÚC
- wytrzÄ…sarki:
" do hodowli wgłębnej drobnoustrojów w warunkach tlenowych
" do hodowli dynamicznej
" posiadają regulowane drgania, mogą być połączone z łaz
niÄ… wodnÄ…
" vortexy do pojedynczych prób
- Å‚az
nie wodne:
" do hodowli w probówkach lub kolbkach, krótkotrwałe hodowle
" łatwiej osiągnąć wymagana temperaturę
- anaerostaty:
" do hodowli w warunkach beztlenowych
" próżnia lub atmosfera gazów obojętnych (N2, CO2), lub stosując odpowiednie substancje
pochłaniające tlen
- wirówki:
" różne typy, wielkość, regulowane obroty, praca okresowa lub ciągła
" do oddzielania komórek mikroorganizmów od pożywki płynnej
" 3000  4000 obrotów
- szafy chłodnicze i zamrażarki:
" do przechowywania kultur komórkowych, jałowych podłoży, roztworów witamin itp. w
warunkach chłodniczych
- szafy laminarne:
" umożliwiają zachowanie jałowości, przeprowadzanie różnych prac mikrobiologiczncyh bez
użycia palnika
" wyposażone w filtr bakteriologiczny, nawiew powietrza
- urządzenia do rozdrabiania prób:
" homogenizatory, stomacher, młynki, rozdrabniacze
3. Ogólne zasady mycia oraz jałowienia szkła, sprzętu, podłoży i powierzchni.
Szkło laboratoryjne powinno być czyste w sensie chemicznym i mikrobiologicznym.
Szkło nowe nie używane  wykazuje często odczyn alkaliczny  gotowanie 15-30 min. w 1% HCl,
płukanie, gotowanie 30 min. w 1% Na2CO3, płukanie w bieżącej, destylowanej wodzie.
Szkło używane  autoklawowanie, usunięcie hodowli, mycie pod bieżącą wodą z detergentem,
płukanie w wodzie bieżącej i destylowanej, suszenie w suszarce lub powietrzu.
Szkło bardzo zabrudzone i pipety w chromiance.
Sprzęt plastikowy  woda z detergentem.
Szkło umyte i wysuszone, owinięte w papier jałowi się w suszarce.
2
Szalki Petriego, pipety dodatkowo zabezpieczone korkami z waty w ustnikach, grupuje siÄ™ do
jałowienia w metalowych tubusach.
Sterylizacja w suszarkach 2-4 godzin, 160ÚC.
Ezy i igły przed użyciem wyjaławia się w płomieniu palnika gazowego.
Pożywki wyjaławia się w autoklawie lub w parze bieżącej w aparacie Kocha, lub przez sączenie.
Pasteryzacja dotyczy środków żywnościowych (mleko, piwo, moszcz owocowy)
Pomieszczenia wyjaławia się promieniami UV, filtrami bakteriologicznymi.
4. Mikroskop, budowa i technika mikroskopowania.
BUDOWA MIKROSKOPU ÅšWIETLNEGO
a) części mechaniczne:
- podstawa (zawiera oświetlacz)
- statyw
- tubus
- stolik mikroskopowy
- śruba makrometryczna  zakres przesuwu kilkadziesiąt mm, pełny obrót śruby przesuwa układ
o 18 mm
- śruba mikrometryczna  zakres przesuwu 2 mm, skok 0,1 mm
- pokrętła śrub
b) części optyczne:
- aparat oświetlający (zwany aparatem Abbego)  kondensor i przysłona irysowa (diafragma),
kondensor zbudowany jest z 2-3 soczewek silnie skupiających światło na preparacie, a w
konsekwencji na soczewce czołowej obiektywu
przesłona irysowa reguluje ilość światła wpadającego do kondensora
- oświetlenie aparatu
- obiektywy:
" jest ich zwykle od 3 do 5, umieszczone sÄ… w tzw. rewolwerze
" powiększenia: 5, 10, 20, 40, 60, 100 razy (opisane na obudowie)
" zbudowany jest z kilku lub kilkunastu soczewek skupiajÄ…cych sklejonych balsamem kandyjskim,
umieszczonych w metalowej oprawce, najbliższa preparatu to soczewka czołowa
" obiektywy suche (powietrzne) i zanurzeniowe (immersyjne)
obiektywy suche (5-60 razy)  duże mikroorganizmy (algi, grzyby i pierwotniaki)
obiektywy zanurzeniowe (100 razy)  barwione preparaty bakteryjne i inne obiekty
wymagające dużego powiększenia
zasada działania
- obiektyw suchy  promienie trafiają do ośrodka optycznie rzadszego (powietrza) ulegają w nim
załamaniu oraz odbiciu i nie wszystkie trafiają do soczewki czołowej obiektywu
- obiektyw immersyjny  przestrzeń robocza pomiędzy preparatem a soczewka czołową
wypełnia płyn immersyjny (olejek cedrowy, rycynowy), o współczynniku załamania światła
zbliżonym do szkła, promienie świetlne przechodząc przez preparat trafiają na ośrodek
optycznie jednorodny, nie następuje zatem zjawisko rozproszenia światła, wszystkie promienie
świetlne dochodzą do obiektywu
- okulary
" zbudowane są z soczewek płasko-wypukłych i powiększają na zasadzie lupy
" mają powiększenia od 2 do 30 razy
" soczewka bliżej oka to soczewka oczna, ta bliżej obserwowanego przedmiotu to soczewka
polowa
" stosuje siÄ™ okulary Huygensa i Ramsdena)
" mikroskopy binokularne (dwa okulary) i monokularne (jeden okular)
3
" może być dodatkowa soczewka należy o niej pamiętać przy obliczaniu powiększenia
mikroskopu)
Zasada działania mikroskopu
- promienie świetlne (lusterko lub z
ródła światła sztucznego) zostają skierowane ze z
ródła
światła poprzez aparat Abbego na preparat
- wiązka światła z aparatu Abbego przechodzi najpierw przez otwór przysłony irysowej, a
następnie zostaje skupiona w soczewkach kondensora
- z kondensora światło przechodzi przez otwór w stoliku na preparat, przy tym przejściu część
promieni ulega ugięciu na preparacie, a część przechodzi nie zmieniona dalej do ośrodka
znajdującego się między preparatem a soczewką czołową obiektywu
- promienie ugięte na preparacie i promienie oświetlenia tła trafiają do obiektywu  powstaje
pierwsze powiększenie przedmiotu (obraz rzeczywisty, powiększony i odwrócony)
- z obiektywu obraz trafia do okularu, otrzymujemy obraz powiększony, prosty i pozorny
Parametry charakteryzujÄ…ce mikroskop:
- powiększenie mikroskopu  iloczyn powiększenia obiektywu i okularu, liczby oznaczające
powiększenie wyryte są na wymienionych elementach
- zdolność rozdzielcza mikroskopu określa, jak blisko siebie mogą leżeć dwa punkty, aby
patrząc na nie przez mikroskop można je było widzieć jako punkty oddzielne, zależy ona
wyłącznie od obiektywu
D = /2AN
D  najmniejsza odległość między punktami
  długość fali światła
AN  apertura numeryczna obiektywu
apertura numeryczna  określa zdolność układu optycznego do przyjmowania światła
AN = n · sinÄ…
n  współczynnik załamania światła środowiska między preparatem a obiektywem
ą  kąt aperturowy utworzony przez skrajny promień wchodzący do soczewki czołowej
obiektywu a jego osiÄ… optycznÄ…
" im krótsza jest fala światła i im większą aperturę liczbową posiada obiektyw, tym większa jest
zdolność rozdzielcza mikroskopu
" apertura numeryczna dla obiektywów suchych  poniżej 1,0
" apertura numeryczna dla obiektywu immersyjnego - powyżej 1,0 (1,2-1,6)
" zdolność rozdzielcza dla obiektywu immersyjnego  0,2 µm (dÅ‚. fali 0.55 µm)
" zdolność rozdzielcza dla mikroskopu optycznego  0,2 µm
- odległość robocza  odległość pomiędzy soczewką czołową obiektywu a preparatem w
momencie prawidłowego ustawienia ostrości obrazu, w miarę zwiększania powiększenia
odległość robocza maleje
- przestrzeń robocza  przestrzeń pomiędzy soczewką czołową obiektywu a preparatem w
chwili najlepszego widzenia
4
Zasady pracy z mikroskopem
- zapoznać się z budową i zasadą działania mikroskopu
- mikroskop w odległości 15-20 cm od skraju stołu
- w osi optycznej obiektyw o najmniejszym powiększeniu, odległość 2-3 cm od stolika
- przesłona irysowa całkowicie otworzona i włączone oświetlenie
- na stolik położyć preparat w zaciskach
- zbliżyć maksymalnie stolik do soczewki czołowej obiektywu (patrząc z boku), śrubą
makrometryczną ustawić kontur badanego preparatu, i jego obraz
- ostrość ustawić delikatnie za pomocą śruby mikrometrycznej
- przeglądać preparat, zmieniając obiektywy od najmniejszego do największego powiększenia,
ale przy każdej zmianie obiektywu oddalić najpierw obiektyw od preparatu i powtarzać
wszystkie czynności j/w
- preparat w immersji  obiektyw immersyjny w osi optycznej max podniesiony do góry, na
preparat nanieść kroplę olejku immersyjnego, patrząc z boku opuszczać obiektyw aż do
momentu zanurzenia soczewki czołowej w olejku, skorygować światło  aparat Abbego bardzo
blisko stolika, za pomocą śruby makro póz
niej mikro szukać obrazu preparatu, obiektyw cały
czas w olejku
- zasady porządkowe: nie pozostawiać resztek cieczy na soczewkach i stoliku
przykrywać mikroskop po skończonej pracy
soczewki czyścić specjalną szmatką
nic samowolnie nie wykręcać
olejek zetrzeć przy użyciu ściereczki i ksylenu.
Inne typy mikroskopów
Mikroskop do oglÄ…dania w ciemnym polu
- wykorzystano efekt Tyndalla  budując odpowiedni kondensor, który kieruje promienie światła
ukośnie do powierzchni szkiełka podstawowego, promienie odbijają się od tej powierzchni i
wracają do kondensora, a pole widzenia pozostaje ciemne; natomiast jeśli natrafia na obiekt
ulegają załamaniu lub ugięciu i wpadają do obiektywu)
- otrzymuje się jasny obraz obiektu na tle ciemnego pola, komórki wyglądają jakby same
emitowały światło
- do obserwacji żywych organizmów i ich ruchu, widać w nim nawet duże wirusy
niedostrzegalne w zwykłym świetlnym mikroskopie
Mikroskop do oglÄ…dania w ultrafiolecie
- fale światła UV są krótsze (180-400 nm)
- do oglÄ…dania komórek o wielkoÅ›ci 0,1 µm (w Å›wietlnym o Å›rednicy nie mniejszej niż 0,2 µm)
- soczewki wykonane z kwarcu, który przepuszcza promienie UV
- obrazy otrzymuje siÄ™ na kliszy fotograficznej lub ekranie TV
Mikroskop fluorescencyjny
- zwiÄ…zki fluorescencyjne (fluorochromy)  zwiÄ…zki chemiczne absorbujÄ…ce energiÄ™ fal UV i
emitujące jako fale widzialne większej długości, mogą mieć określone zabarwienie w świetle
widzialnym
- nasycenie związkami fluorescencyjnymi mikroorganizmów spowoduje, że staną się one
widoczne w oświetleniu UV
- do wykrywania prątków gruz
licy czy różnicowania żywych i martwych komórek
Mikroskop kontrastowo-fazowy
- do badania żywych komórek dzięki zastosowaniu kontrastu fazowego bez konieczności
barwienia komórek
5
- specjalnie skonstruowany kondensor i obiektyw
- zasada dziaÅ‚ania: przesuniÄ™cie fali Å›wiatÅ‚a o 180Ú miÄ™dzy promieniami przechodzÄ…cymi przez
obserwowany przedmiot a ugiętymi na preparacie, co zwiększa różnicę faz promieni
świetlnych, które zostają przekształcone w różnice amplitudy
- dzięki takiemu stworzeniu kontrastu możliwe jest rozróżnienie szczegółów budowy obiektów
różniących się minimalnie grubością lub współczynnikiem załamania światła
Mikroskop konfokalny
- można uzyskać czytelny obraz struktur wnętrza całych nieskrojonych komórek podbarwionych
barwnikami fluorescencyjnymi
- stosuje się do zwykłego mikroskopu świetlnego przystawkę laserową
- światło laserowe oświetla preparat od strony okularu i skanuje pole widzenia, obraz jest
oświetlany punkt po punkcie wyłącznie w płaszczyz
nie ostrości obrazu
- stosowany do badań cytologicznych
Mikroskop elektronowy
- rolę światła odgrywają wiązki elektronów o bardzo małej długości fali biegnących w wysokiej
próżni
- rolę soczewek spełniają soczewki elektrostatyczne lub elektromagnetyczne
- brak preparatów na szkiełkach podstawowych, są za to cienkie błony sporządzane z preparatów
za pomocą ultramikrotomu o grubości kilkuset nm, inne techniki przygotowywania preparatów
do tego mikroskopu to cieniowanie metalem lub barwienie negatywne
- możliwość obserwacji organizmów mniejszych od bakterii, wirusów i struktur wewnątrz
komórkowych
- wada  tylko preparaty martwe, specjalnie utrwalane w próżni co może powodować
uszkodzenia struktur i powstawanie artefaktów
Mikroskop skaningowy
- w tym mikroskopie wiązka elektronów przeczesuje powierzchnię preparatu i ulega odbiciu
- na monitorze jesteśmy w stanie zobaczyć jak wygląda powierzchnia badanego obiektu.
Dodatkowe informacje
- mikroskop optyczny
Najlepsze mikroskopy optyczne, działające na spolaryzowane światło ultrafioletowe osiągają
maksymalne powiększenie do ok. 3500x. Mikroskopy działające na zwykłe światło osiągają
maksymalne powiększenia rzędu 1500x.
- mikroskop elektronowy
Mikroskop elektronowy pozwala uzyskać powiększenia 250 000 razy. Powiększenie sięgające 5
mln razy można uzyskać w podobnych konstrukcjach, przy zastąpieniu elektronów wiązką jonów
(mikroskop jonowy), w szczególności jonów wodoru, czyli protonów (mikroskop protonowy).
Istnieją mikroskopy rentgenowskie, w których próbka oświetlana jest zogniskowaną wiązką
niskoenergetycznego promieniowania rentgenowskiego.
6