Wydzia Chemiczny Politechniki Gda skiej
Katedra Technologii Leków i Biochemii
Kultury tkankowe i komórkowe ro lin i zwierz t
IZOLACJA DNA Z KOMÓREK ZWIERZ CYCH
Wst p
Izolacja i oczyszczanie DNA jest kluczowym etapem wi kszo ci
procedur stosowanych w biologii molekularnej, diagnostyce i innych
badaniach. G ównym celem tego etapu jest uzyskanie wysokiej jako ci i
czysto ci materia u biologicznego, niezale nie od ród a jego pochodzenia.
Aktualnie dysponujemy bardzo zró nicowanymi i licznymi metodami
otrzymywania kwasów nukleinowych, od z o onych, wieloetapowych
procedur, wykorzystuj cych rozpuszczalniki organiczne do szybszych,
prostszych i bezpieczniejszych. Wybór odpowiedniej metody izolacji zale y
od rodzaju badanego kwasu nukleinowego jaki chcemy uzyska (DNA
genomowe, mitochondrialne, plazmidowe, RNA itd.), pochodzenia (ro linne,
zwierz ce, bakteryjne, wirusowe itd.), rodzaju materia u z jakiego
przeprowadzamy izolacj (z tkanek, organu, hodowli komórkowej itd.),
oczekiwanych rezultatów (czysto , jako , czas izolacji itd.) i przeznaczenia
(PCR, klonowanie, blotting, synteza cDNA itd.).
Ogólne zasady izolacji DNA
Znanych jest wiele procedur izolacji DNA, w wyniku których otrzymuje
si DNA biologicznie aktywny, chemicznie stabilny oraz wolny od RNA i
bia ek. Jednak e ze wzgl du na wielko i wra liwo chromosomalnego DNA
praktycznie niemo liwa jest jego izolacja w formie niezmienionej. Cz
DNA ulega mechanicznym uszkodzeniom.
Opracowanie procedury izolacji DNA wymaga szerokiej wiedzy na temat jego
chemicznej stabilno ci i warunków w jakich znajduje si w swoim naturalnym rodowisku
(komórka). Czynniki eksperymentalne, które musz by wzi te pod uwag i ich wp yw na
ró ne aspekty strukturalne natywnego DNA s zestawione w tabeli 1.
Tabela. 1 Parametry warunkuj ce zachowanie natywnej struktury DNA podczas izolacji
Lp. Czynniki Wp yw na struktur DNA
1. pH wi zania wodorowe pomi dzy komplementarnymi
a cuchami s stabilne w rodowisku o pH = 4 ÷ 10,
wi zania fosfodiestrowe w szkielecie DNA s trwa e w
zakresie pH = 3 ÷ 12,
wi zania N-glikozydowe z zasadami purynowymi
(adenin i guanin ) ulegaj hydrolizie przy pH < 3;
2. temperatura istniej znaczne ró nice w stabilno ci termicznej
wi za wodorowych w podwójnej spirali, ale
wi kszo DNA ulega rozpleceniu w temperaturze 80 ÷
1
Lp. Czynniki Wp yw na struktur DNA
90 °C,
wi zania N-glikozydowe i fosfodiestrowe s trwa e do
100 °C;
3. si a jonowa DNA jest bardziej trwa y i rozpuszczalny w
roztworach soli; w st eniu soli mniejszym ni 0,1 M
os abiaj si wi zania wodorowe pomi dzy
komplementarnymi a cuchami;
4. warunki przed uwolnieniem DNA konieczne jest rozbicie ciany
komórkowe komórkowej (komórki grzybowe, bakteryjne i in.) i
liza b on komórkowych (komórki zwierz ce i in.);
atwo rozbicia ciany zale y od rodzaju organizmu,
w niektórych przypadkach konieczne jest intensywne
ucieranie lub dzia anie ultrad wi kami (komórki
dro d y, tytoniu), podczas gdy w innych (E. coli)
mo liwa jest enzymatyczna hydroliza ciany
komórkowej,
w komórce wyst puje kilka enzymów, które
hydrolizuj DNA; najistotniejszymi z nich s
deoksyrybonukleazy, które hydrolizuj wi zania
fosfodiestrowe,
natywny DNA wyst puje w komórkach w kompleksie z
bia kami (histony, helikazy, polimerazy i in.); bia ka
te musz by oddzielone podczas ekstrakcji;
5. odporno agodne manipulowanie nie zawsze jest mo liwe
mechaniczna podczas izolacji DNA; ucieranie, wytrz sanie,
DNA mieszanie i inne czynno ci mechaniczne mog
spowodowa rozszczepienie DNA, zwykle nie
powoduje to zniszczenia drugorz dowej struktury
DNA, ale zmniejsza d ugo cz steczki (fragmentacja).
Etapy izolacji DNA
Niezale nie od zastosowanej procedury wi kszo metod opiera si na
kilku podstawowych i niezmiennych etapach izolacji.
Tabela. 2 Etapy izolacji DNA
Lp. Etap Cel etapu i jego przeprowadzenie
1. wst pne przygotowanie oczyszczenie, homogenizacja, zawieszenie w
materia u biologicznego buforze
do izolacji DNA Materia em wyj ciowym do izolacji DNA mo e
by niemal ka dy materia biologiczny (tkanka,
organ, zawiesina komórkowa i in.). W
zale no ci od rodzaju, jak i pochodzenia
materia u, wst pne przygotowanie mo e
obejmowa oczyszczenie z ró nego rodzaju
zanieczyszcze zewn trznych, po ywki i
pozosta o ci innych komórek (przemywanie
buforami stabilizuj cymi), rozdrobnienie i
homogenizacj , a nast pnie zawieszanie
2
Lp. Etap Cel etapu i jego przeprowadzenie
jednolitej masy komórkowej w odpowiednim
buforze.
2. dezintegracja rozbicie ciany i b ony komórkowej
i liza komórek Dezintegracj komórek prowadzi si w
zale no ci od rodzaju komórek i tkanek, np.
poprzez homogenizacj (mi kkie tkanki
zwierz ce), sonifikacj (zawiesiny komórek),
rozcieranie (komórki ro linne, bakteryjne), liz
detergentami (komórki z hodowli komórkowej),
liz enzymatyczn (komórki bakteryjne,
dro d owe) i in.
uwolnienie DNA i innych komponentów
wewn trzkomórkowych do roztworu
Destrukcji b on zewn trznych towarzyszy
uwolnienie DNA oraz innych komponentów
wewn trzkomórkowych. St d bardzo istotne jest
zachowanie odpowiednich warunków, aby kwas
nukleinowy nie uleg uszkodzeniom.
Do rozpuszczenia DNA i lizy komórek s u y
roztwór soli, najcz ciej NaCl, zawieraj cy Tris
i EDTA. DNA b d c zwi zkiem jonowym jest
bardziej stabilny i rozpuszczalny w roztworze
soli ni w wodzie destylowanej. Tris ma za
zadanie utrzyma sta e pH roztworu (lekko
zasadowe). EDTA wi e jony metali Cd2 +, Mg2 +,
Mn2 +, które mog yby tworzy sole z anionowymi
grupami fosforanowymi DNA oraz hamuje
dzia anie deoksyrybonukleaz, które wymagaj
dla swojej aktywno ci obecno ci jonów Mg2 + lub
Mn2 +.
3. inaktywacja nukleaz zabezpieczenie DNA przed enzymami
komórkowych nukleolitycznymi
Uwalniaj cy si z komórki kwas nukleinowy jest
nara ony na dzia anie degraduj ce nukleaz 
enzymów katalizuj cych hydroliz 1- i 2-
niciowych kwasów nukleinowych (endo-, egzo-,
detoksy-, rybonukleazy i in.), przecinaj cych
wi zania fosfodiestrowe. Unieczynnienie ich
prowadzi si silnymi enzymami
proteolitycznymi (np. proteinaz K lub pronaz ).
4. oddzielenie kwasu dysocjacja kompleksów DNA-bia ko
nukleinowego od Celem zniesienia oddzia ywa jonowych pomi dzy
pozosta ych na adowanymi dodatnio histonami i innymi bia kami a
komponentów ujemnie na adowanym szkieletem DNA stosuje si
komórkowych ró nego rodzaju detergenty oraz sole. Z czego sól sodowa
siarczanu dodecylu (SDS) wi e si z bia kami i nadaje im
silnie anionowy charakter, a tak e dzia a jako czynnik
denaturuj cy deoksyrybonukleazy i inne bia ka. agodnie
alkaliczne rodowisko (pH = 8,0) zmniejsza
3
Lp. Etap Cel etapu i jego przeprowadzenie
oddzia ywania elektrostatyczne pomi dzy DNA a
zasadowymi histonami i polikationowymi aminami,
przyczynia si tak e do zmniejszenia aktywno ci nukleaz i
denaturacji innych bia ek. Za sole w wysokich st eniach
(NaCl, NaClO4 lub inn sól) zapewniaj ca kowit
dysocjacj kompleksów DNA-bia ko
i usuwaj zwi zane kationowe poliaminy;
oddzielenie DNA od innych rozpuszczalnych
komponentów komórkowych
Ca kowite odbia czanie roztworu, przed
wytr ceniem DNA, przeprowadza si poprzez
ekstrakcj rozpuszczalnikami organicznymi, np.
dzia aniem mieszanin fenolu (powoduje
denaturacj bia ek), chloroformu (powoduje
powierzchniow denaturacj bia ek i stabilizuje
granic fazow , gdzie koncentruje si bia ko) i
alkoholu izoamylowego (zapobiega parowaniu
chloroformu), a nast pnie odwirowanie.
5. zag szczenie uzyskanie roztworu DNA o po danej czysto ci i
preparatu DNA i g sto ci
usuni cie Po ekstrakcji kwasy nukleinowe znajduj si ,
zanieczyszcze przewa nie w du ym rozcie czeniu, w fazie
ma ocz steczkowych wodnej, zanieczyszczonej ma ocz steczkowymi
zwi zkami. Dodaj c rozpuszczalnik organiczny
(np. etanol lub izopropanol) zmniejsza si
polarno rodowiska, co powoduje
zmniejszenie rozpuszczalno ci DNA,
posiadaj cego struktur jonow i DNA tworzy
nitkowate osady, które mo na zebra poprzez
odwirowanie. RNA w obecno ci alkoholu
etylowego zwykle nie str ca si tak jak DNA i
wyst puje jedynie jako drobne zanieczyszczenie,
za przy precypitacji izopropanolem pozostaje
w roztworze. Efektywno wytr cania kwasów
nukleinowych zwi ksza si poprzez dodatek soli
(np. NaCl, CH3COOH, LiCl, MgCl, czy
CH3COONH4).
Po wytr ceniu i przemyciu 70 % etanolem, DNA
pozostawia si do wyschni cia i nast pnie
zawiesza w ma ej obj to ci buforu o niskiej sile
jonowej (np. bufor TE) lub w wodzie.
Materia y i sprz t
1. Komórki nowotworowe pochodzenia ludzkiego linii HCT-8 (komórki raka
jelita grubego), MOLT4 (komórki bia aczki) lub innego typu [5
mln]
2. Bufor lizuj cy, stosowany podczas izolacji ca kowitego DNA
komórkowego
4
(10 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 0,5 % SDS; pH 7,4) [1
mln]
3. Bufor TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA; pH 8,0) [120
µl]
4. Mieszanina chloroform-alkohol izoamylowy (24:1)
[1,2 mln]
5. Roztwór alkoholu etylowego (70 %) [1
ml]
6. Roztwór alkoholu etylowego (96 %) [1
ml]
7. Roztwór buforowany PBS (0,14 M NaCl, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4,
8,1 mM Na2HPO4; pH 7,2) [10
mln]
8. Roztwór NaCl (5 M); [50
µl]
9. Roztwór RNazyA (1 mg/ml) [25
µl]
10. Roztwór wodny proteinazy K (1 mg/ml) [120
µl]
1. Probówka wirówkowa 50 ml z korkiem [l]
2. Probówki typu Eppendorf 1,5 ml [6]
3. Pipety automatyczne; 5 ml, 1 ml, 0,1 ml, 0,02 ml
4. Tipsy do pipet automatycznych
5. Wytrz sarka typu wortex
6. SpeedVac, model 5301 firmy Eppendorf, Niemcy
7. Wirówka, typ 5417 R firmy Eppendorf, Niemcy
8. a nia wodna lub termoblok
Wykonanie wiczenia
Praca w grupach 3  4-osobowych
Czas trwania wiczenia: 3 godziny
Osad komórek nowotworowych w ilo ci 5 milionów, uwolniony od
po ywki i
2-krotnie przemyty buforem PBS, zawiesi w 100 l sterylnego
roztworu TE i przenie powsta zawiesin do 2 probówek eppendorfa
o obj to ci 1,5 ml;
Do ka dej próbówki doda po 0,5 ml buforu lizuj cego oraz 12 l
roztworu RNazy A o st eniu 1 mg/ml, a nast pnie inkubowa przez 1
godzin w 37 C;
Do lizatu doda 60 l roztworu proteinazy K o st eniu 1 mg/ml i
równie inkubowa co najmniej przez 1 godzin w 50 C;
Po inkubacji roztwór rozcie czy wod do 600 l i doda równ
obj to mieszaniny chloroform-alkohol izoamylowy (600 l) i ca o
miesza a do powstania emulsji
(5 minut na worteksie). Uzyskan mieszanin rozdzieli przez
wirowanie
(14000 RPM/25 C/10 min);
5
 Faz wodn (500 l) przenie do nowej probówki i doda równ
obj to mieszaniny chloroform-alkohol izoamylowy, 5 minut
wytrz sa i wirowa jw.;
Do uzyskanej fazy wodnej (400 l) doda roztworu NaCl, do st enia
ko cowego
0,3 M (24 l), dwie obj to ci zimnego 96 % EtOH (900 l) i prowadzi
wytr canie poprzez kilkukrotne obrócenie probówki do momentu
pojawienia si nitek DNA;
Wytr cony DNA zwirowa (14000 RPM/4 C/10 min). Supernatant
odrzuci i osad przep uka 1 ml 70 % EtOH i powtórzy wirowanie;
Tak uzyskany osad osuszy za pomoc SpeedVac w 30 C przez 5
minut, a nast pnie zawiesi w 10 l buforu TE, wymiesza , pozostawi
w lodówce do nast pnego dnia i po czy oba roztwory wyizolowanego
DNA. Probówk z roztworem DNA przechowywa w zamra alniku.
Opracowanie wyników
1) Zapisa wszystkie obserwacje dotycz ce procedury oczyszczania.
Wyja ni jakiego rodzaju b dy mog y zosta pope nione i jakiego typu
zanieczyszcze preparatu DNA mo na si spodziewa .
2) Zaproponowa inne metody izolacji DNA z uwzgl dnieniem rodzaju
materia u biologicznego i omówieniem zasady izolacji.
Literatura uzupe niaj ca
[1] Brown T. A.: Genomy, Warszawa: PWN 2001;
[2] Bryszewska M., Leyko W.: Biofizyka kwasów nukleinowych dla biologów,
Warszawa: PWN 2000;
[3] K yszejko-Stefanowicz L.: wiczenia z biochemii, Warszawa: PWN 1999;
[4] Stryer L.: Biochemia, Warszawa: PWN 2000.
6