Ćwiczenie 1: Biotechnologia żywności
Temat: Izolacja, oczyszczanie oraz detekcja genomowego DNA w żywności.
Cześć A
Izolacja i oczyszczanie kwasów nukleinowych jest pierwszym etapem większości procedur
stosowanych w biologii molekularnej, jak też we wszystkich technikach inżynierii genetycznej.
Podstawowym celem tego etapu prac jest uzyskanie czystego materiału, bez względu na z
ródło
jego pochodzenia, z przeznaczeniem na przeprowadzenie specyficznych analiz metodÄ…
łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR), w celu wykrycia genetycznych modyfikacji (GM).
Jakość i czystość kwasów nukleinowych jest czynnikiem silnie wpływającym na wynik reakcji
PCR. Aby ograniczyć obecność inhibitorów reakcji PCR, należy użyć właściwą metodę izolacji
kwasów nukleinowych.
Istnieje wiele technik izolacji i oczyszczania kwasów nukleinowych. Wybór najwłaściwszej i
najbardziej odpowiedniej metody dla konkretnych wymagań zależy od:
" Analizowanego kwasu nukleinowego
" Organizmu z jakiego przeprowadzamy izolacjÄ™ kwasu nukleinowego
" Rodzaju materiału z jakiego przeprowadzamy izolację (rodzaj tkanki, organ, stopień
przetworzenia, itd.)
" Oczekiwanych rezultatów (plon, czystość, czas przeznaczony na oczyszczanie)
" Docelowego przeznaczenia materiału (PCR, klonowanie, znakowanie, blotowanie, Real Time-
PCR, synteza cDNA)
Izolacja kwasów nukleinowych z materiału biologicznego wymaga, przeprowadzenia lizy
komórek, inaktywacji komórkowych nukleaz oraz oddzielenia izolowanego kwasu
nukleinowego od pozostałości komórkowych. Typowe procedury lizy komórkowej składają się
z etapów zawierających:
" Mechaniczne uszkodzenia (np. ucieranie, liza hipotoniczna)
" Traktowanie chemiczne (np. liza detergentem, sole chaotropowe, redukcja tiolowa)
" Trawienie enzymatyczne (np. proteinaza K)
Procedura wykorzystywana na ćwiczeniach pozwala na szybką izolacje DNA ze świeżej i
przetworzonej żywności pochodzenia roślinnego, zwierzęcego i mieszanego. W trakcie izolacji
DNA próbka zostaje dokładnie rozdrobniona, a następnie pozostałości struktur tkankowych i
1
komórkowych są solubilizowane poprzez lizę w specjalnym buforze, który zapewnia
integralność i ilościowy odzysk DNA. Proteinaza K degraduje białka komórkowe, w tym białka
wiążące DNA i nukleazy. Dodanie specjalnego roztworu umożliwia precypitację organicznych i
nieorganicznych substancji, m.in.: białek, pozostałości komórkowych, inhibitorów
enzymatycznych. Następnie DNA zawarte w lizacie jest wiązane do minikolumny w obecności
buforu zawierającego sole chaotropowe i etanolu. Zanieczyszczenia związane do złoża są
skutecznie usuwane w trakcie dwóch etapów płukania.
Oznaczanie ilości DNA metodą spektrofotometryczną
Ilość DNA, RNA, oligonukleotydów, a nawet mononukleotydów może być mierzona
bezpośrednio w roztworze wodnym w formie rozcieńczonej lub nierozcieńczonej. Wykonuje się
to poprzez pomiar absorpcji w świetle ultrafioletowym Stężenie kwasów nukleinowych
mierzone jest poprzez porównanie pomiaru dla próby ślepej i adsorpcji przy długości fali 260
nm. Interferencja wynikająca z zanieczyszczeń próbki może być określana poprzez wyznaczenie
współczynnika A260/A280- Adsorpcja przy długości fali 280 nm jest typowa dla białek, tak
więc stosunek A260/A280 mówi o czystości analizowanej próbki. W przypadku czystego DNA
stosunek ten powinien wynosić około 1.8, podczas gdy dla czystego RNA wahać się powinien w
okolicach 2.0. Absorpcja przy długości fali 230 nm odzwierciedla zanieczyszczenia pochodzące
od węglowodanów, białek, fenoli, czy komponentów aromatycznych. W przypadku czystych
próbek stosunek A280/A230 powinien wynosić około 2,2.
Część praktyczna
Materiał badawczy: kukurydza, soja, pomidor, sos sojowy, płatki kukurydziane, ketchup,
pasztet sojowy.
Protokół
1. Dodać 40 µl buforu aktywacyjnego do minikolumny (nie wirować). Pozostawić w
temperaturze pokojowej do momentu naniesienia lizatu na minikolumnÄ™.
Uwaga 1: Dodanie buforu aktywacyjnego centralnie na powierzchniÄ™ membran zapewnia
kompletne nasączenie membran buforem aktywacyjnym i uzyskanie maksymalnej wydajności
wiÄ…zania DNA.
Uwaga 2: Aktywację należy wykonać przed rozpoczęciem procedury izolacji DNA.
2. Homogenizacja materiału.
2
Rozdrobnić fragment materiału badawczego ręcznie przy użyciu moz
dzierza. Następnie
przenieść (maksymalnie 300 mg) próbki do probówki typu Eppendorf i zawiesić w 750 µl
buforu do zawieszania próbki.
Uwaga 1: Procedura homogenizacji zależy od typu materiału. W niektórych przypadkach
homogenizacja nie jest potrzebna i wystarcza dokładne zawieszenie próbki w buforze do lizy
(np. mÄ…ka, pasztety, koncentraty, sosy, ketchup).
Uwaga 2: Zestaw pozwala na oczyszczenie DNA z maksymalnie 300 mg próbki. W przypadku
suchego, higroskopijnego materiału (np. mąka, płatki kukurydziane, rośliny suszone) należy
zmniejszyć wielkość próbki poniżej 100 mg, aby umożliwić kompletne zawieszenie próbki w
buforze do lizy.
Uwaga 3: W przypadku próbek płynnych (sos sojowy, mleko sojowe, itp.) umieścić 300 źl
próbki w probówce 2 ml typu Eppendorf.
3. Dodać 60 źl buforu litycznego i 10 źl Proteinazy K.
4. Wymieszać przez kilkukrotne odwrócenie probówki i inkubować 30 min w 65oC (podczas
inkubacji wymieszać dwukrotnie przez odwracanie).
5. Wirować przez 5 min z prędkością 14 000 rpm.
6. Przenieść 400 źl supernatantu do nowej probówki
Uwaga 1: W pewnych przypadkach materiał silnie chłonie bufor, co powoduje, że niemożliwe
jest wybranie znad osadu 400 µl supernatantu. Należy wówczas zmniejszyć wielkość
początkową próbki lub przenieść jak najwięcej supernatantu i dopełnić buforem do zawieszania
próbki do całkowitej objętości 400 źl.
7. Dodać 400 źl buforu precypitacyjnego. Worteksować przez 5 sekund i inkubować przez 5
min. w lodzie (0-4oC).
Uwaga 1: Bufor umożliwia precypitację organicznych i nieorganicznych substancji, m.in.:
białek, pozostałości komórkowych, inhibitorów enzymatycznych.
8. Wirować przez 1 min z prędkością 14000 rpm.
9. Przenieść 600 źl supernatantu do nowej probówki typu Eppendorf 2 ml
10. Dodać 600 źl buforu do solubilizacji.
11. Dodać 600 źl 96% etanolu i dokładnie wymieszać przez kilkukrotne odwrócenie probówki.
12. Zwirować przez kilka sekund z prędkością 12000 rpm.
13. Przenieść 600 źl supernatantu do minikolumny, znajdującej się w probówce odbierającej.
14. Wirować przez 30 sekund z prędkością 12 000 rpm.
15. Wyjąć minikolumnę, wylać przesącz i umieścić minikolumnę z powrotem w probówce
odbierajÄ…cej.
16. Powtórzyć kroki 13-15 procedury izolacji DNA.
3
17. Przenieść pozostałość supernatantu do minikolumny, znajdującej się w probówce
odbierajÄ…cej.
Wirować przez 1 min z prędkością 12 000 rpm celem przefiltrowania pozostałości lizatu przez
złoże.
Uwaga 1: W przypadku niecałkowitego przefiltrowania lizatu przez złoże wirowanie należy
kontynuować.
18. Wyjąć minikolumnę, wylać przesącz i umieścić minikolumnę z powrotem w probówce
odbierajÄ…cej.
19. Dodać 500 źl buforu płuczącego do minikolumny i wirować przez 1 min z prędkością 12
000 rpm.
20. Wyjąć minikolumnę, wylać przesącz i umieścić minikolumnę z powrotem w probówce
odbierajÄ…cej.
21. Dodać 500 źl buforu płuczącego do minikolumny i wirować przez 2 min z prędkością 12
000 rpm.
22. Minikolumnę umieścić w nowej probówce typu Eppendorf 1.5-2 ml. Dodać 50-100 źl
buforu elucyjnego (10 mM Tris-HCl, pH 8.5) ogrzanego do temperatury 70oC.
Uwaga 1: Dodanie buforu eluujÄ…cego centralnie na powierzchniÄ™ membrany zapewnia
uzyskanie maksymalnej wydajności odzysku DNA. Należy unikać dotykania ścianek
minikolumn mikropipetą, aby nie przenosić śladów DNA pomiędzy kolejnymi minikolumnami.
23. Minikolumnę pozostawić na 5 min w temperaturze pokojowej.
24. Wirować minikolumnę przez 30 sekund z prędkością 12 000 rpm. Usunąć minikolumnę,
zamknąć probówkę. DNA jest gotowe do dalszych analiz/manipulacji, może być
przechowywane w 2÷8oC lub zamrożone w -20oC.
Po izolacji zmierzyć stężenie uzyskanego izolatu DNA na aparacie NanoDrop®
(postępowanie przy pomiarze podobne jak w pkt B, wybieramy program do analizy kwasów
nukleinowych), określić jego czystość oraz ilość otrzymanego preparatu. Część próbki
wykorzystać do rozdziału elektroforetycznego DNA w celu oceny homogenności
uzyskanego preparatu kwasu nukleinowego.
Rozdział elektroforetyczny DNA
Bufor TAE 1 x stężony (roztwór roboczy)
Bufor o składzie: 40 mM Tris (pH 7,6), 20 mM kwas octowego, 1 mM EDTA
Żel agarozowy
4
Żel agarozowy sporządzano w stężeniu 1% dla rozdziału próbek po izolacji DNA. Odważyć 1,0
g agarozy do kolby stożkowej o pojemności 250 ml, zalać 100 ml buforu TAE 1x stężonego i
gotować w łaz
ni wodnej przez około 10 min do całkowitego rozpuszczenia agarozy. Po
ochłodzeniu wprowadzić 45 źl bromku etydyny.
Elektroforezę przeprowadzić w aparacie do elektroforezy poziomej (Cleaver Scientific Ltd.). Po
zmontowaniu foremki, wylać na nią wystudzony żel tak, aby uniknąć powstania pęcherzy
powietrza. Zamontować grzebień i pozostawić do zastygnięcia. Następnie grzebień usunąć,
foremkę z żelem umieścić w aparacie do elektroforezy i zalać buforem TAE 1 x stężonym.
Poziom buforu powinien sięgać nieco powyżej powierzchni żelu, około 1 cm. Do studzienek
wprowadzić za pomocą pipety próbki wraz z buforem obciążającym w ilości 3 źl buforu i 7 źl
próbki DNA. Na aparat nałożyć pokrywę i podłączyć elektrody. Rozdział prowadzić przy
napięciu 100 V, przez 45 min. Równolegle, w celu określenia wielkości fragmentów DNA,
rozdzielić marker mas molekularnych firmy FERMENTAS i/lub INVITROGEN. Po rozdziale
prążki są obserwowane przy użyciu transiluminatora. Żel może być sfotografowany w celu
uzyskania wyniku eksperymentu w formie obrazu (system do dokumentacji żeli Cleaver Sct.).
B. Oznaczanie zawartości kwasów nukleinowych oraz białka rozpuszczonego metodą
pomiaru absorbancji w nadfiolecie.
Zasada: Większość białek dzięki obecności tyrozyny i tryptofanu wykazuje maksimum
absorbancji przy 280 nm. Związkami wielkocząsteczkowymi, które mogą wpływać na wartość
absorbancji przy 280 nm są kwasy nukleinowe, których maksimum pochłaniania występuje przy
lð = 260 nm. Stężenie biaÅ‚ka w mg/ml oblicza siÄ™ ze wzoru:
C biaÅ‚ka = 1,55 ´ð A280 nm1 cm -ð 0,76 ´ð A260 nm1 cm
Metoda obarczona jest znacznym błędem wynikającym z tego, że zarówno różne białka, jak
i kwasy nukleinowe, w jednakowych stężeniach nie dają identycznych wartości absorbancji
maksymalnej. Poza tym wiele związków małocząsteczkowych (puryny, pirymidyny, fenole)
wykazuje dużą absorbancję przy 260 i 280 nm. Niemniej jednak metoda spektrofotometryczna
z uwagi na możliwość szybkiego oznaczenia białka w małej ilości materiału w obecności
dużych stężeń soli -(NH4)2SO4, NaCl -jest szeroko stosowana. Metoda nie nadaje się do
oznaczeń białka w mieszaninie zawierającej więcej niż 20% kwasów nukleinowych.
5
Postępowanie
Pomiary absorbancji w nadfiolecie zostaną wykonane przy użyciu spektrofotometru NanoDrop
1000, który nie wymaga stosowania kuwet i wykorzystuje bardzo niewielkie objętości próbki: 1
 2 źl. Na postument nałożyć 2 źl wody destylowanej i włączyć program  Protein A280 . W
menu programu wybrać typ próbki ( sample type ): BSA oraz wcisnąć przycisk  Blank aby
wyzerować przyrząd. Następnie zetrzeć bibułą wodę i umieścić 2 źl badanej próbki, wpisać jej
nazwę w polu  Sample ID i wcisnąć przycisk  Measure aby dokonać odczytu absorbancji.
Pomiar absorbancji próbki powtórzyć w programie  UV-Vis ustawiając dł. fali na 260 oraz 280
nm. Wiedząc, że ścieżka optyczna w aparacie NanoDrop ma długość 1 mm, obliczyć stężenie
białka w próbce.
Opracowanie wyników
Porównać wydajności izolacji DNA w badanych próbkach, skonfrontować je z oznaczeniami
białka na poszczególnych etapach oczyszczania kwasów nukleinowych. Przedyskutować wpływ
stopnia przetworzenia materiału na ilościowy uzysk DNA z próbki żywności.
Literatura:
1. Instrukcja do GeneMATRIX Food-Extract DNA Purification Kit (Blirt Gdańsk).
2. Nowak Z., Gruszyńska J., Wybrane Techniki i Metody Analizy DNA, Wydawnictwo SGGW, Warszawa
2007.
3. Polak J., Metody analizy żywności modyfikowanej genetycznie. Metody pomiarowe i kontroli jakości w
przemyśle spożywczym i biotechnologii, Wydawnictwo Akademii Rolniczej w Poznaniu, Poznań 2003,
413-431.
4. NanoDrop® Technologies, Inc., V3.5 User s Manual, 2007.
5. http://www.irmm.jrc.be.html.
6