IZOLACJA
CAA
KOWITEGO DNA
 Izolacja i oczyszczenie kwasów nukleinowyvh jest pierwszym
etapem większości procedur stosowanych w biologii
molekularnej.
Podstawowym celem tego etapu jest uzyskanie czystego
materiału . Stopień wymaganej czystości zależy od specyfyki
analizy do jakiej ma zostać przeznaczone wyizolowane DNA.
Jakość i czystość kwasów
nukleinowych jest czynnikiem
wpływającym na wynik reakcji
PCR. Aby ograniczyć ilość
inhibitorów reakcji PCR należy
wybrać właściwą metodę izolacji!
Inhibitor PCR Inhibujące stężenie
SDS >0,005%
Fenol >0,2%
Etanol >1%
Izopropanol >1%
Octan sodu >5mM
Chlorek sodu >25mM
EDTA >0,5mM
Mocznik >20mM
http://learn.genetics.utah.edu/units/biotech/extraction/
Wybór metody izolacji zależy od:
1. Rodzaju kwasu nukleinowego
2. Organizmu z jakiego prowadzimy izolacjÄ™
3. Rodzaj tkanki z jakiego prowadzimy izolacjÄ™
4. Typ organelli komórkowych
5. Docelowego przeznaczenia materiału 
wydajność i ilość
Izolacja z materiału biologicznego wymaga przeprowadzenia
lizy komórek, inaktywacji komórkowych nukleaz oraz
oddzielenia kwasu nukleinowego od pozostałości
komórkowych. Procedura izolacji jest kompromisem pomiędzy
metodą na tyle inwazyjną, by uszkodzić materiał z którego
izolujemy DNA i jednocześnie na tyle delikatną, by nie zniszczyć
materiału genetycznego.
Lp.
Czynniki Wpływ na strukturę DNA
1.
% wiązania wodorowe pomiędzy komplementarnymi niciami są
stabilne w środowisku o pH = 4 - 10,
% wiązania fosfodiestrowe w szkielecie DNA są trwałe w zakresie
pH
pH = 3 - 12,
% wiÄ…zania N-glikozydowe z zasadami purynowymi (adeninÄ… i
guaninÄ…) ulegajÄ… hydrolizie przy pH < 3;
2.
% istnieją znaczne różnice w stabilności termicznej wiązań
wodorowych w podwójnej spirali, ale większość DNA ulega
temperatura
rozpleceniu w temperaturze 80 - 90 °C,
% wiÄ…zania N-glikozydowe i fosfodiestrowe sÄ… trwaÅ‚e do 100 °C;
3.
% DNA jest bardziej trwały i rozpuszczalny w roztworach soli; w stężeniu soli mniejszym
siła jonowa
niż 0,1 M osłabiają się wiązania wodorowe pomiędzy komplementarnymi niciami;
4.
% przed uwolnieniem DNA konieczne jest rozbicie bakteryjnej
ściany komórkowej; łatwość rozbicia ściany zależy od rodzaju
drobnoustroju, w niektórych przypadkach konieczne jest
intensywne ucieranie lub działanie ultradz
więkami, podczas gdy
w innych (E. coli) możliwa jest enzymatyczna hydroliza ściany
warunki
komórkowej,
komórkowe
% w komórce występuje kilka enzymów, które hydrolizują DNA;
najistotniejszymi z nich są deoksyrybonukleazy, które hydrolizują
wiÄ…zania fosfodiestrowe,
% natywny DNA występuje w komórkach w kompleksie z białkami;
białka te muszą być oddzielone podczas ekstrakcji;
5.
% łagodne manipulowanie nie zawsze jest możliwe podczas izolacji DNA; ucieranie,
odporność
wytrząsanie, mieszanie i inne czynności mechaniczne mogą spowodować rozszczepienie
mechaniczna
DNA, zwykle nie powoduje to zniszczenia drugorzędowej struktury DNA, ale zmniejsza
DNA
długość cząsteczki (fragmentacja).
L.P Etap Cel etapu i jego przeprowadzenie
oczyszczenie, homogenizacja (fizyczne
1. Wstępne przygotowanie
zniszczenie struktury tkakowej oraz
materiału biologicznego
komórkowej), zawieszenie w buforze
do izolacji DNA 
Materiałem wyjściowym do izolacji DNA może być
zniszczenie struktury
niemal każdy materiał biologiczny (tkanka, organ, zawiesina
tkankowej i komórkowej
komórkowa i in.). W zależności od rodzaju, jak i
pochodzenia materiału, wstępne przygotowanie może
obejmować oczyszczenie z różnego rodzaju
zanieczyszczeń zewnętrznych, pożywki i pozostałości
innych komórek (przemywanie buforami stabilizującymi),
rozdrobnienie i homogenizację a następnie zawieszanie
jednolitej masy komórkowej w odpowiednim buforze
Øðrozbicie Å›ciany i bÅ‚ony komórkowej
Dezintegrację komórek prowadzi się w zależności od
rodzaju komórek i tkanek, np. poprzez homogenizację
(miękkie tkanki zwierzęce), sonifikację (zawiesiny komórek),
rozcieranie (komórki roślinne, bakteryjne), lizę detergentami
(komórki z hodowli komórkowej), lizę enzymatyczną
(komórki bakteryjne, drożdżowe) i in.
L.P Etap Cel etapu i jego przeprowadzenie
2. Uwolnienie DNA i DNA chroniony jest w komórce w różnych błonowych strukturach
innych komponentów subkomórkowych, np. jądro, mitochondria, chloroplasty a ponadto
wewnątrzkomórkowych występuje w kompleksach z różnymi białkami, np. z histonami.
do roztworu
W celu degradacji błon komórkowych i białek, do buforów ekstrakcyjnych
dodawane są różne detergenty, np. SDS, CTAB, izotiocjanian guanidyny.
Detergenty te umożliwiają również eliminacje enzymów nukleolitycznych
(endo-, exonukleazy), które po uwolnieniu ze struktur subkomórkowych
mogłyby zniszczyć DNA.
Destrukcji błon zewnętrznych towarzyszy uwolnienie DNA oraz
innych komponentów wewnątrzkomórkowych. Stąd bardzo istotne
jest zachowanie odpowiednich warunków, aby kwas nukleinowy nie
uległ uszkodzeniom.
Do rozpuszczenia DNA i lizy komórek służy roztwór soli,
najczęściej NaCl, zawierający Tris i EDTA. DNA będąc związkiem
jonowym jest bardziej stabilny i rozpuszczalny w roztworze soli niż w
wodzie destylowanej. Tris ma za zadanie utrzymać stałe pH roztworu
(lekko zasadowe). EDTA wiąże jony metali Cd2+, Mg2+, Mn2+, które
mogłyby tworzyć sole z anionowymi grupami fosforanowymi DNA
oraz hamuje działanie deoksyrybonukleaz, które wymagają dla swojej
aktywności obecności jonów Mg2+
L.P
Cel etapu i jego przeprowadzenie
Etap
Øðdysocjacja kompleksów DNA-biaÅ‚ko
Usunięcie
3.
zdegradowanych Celem zniesienia oddziaływań jonowych pomiędzy
naładowanymi dodatnio histonami i innymi białkami a ujemnie
elementów
naładowanym szkieletem DNA stosuje się różnego rodzaju
komórkowych.
detergenty oraz sole. Z czego sól sodowa siarczanu dodecylu
(SDS) wiąże się z białkami i nadaje im silnie anionowy charakter, a
także działa jako czynnik denaturujący deoksyrybonukleazy i inne
białka. A
agodnie alkaliczne środowisko (pH = 8,0) zmniejsza
oddziaływania elektrostatyczne pomiędzy DNA a zasadowymi
histonami i polikationowymi aminami, przyczynia się także do
zmniejszenia aktywności nukleaz i denaturacji innych białek. Zaś
sole w wysokich stężeniach (NaCl, NaClO4 lub inną sól) zapewniają
całkowitą dysocjację kompleksów DNA-białko i usuwają związane
kationowe poliaminy;
Øðoddzielenie DNA od innych rozpuszczalnych komponentów
komórkowych
Do usuwania białek stosujemy trawienie proteinazą K, oraz ekstrakcję fenolem i
chloroformem. Lipidy usuwamy dzięki ekstrakcji chloroformem. Ekstrakcję
chloroformem wykonujemy przeważnie bezpośrednio po ekstrakcji fenolem, gdyż
chloroform oprócz lipidów i białek usuwa z fazy wodnej również resztki fenolu.
Polisacharydy usuwamy wytrÄ…cajÄ…c DNA CTABem.
Polifenole, które w postaci utlenionej tworzą wiązania kowalencyjne z DNA,
usuwane są dzięki obecności PVP (poliwinylopirolidon) w buforze ekstrakcyjnym.
RNA trawimy RNazÄ… lub wytrÄ…camy z wykorzystaniem LiCl.
L.P Etap Cel etapu i jego przeprowadzenie
Øðuzyskanie roztworu DNA o pożądanej czystoÅ›ci
4.
i gęstości
Zagęszczenie preparatu
Po ekstrakcji kwasy nukleinowe znajdujÄ… siÄ™,
DNA i usunięcie
przeważnie w dużym rozcieńczeniu, w fazie wodnej,
zanieczyszczeń
zanieczyszczonej małocząsteczkowymi związkami. Dodając
małocząsteczkowych rozpuszczalnik organiczny (np. etanol lub izopropanol)
zmniejsza się polarność środowiska, co powoduje
zmniejszenie rozpuszczalności DNA, posiadającego
strukturę jonową i DNA tworzy nitkowate osady, które
można zebrać poprzez odwirowanie. RNA w obecności
alkoholu etylowego zwykle nie strÄ…ca siÄ™ tak jak DNA i
występuje jedynie jako drobne zanieczyszczenie, zaś przy
precypitacji izopropanolem pozostaje w roztworze.
Efektywność wytrącania kwasów nukleinowych zwiększa
siÄ™ poprzez dodatek soli (np. NaCl, CH3COOH, LiCl, MgCl,
czy CH3COONH4).
Przygotowanie DNA do Po wytrÄ…ceniu i przemyciu 70 % etanolem, DNA
5.
pozostawia się do wyschnięcia i przechowuje w
przechowywania
postaci r-ru wodnego lub buforach typu TE. Bufory
te zawierają Tris, odpowiedzialny za utrzymanie stałego pH roztworu, a także
EDTA, który wiąże jony dwuwartościowe, np. Mg2+, Ca2+, Mn2+, Zn2+, Jony te
są kofaktorami wielu enzymów nukleolitycznych stanowiących zagrożenie
dla przechowywanego DNA. DNA w buforach TE należy przechowywać w +4
lub  20oC.
Metoda CTAB - Protokół oparty na wykorzystaniu bromku
heksadodecylotrimetyloaminowego (CTAB) opracowany został w
1980 roku przez Murray a i Thompsona.
Metoda ta jest wykorzystywana do izolacji i oczyszczania
DNA z materiału roślinnego i produktów pochodzenia
roślinnego.
Komórki roślinne mogą być poddane lizie przy
użyciu detergentu jonowego bromku
heksadodecylotrimetyloaminowego (CTAB), który
tworzy nierozpuszczalny kompleks z kwasami
nukleinowymi w środowisku o niskim zasoleniu. W
tych warunkach polisacharydy, fenole i inne
zanieczyszczenia pozostajÄ… w supernatancie i mogÄ…
być usunięte.
Kompleks DNA jest rozpuszczany w roztworze o
zwiększonym stężeniu soli i wytrącany etanolem lub
izopropanolem .
Oznaczenie ilośći i jakości wyizolowanego DNA
1. Pomiar spektrofotometryczny
Ilość DNA może być mierzona bezpośrednio w roztworze wodnym. Pomiar
wykonuje się poprzez zmierzenie absorbcji A, określanej jako gęstość optyczna
OD.
DNA wykazuje znaczną absorpcję w zakresie UV z uwagi na obecność
aromatycznych zasad. Stwarza to możliwość badania struktury DNA. Zmiany
strukturalne, takie jak rozplecenie nici zmieniają absorpcję. Oprócz tego pomiary
absorpcji wykorzystuje się dla określenia czystości DNA. Główne pasmo absorpcji
dla oczyszczonego DNA znajduje siÄ™ przy 260 nm.
Białka, stanowiące główne zanieczyszczenia preparatów DNA absorbują przy
280 nm. Stosunek A260/A280 jest często stosowany jako relatywna miara
wzajemnej zawartości DNA i białek w preparacie. Typową wartością dla
izolowanego DNA jest 1,8. Mniejszy stosunek wskazuje na większe
zanieczyszczenie białkami.
Absorbcja przy długości fali 230 nm odzwierciedla zanieczyszczenia
pochodzące od węglowodorów, białek, fenoli czy komponentów aromatycznych.
Stosunek A 260/A 230 próbek czystych powinien wynosić ok. 2,2.
2. Rozdział elektroforetyczny
Wyizolowane próbki nakładane na żel agarozowy,
wybarwiane bromkiem etydyny.
Zestawy do oczyszczania kwasów
nukleinowych
" W celu ułatwienia prac związanych z badaniem kwasów nukleinowych, firmy
biotechnologiczne sprzedajÄ… specjalne kolumny do izolacji i oczyszczania DNA i
RNA.
" Systemy te na ogół oparte są zdolności złóż krzemionkowych do wiązania kwasów
nukleinowych w obecności wysokich stężeń soli chaotropowych, takich jak
chlorowodorek guanidyny lub izothiocjanian guanidyny. Sole chaotropowe,
powodują również rozpad błon komórkowych i denaturację białek, co sprzyja
izolacji kwasów nukleinowych. Chaotropy ang. chaotropes, czyli ,,czyniące chaos''
są to substancje, które w roztworach wodnych wprowadzają silne zaburzenia w
sieci wiązań wodorowych.
" W oparciu o tą zasadę opracowano systemy wykorzystywane do następujących
celów:
" - izolacja plazmidowego DNA,
" - izolacja całkowitego DNA
" - izolacja całkowitego RNA
" - elucja DNA z żeli agarozowych i poliakryloamidowych
" - oczyszczanie kwasów nukleinowych po reakcjach enzymatycznych, takich jak:
PCR, restrykcja, znakowanie.
Do sprzedawanego sprzętu firmy dołączają szczegółowe opisy odpowiednich
procedur. Generalna zasada
wykorzystania większości systemów obejmuje następujące etapy:
" 1) wstępne przygotowanie oczyszczanego kwasu
nukleinowego. W przypadku DNA plazmidowego jest to
ekstrakt bakteryjny pozbawiony DNA genoforowego. W
przypadku DNA całkowitego roślin lub zwierząt jest to
ekstrakt białkowy uzyskany w wyniku rozbicia tkanek w
buforze zawierającym stężone sole chaotropowe. Preparaty
agarozy zawierające eluowany DNA powinny zostać
poddane stopieniu. Mieszaniny zawierajÄ…ce DNA po
reakcjach enzymatycznych powinny zostać wzbogacone o
odpowiednie stężenie buforu chaotropowego.
" 2) nałożenie preparatu na kolumny. W zależności od skali,
w jakiej przeprowadza się oczyszczanie, mogą to być tzw.
minikolumny (rys. 1), w których przepływ roztworu przez
membranę zawierającą złoża krzemionkowe uzyskuje się w
wyniku wirowania całej kolumny w mikrowirówce, lub
większe kolumny, w których roztwór przepływa
grawitacyjnie.
" Złoża, przez które przechodzi roztwór, wychwytują
specyficzne dla nich kwasy nukleinowe, tzn. DNA lub RNA,
a pozostałe składniki roztworu, stanowiące
zanieczyszczenie dla badanych prób, zostają zebrane w
probówce znajdującej się poniżej filtra.
" 3) płukanie preparatu. W celu dokładnego odpłukania resztek
zanieczyszczeń związanych z filtrem, kolumienki przepłukuje
siÄ™ kilkukrotnie roztworami zawierajÄ…cymi sole chaotropowe
lub buforami zawierajÄ…cymi etanol.
" 4) wymywanie kwasów nukleinowych z kolumny. Po usunięciu
wszystkich zanieczyszczeń i osuszeniu membrany, ze złoża
odpłukuje się oczyszczone kwasy nukleinowe, nakładając na
kolumnę odpowiednią ilość wody, lub buforu TE. Zebrane z
kolumny preparaty oczyszczonego DNA lub RNA, na ogół
nadają się do bezpośredniego wykorzystania do dalszych prac
badawczych.
" Używanie standaryzowanych systemów do oczyszczania kwasów nukleinowych
posiada następujące zalety w porównaniu do analogicznych technik,
wykonywanych metodami tradycyjnymi:
" - czas trwania eksperymentu zostaje znacznie skrócony
" - wydajność i czystość prób oczyszczonych tą drogą są wyższe
" - metody te eliminują konieczność pracy z substancjami
szkodliwymi, np. fenolem, chloroformem
" - uzyskiwane wyniki sÄ… w wysokim stopniu powtarzalne
Etapy izolacji
" Homogenizacja materiału
" Dodanie 400 uL buforu PD
" Inkubacja przez 30 min w 65°C
" Dodanie 100 uL buforu precypitation buffer,
zworteksowanie próbek
" Inkubacja na lodzie 5 min
" Zwirowanie próbek z maksymalną prędkością
przez 5 min
" Przeniesienie supernatantu do kolumny PD1
Etapy izolacji cd.
" Zwirować 12 krpm, 1 min zachować filtrat
" Dodać do filtratu 0,5 objętości buforu
wiążącego PD i wymieszać przez pipetowanie
" Przenieść mieszaninę do kolumny PD2
zwirować 12 krpm, 1 min
" Odrzucić filtrat dodać 700 uL buforu
płuczącego wash buffer
" Powtórzyć ostatni krok
Etapy izolacji cd
" Zwirować próbki 12 krpm, 2 min
" Umieścić kolumny w probówce 1,5 ml dodać
200 uL buforu elucyjnego inkubować 1 min po
czym wirować 6 krpm, 1 min