mgr Anna Korycińska
[e-mail]
Obecnie wykorzystywane metody
izolacji:
ð Zastosowanie mieszaniny fenol:chloroform
ð Wysalanie biaÅ‚ek
ð WiÄ…zanie DNA do noÅ›nika
Wybór odpowiedniej metody
zależy od:
ð Rodzaju materiaÅ‚u genetycznego jaki chcemy uzyskać
(DNA genomowe, mitochondrialne, plazmidowe,
RNA, itp.)
ð Pochodzenia (roÅ›linne, zwierzÄ™ce, bakteryjne,
wirusowe, itp.)
ð Rodzaju materiaÅ‚u z jakiego przeprowadzamy izolacjÄ™
(z tkanek, organu, hodowli komórkowej)
ð Oczekiwanych rezultatów (czystość, jakość, czas
izolacji)
ð Przeznaczenia (PCR, klonowanie)
Porównanie metod
Fenol: chloroform wysalanie nośnik
zalety Otrzymane DNA jest Nie narusza Prostota, szybkość,
wysokiej czystości struktury białek, jest wydajność
odwracalne
wady Konieczne jest Powolność procesu Niższa wydajność
utrzymanie niż w przypadku
odpowiedniego pH izolacji
fenol:chloroform
Etapy izolacji DNA
1. Przygotowanie materiału biologicznego
ð Oczyszczenie (z zewnÄ™trznych zanieczyszczeÅ„,
pożywki i pozostałości innych komórek)
ð Homogenizacja
ð Zawieszenie w buforze
Etapy izolacji DNA
2. Dezintegracja i liza komórek oraz uwolnienie DNA do
roztworu oraz zabezpieczenie DNA przez degradacjÄ….
ð Rozbicie Å›ciany i bÅ‚ony komórkowej
ð Uwolnienie DNA i innych komponentów
wewnątrzkomórkowych do roztworu
ð Inaktywacja enzymów nukleolitycznych
Etapy izolacji DNA
3. Oddzielenie kwasu nukleinowego od pozostałych
komponentów komórkowych
ð Dysocjacja kompleksów DNA-biaÅ‚ko
ð Oddzielenie DNA od innych rozpuszczalnych
komponentów komórkowych
Etapy izolacji DNA
4. Zagęszczenie preparatu DNA i usunięcie
zanieczyszczeń małocząsteczkowych
ð Uzyskanie roztworu DNA o pożądanej czystoÅ›ci i
gęstości
Metoda fenolowa
Izolacja DNA metodÄ… fenolowÄ…
1. liza komórek i oddzielenie białek od DNA- dodanie
krwi do fenolu
- Fenol denaturuje białka
- Nie denaturuje całkowicie RNaz
- Jest rozpuszczalnikiem dla RNA
ð Dodanie fenolu, wytrzÄ…sanie, wirowanie
Faza wodna:
DNA
Interfaza:
białka
Faza
organiczna:
tłuszcze i RNA
Izolacja DNA metodÄ… fenolowÄ…
2. Dalsze oczyszczanie z białek
- Mieszanina fenol/chloroform/ alkohol izoamylowy
25/24/1
- Chloroform ułatwia rozdzielenie fazy wodnej i
organicznej
- Inaktywacja i usunięcie enzymów
Izolacja DNA metodÄ… fenolowÄ…
3. Usuwanie fenolu
- Resztki fenolu usuwa siÄ™ poprzez dodanie samego
chloroformu do zebranej fazy wodnej
4. WytrÄ…canie DNA
- Dodanie izopropanolu do fazy wodnej
- Po wirowaniu DNA jest w osadzie na dnie probówki.
Izolacja DNA metodÄ… fenolowÄ…
5. Przemycie DNA
- Dodanie etanolu 70%
- Wirowanie
- Pozostawienie do wyschnięcia
6. Rozpuszczenie osadu DNA
- Dodanie roztworu o niskiej sile jonowej- woda lub
bufor TE
Izolacja metodÄ… kolumienkowÄ…
Izolacja DNA na złożach
krzemionkowych
ð Krew jest lizowana o odpowiednim buforze lizujÄ…cym,
który zawiera sole chaotropowe i detergenty niejonowe
ð Dodatkowo wykorzystuje siÄ™ ProteinazÄ™ K (silna
proteaza)  liza komórek i degradacja wszystkich
białek.
Izolacja DNA na złożach
krzemionkowych
ð NastÄ™pnie mieszanina nakÅ‚adana jest na kolumnÄ™ ze
złożem krzemionkowym  DNA osiada na złożu,
zanieczyszczenia przechodzÄ… przez nie
Izolacja DNA na złożach
krzemionkowych
ð W tej metodzie izolacji wykorzystuje siÄ™ wiÄ…zanie
DNA do złoża krzemionkowego w wysokim stężeniu
soli chaotropowych. Ujemnie naładowane cząsteczki
DNA łączą się w dużym stężeniu soli do dodatnio
naładowanej krzemionki. Zanieczyszczenia są
odpłukiwane, a następnie DNA wymywany jest
roztworem o niskim stężeniu soli (woda lub bufor w
niskim stężeniu)
Izolacja DNA na złożach
krzemionkowych
ð Po wypÅ‚ukaniu zanieczyszczeÅ„ DNA wymywane jest z
kolumny niskojonowymi buforami lub wodÄ….
Izolacja DNA na złożach
krzemionkowych
Ocena ilościowa i jakościowa DNA
Ocena ilościowa wyizolowanego
DNA
Absorbancja przy 260nm jest równa 1 dla:
ð dwuniciowego DNA o stężeniu 50źg/ml,
Stężenie= Abs(260nm-310nm) x 50źg/ml x rozc
ð jednoniciowego DNA o stężeniu 33źg/ml
Ocena jakościowa wyizolowanego
DNA
ð Zmierzenie absorbancji przy dÅ‚ugoÅ›ci fali: 260nm,
280nm,320nm
ð Stosunek absorbancji A260/A280 okreÅ›la stopieÅ„
zanieczyszczenia białkami. DNA uważamy za czyste,
jeżeli ten stosunek wynosi 1,8-2,05
ð Stosunek 1,5 oznacza, że w preparacie znajduje siÄ™ 50%
białka i preparat należy ponownie oczyścić.
Ocena jakościowa wyizolowanego
DNA
ð Substancje absorbujÄ…ce i charakterystyczne dla nich
długości fali.
ð Zanieczyszczenie fenolem: 230
ð DNA, RNA: 260
ð BiaÅ‚ka: 280
ð Drobiny komórkowe: 320
Dodatkowe materiały
ð Dodatkowe materiaÅ‚y znajdujÄ… siÄ™ na stronie e-kursu