IZOLACJA DNA Z TRUSKAWEK  INSTRUKCJA WYKONANIA
Składniki:
2 rozmrożone truskawki
Å» szklanki wody
2 łyżeczki płynu do mycia naczyń
1 łyżeczka soli kuchennej
schłodzony alkohol techniczny
Materiały:
woreczek strunowy
2 plastikowe kubeczki
papierowy filtr do kawy
drewniany patyczek
Wykonanie:
Umieść truskawki w woreczku strunowym, zamknij go i rozgniataj truskawki przez około 2 minuty;
W plastikowym kubeczku przygotuj roztwór lizujący: do połowy szklanki wody dodaj 2 łyżeczki płynu
do mycia naczyń i 1 łyżeczkę soli kuchennej; całość wymieszaj;
Otwórz torebkę z rozgniecionymi truskawkami i wlej do niej gotowy roztwór lizujący;
Zamknij ponownie woreczek i delikatnie rozgniataj palcami jego zawartość przez około 1 minutę
(uważaj, żeby w woreczku nie powstawała piana);
Na czystym kubeczku plastikowym umieść filtr do kawy;
Otwórz woreczek z masą truskawkową i wylej ją na filtr; możesz złapać za brzegi filtru i je delikatnie
ścisnąć, ale uważaj, żeby nie przerwać papieru, z którego wykonany jest filtr;
Do odfiltrowanego płynu dodaj równą objętość schłodzonego alkoholu technicznego i bez mieszania
obserwuj co siÄ™ dzieje;
W ciągu kilku sekund zobaczysz pojawianie się mętnej substancji w górnej warstwie ekstraktu
truskawkowego;
Przechyl kubeczek i zgarnij drewnianym patyczkiem strącona substancję  to jest właśnie DNA, który
udało Ci się wyizolować z truskawek.
CZ
ŚĆ TEORETYCZNA
1. Budowa i właściwości kwasów nukleinowych; struktura i organizacja chromatyny
Elementy składowe kwasów nukleinowych  zasady azotowe, nukleozydy i nukleotydy
Wyróżnia się dwa rodzaje kwasów nukleinowych  kwas rybonukleinowy (ang. ribonucleic acid 
RNA) oraz dezoksyrybonukleinowy (ang. desoxiribonucleic acid  DNA). Różnią się one funkcją i
lokalizacją komórkową: DNA występuje w jądrze i stanowi magazyn informacji genetycznej, zaś
RNA obecny jest w jądrze i w cytoplazmie, a jego podstawową rolą jest udział w biosyntezie
białek. Wszystkie kwasy nukleinowe są polimerami mniejszych cząsteczek, zwanych nukleotydami.
Nukleotyd składa się z nukleozydu, do którego przyłączona jest reszta fosforanowa. Nukleozyd z kolei
stanowi połączenie zasady azotowej oraz cukru pięciowęglowego (pentozy).
Zasady azotowe wchodzące w skład kwasów nukleinowych to pochodne puryny (zasady purynowe) lub
pirymidyny (zasady pirymidynowe). Zasady purynowe to adenina (A) i guanina (G), zaÅ› pirymidynowe
 cytozyna (C), uracyl (U) i tymina (T). Adenina, guanina i cytozyna występują w obu rodzajach
kwasów nukleinowych, natomiast tymina tylko w DNA, a uracyl  tylko w RNA.
Drugim składnikiem nukleozydu jest cukier C5  pentoza. Nazwy kwasów nukleinowych wzięły się od
wchodzących w ich skład cukrów  kwas rybonukleinowy zawiera D-rybozę, zaś
dezoksyrybonukleinowy  2-dezoksy-D-rybozÄ™.
Nukleotydy są estrami fosforowymi nukleozydów. Reszta fosforanowa związana jest z jedną z grup
hydroksylowych pentozy: w rybozydach  przy C2 , C3 lub C5 , a dezoksyrybozydach  przy C3 lub
C5 .
Budowa przestrzenna i właściwości DNA
Badacze J. D. Watson i F. C. K. Crick wykazali, że DNA posiada strukturę II-rzędową w postaci
podwójnej prawoskrętnej helisy. Dwie nici polinukleotydowe występują jako wzajemnie splecione
helisy, oplatające linią śrubową wspólną oś długą.
W zależności od warunków środowiska, dwupasmowe DNA może występować w co najmniej 6
formach: A, B, C, D, E i Z, przy czym w warunkach fizjologicznych (niskie stężenia soli, wysoki
poziom uwodnienia) dominuje forma B.
Ponieważ oba łańcuchy są prawoskrętne i polarne, muszą być przeciwbieżne, tzn. sekwencje atomów i
grup układają się w każdym z nich w kierunku przeciwnym. Pasmo biegnące w kierunku 5 3 określa
się jako kodujące, ponieważ koduje przekazywaną informację genetyczną (przekłada się na sekwencję
aa w kodowanym białku), drugie natomiast (3 5 )  jako matrycowe, gdyż stanowi matrycę do
syntezy mRNA.
2. Izolacja DNA z komórki zwierzęcej
Izolacja i oczyszczanie DNA jest kluczowym etapem większości procedur stosowanych w biologii
molekularnej, diagnostyce i innych badaniach. Głównym celem tego etapu jest uzyskanie wysokiej
jakości i czystości materiału biologicznego, niezależnie od z
ródła jego pochodzenia. Wybór
odpowiedniej metody izolacji zależy:
· od rodzaju badanego kwasu nukleinowego jaki chcemy uzyskać (DNA genomowe, mitochondrialne,
plazmidowe, RNA itd.),
· pochodzenia (roÅ›linne, zwierzÄ™ce, bakteryjne, wirusowe itd.),
· rodzaju materiaÅ‚u z jakiego przeprowadzamy izolacjÄ™ (z tkanek, organu, hodowli komórkowej itd.),
· oczekiwanych rezultatów (czystość, jakość, czas izolacji itd.)
· przeznaczenia (PCR, klonowanie, itd.).
Znanych jest wiele procedur izolacji DNA, w wyniku których otrzymuje się DNA:
biologicznie aktywne, chemicznie stabilne oraz wolne od RNA i białek. Jednakże ze względu na
wielkość i wrażliwość chromosomalnego DNA praktycznie niemożliwa jest jego izolacja w formie
niezmienionej. Część DNA ulega mechanicznym uszkodzeniom.
Podczas izolacji DNA z komórki należy wziąć pod uwagę następujące parametry, warunkujące
zachowanie natywnej struktury DNA:
a. ph:
· wiÄ…zania wodorowe pomiÄ™dzy komplementarnymi Å‚aÅ„cuchami sÄ… stabilne w Å›rodowisku o pH = 4 ÷ 10
· wiÄ…zania fosfodiestrowe w szkielecie DNA sÄ… trwaÅ‚e w zakresie pH = 3 ÷ 12
b.temperatura:
· wiÄ™kszość DNA ulega rozpleceniu w temperaturze 80÷90 °C
· wiÄ…zania N-glikozydowe i fosfodiestrowe sÄ… trwaÅ‚e do 100°C
c. siła jonowa :
· DNA jest bardziej trwaÅ‚y i rozpuszczalny w roztworach soli
· w stężeniu soli mniejszym niż 0,1M osÅ‚abiajÄ… siÄ™ wiÄ…zania wodorowe pomiÄ™dzy komplementarnymi
łańcuchami;
d. warunki komórkowe:
· w komórce wystÄ™puje kilka enzymów, które hydrolizujÄ… DNA; najistotniejszymi z nich sÄ…
deoksyrybonukleazy, które hydrolizują wiązania fosfodiestrowe
· natywny DNA wystÄ™puje w komórkach w kompleksie z biaÅ‚kami (histony, helikazy, polimerazy i in.),
białka te muszą być oddzielone podczas ekstrakcji;
e. odporność mechaniczna DNA:
3. Etapy izolacji DNA
Niezależnie od zastosowanej procedury większość metod opiera się na kilku podstawowych i
niezmiennych etapach izolacji:
Etap 1. Wstępne przygotowanie materiału biologicznego do izolacji DNA
oczyszczenie, homogenizacja, zawieszenie w buforze
Materiałem wyjściowym do izolacji DNA może być niemal każdy materiał biologiczny (tkanka, organ,
zawiesina komórkowa i in.). W zależności od rodzaju, jak i pochodzenia materiału, wstępne
przygotowanie może obejmować oczyszczenie z różnego rodzaju zanieczyszczeń zewnętrznych,
pożywki i pozostałości innych komórek (przemywanie buforami stabilizującymi ), rozdrobnienie i
homogenizację, a następnie zawieszanie jednolitej masy komórkowej w odpowiednim buforze.
Etap 2. Dezintegracja i liza komórek oraz uwolnienie DNA do roztworu, w którym jest on
rozpuszczalny i zabezpieczony przed degradacjÄ…
rozbicie ściany i błony komórkowej
Destrukcji błon zewnętrznych towarzyszy uwolnienie DNA oraz innych komponentów
wewnątrzkomórkowych. Stąd bardzo istotne jest zachowanie odpowiednich warunków, aby kwas
nukleinowy nie uległ uszkodzeniom. Do rozpuszczenia DNA i lizy komórek służy roztwór soli,
najczęściej NaCl, zawierający Tris-HCl i EDTA. DNA, będąc związkiem jonowym jest bardziej
stabilny i rozpuszczalny w roztworze NaCl niż w wodzie destylowanej. Tris-HCl ma za zadanie
utrzymać stałe, lekko zasadowe pH roztworu, co zmniejsza oddziaływania elektrostatyczne pomiędzy
DNA a zasadowymi białkami. EDTA wiąże jony metali dwuwartościowych, które mogłyby tworzyć
sole z anionowymi grupami fosforanowymi DNA oraz hamuje działanie deoksyrybonukleaz, które
wymagają dla swojej aktywności obecności jonów Mg2+ lub Mn2+.
inaktywacja enzymów nukleolitycznych
Uwalniający się z komórki kwas nukleinowy jest narażony na działanie degradujące nukleaz  enzymów
katalizujących hydrolizę 1- i 2-niciowych kwasów nukleinowych (endo-, egzo-, detoksy-, rybonukleazy
i in.), przecinajÄ…cych wiÄ…zania fosfodiestrowe. Unieczynnienie ich prowadzi siÄ™ silnymi enzymami
proteolitycznymi (np. proteinazÄ… K).
Etap 3. oddzielenie kwasu nukleinowego od pozostałych komponentów komórkowych
dysocjacja kompleksów DNA  białko
Celem zniesienia oddziaływań jonowych pomiędzy naładowanymi dodatnio histonami i innymi
białkami a ujemnie naładowanym szkieletem DNA stosuje się różnego rodzaju detergenty oraz sole. Sól
sodowa siarczanu dodecylu (SDS) wiąże się z białkami i nadaje im silnie anionowy charakter, a
także działa jako czynnik denaturujący deoksyrybonukleazy i inne białka. A
agodnie alkaliczne
środowisko (pH = 8,0) zmniejsza oddziaływania elektrostatyczne pomiędzy DNA a zasadowymi
histonami i polikationowymi aminami, przyczynia się także do zmniejszenia aktywności nukleaz i
denaturacji innych białek. Zaś sole w wysokich stężeniach (NaCl, NaClO4 lub inną sól) zapewniają
całkowitą dysocjację kompleksów DNA-białko i usuwają związane kationowe poliaminy; oddzielenie
DNA od innych rozpuszczalnych komponentów komórkowych. Całkowite odbiałczanie roztworu,
przeprowadza siÄ™ poprzez ekstrakcjÄ™ rozpuszczalnikami organicznymi, np. mieszaninÄ… chloroformu i
alkoholu izoamylowego, a następnie odwirowanie. W rezultacie powstają trzy warstwy: górna faza
wodna, zawierajÄ…cÄ… kwasy nukleinowe, dolna faza organiczna i wÄ…skie pasmo zdenaturowanego
białka na granicy faz. Chloroform powoduje powierzchniową denaturację białek. Alkohol izoamylowy
redukuje pienienie i stabilizuje granicę fazową, gdzie koncentruje się białko. Górna, wodna faza,
zawierająca kwasy nukleinowe jest następnie oddzielana i DNA jest wytrącany poprzez dodanie
etanolu.
Etap 4. zagęszczenie preparatu DNA i usunięcie zanieczyszczeń małocząsteczkowych
uzyskanie roztworu DNA o pożądanej czystości i gęstości
Po ekstrakcji kwasy nukleinowe znajdują się, przeważnie w dużym rozcieńczeniu, w fazie wodnej,
zanieczyszczonej małocząsteczkowymi związkami. Dodając rozpuszczalnik organiczny (np. etanol lub
izopropanol) zmniejsza się polarność środowiska, co powoduje zmniejszenie rozpuszczalności DNA,
posiadającego strukturę jonową i DNA tworzy nitkowate osady, które można zebrać poprzez
odwirowanie. RNA w obecności alkoholu etylowego zwykle nie strąca się tak jak DNA i występuje
jedynie jako drobne zanieczyszczenie, zaÅ› przy precypitacji izopropanolem pozostaje w roztworze.
Efektywność wytrącania kwasów nukleinowych zwiększa się poprzez dodatek soli. Po wytrąceniu i
przemyciu 70 % etanolem, DNA pozostawia się do wyschnięcia i następnie zawiesza w małej objętości
buforu o niskiej sile jonowej (np. bufor TE) lub w wodzie.
Zagadnienia do samodzielnego opracowania:
" budowa chromosomu prokariotycznego i eukariotycznego
" pojęcia: nukleosom, histon