Oznaczanie ilo ciowe w HPLC.qxp 2004-06-04 00:44 Page 171
11. OZNACZANIE ILOR
CIOWE W HPLC
Rafał Kartanowicz
Celem rozdzielania mieszaniny substancji na poszczególne składniki, bądx
oddzielenia
tylko wybranych substancji od innych, jest najczęS
ciej ich iloS
ciowe oznaczenie, tj. ustalenie
zwartoS
ci lub masy analitu w bardzo dużej próbce.
Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) jest wykorzystywana do oznaczenia
zawartoS
ci składników głównych, t.j. występujących w próbce na poziomie stężeń w zakresie od
1 do 100 %, składników poS
rednich - od 0.001 do 1% oraz substancji obecnych w analizowanej
próbce poniżej 0.001%, tj. składników S
ladowych.
Oznaczenie iloS
ciowe w HPLC polega na ustaleniu zależnoS
ci pomiędzy sygnałem detek-
tora, czyli powierzchnią pod pikiem lub ewentualnie wysokoS
cią piku, a stężeniem lub masą
składnika, którego zawartoS
ć zamierzamy oznaczyć. W praktyce mamy do dyspozycji cztery
metody oznaczania: metodę wzorca zewnętrznego (metodę krzywej kalibracyjnej), metodę wzor-
ca wewnętrznego, metodę dodatku wzorca (metodę fortyfikacji) oraz metodę prostej normaliza-
cji lub normalizacji ze współczynnikami korekcyjnymi.
11.1. METODA WZORCA ZEWNĘTRZNEGO
(METODA KRZYWEJ KALIBRACYJNEJ, EXTERNAL STANDARD)
Istotą metody wzorca zewnętrznego jest wyznaczenie zależnoS
ci pomiędzy powierzchnią
(wysokoS
cią) piku dla każdej z oznaczanych substancji i ich stężeniem lub masą.
W tym celu przygotowuje się roztwory kalibracyjne, tzn. roztwory substancji oznaczanej
albo mieszaniny analizowanych substancji w kilku różnych stężeniach (np. 1.0, 2,0, 3.0, 4.0
mg/mL). Każdy z przygotowanych roztworów dozowany jest do kolumny chromatograficznej.
Na podstawie powierzchni lub wysokoS
ci pików, na uzyskanych chromatogramach wyznacza się
przebieg krzywej kalibracyjnej bądx
oblicza się wartoS
ci współczynników w równaniu kalibra-
cyjnym dla każdej z oznaczanych substancji. Następnie dozowane do kolumny i rozdzielane są
próbki, w których oznaczona ma być zawartoS
ć substancji. Uzyskane powierzchnie pików sub-
stancji oznaczanych w nieznanej próbce umożliwią oznaczenie ich zawartoS
ci, tj. stężenia
(masy). W praktyce wykonuje się to metodą graficznej interpolacji na wykresie krzywej kalibra-
cyjnej, w oparciu o równanie krzywej kalibracyjnej lub z wykorzystaniem równania (1).
Ax
Cx = (1)
Rf
gdzie: Cx - oznaczona zawartoS
ć, Ax - powierzchnia piku, Rf - współczynnik odpowiedzi, tj. ilo-
raz powierzchni piku i stężenia substancji o znanym stężeniu w roztworze wzorcowym. Gdy
równanie kalibracyjne wyrażone jest funkcją typy f(x) = a1x, to współczynnik odpowiedzi jest
współczynnikiem kierunkowym a1 tej prostej, dla których wykonano kalibrację.
171
Oznaczanie ilo ciowe w HPLC.qxp 2004-06-04 00:44 Page 172
Na rysunku 1 i 2 przedstawiono odpowiednio: typową krzywą kalibracyjną uzyskaną metodą
wzorca zewnętrznego oraz chromatogramy roztworów wzorcowych.
Rys. 11.1. Wykres krzywej kalibracyjne otrzymanej metodą wzorca zewnętrznego.
Rys. 11.2. Chromatogramy roztworów wzorcowych substancji A, B, C o stężeniach 1.0, 2.0 i 4.0
mg/mL.
172
Oznaczanie ilo ciowe w HPLC.qxp 2004-06-04 00:45 Page 173
Stosowanie tej metody kalibracji wymaga, aby zarówno roztwory wzorcowe jak i anali-
zowane próbki były rozdzielane ("chromatografowane") w tych samych warunkach temperatury,
objętoS
ciowego natężenie przepływu eluentu, typu i wymiarów kolumny chromatograficznej, z
reguły tej samej kolumny, składu eluentu oraz takiego samego programu elucji. Ponadto trzeba
brać też pod uwagę następujące czynniki:
Równanie kalibracyjne jest najczęS
ciej zależnoS
cią prostoliniową typu y = a1x + a2, ale
niekiedy do opisu przebiegu krzywej kalibracyjnej wykorzystuje się inne funkcje:
y = a1x,
y = a1x2 + xa2 + a3
y = a1x3 + a2x2 + xa3 + a4
2
y = a1xa
gdzie: y - powierzchnia piku(wysokoS
ć), x - stężenie (masa) substancji,
a1,2,3,4 - współczynniki.
Dozowanie do kolumny chromatograficznej powinno być powtarzalne.
Oznaczanie zawartoS
ci substancji w próbkach nieznanych może być wykonywane tylko
w zakresie stężeń, w jakim została wykona kalibracja, dotyczy to także innych metod tj.
metody wzorca wewnętrznego czy fortyfikacji. Ekstrapolacja przebiegu krzywej kali-
bracyjnej poza zakres wykonanej kalibracji, może być x
ródłem niedokładnych wyników
oznaczeń ze względu na nieliniowy przebieg odpowiedzi detektora.
11.2. METODA WZORCA WEWNĘTRZNEGO
Jest to metoda polegająca na dodaniu do próbki znanej iloS
ci składnika, tzw. wzorca
wewnętrznego (IST), który jest jednak inny od substancji oznaczanych i nie może być obecny w
analizowanych próbkach przed jego dodaniem.
W celu uzyskania krzywej kalibracyjnej do kilku roztworów wzorcowych o różnych stęże-
niach substancji oznaczanej dodaje się najczęS
ciej stałą i znaną iloS
ć wzorca wewnętrznego. Na
podstawie uzyskanych chromatogramów roztworów wzorcowych wykreS
la się zależnoS
ć stęże-
Rys. 11.3. Wykres krzywej kalibracyjnej otrzymanej przy zastosowaniu techniki wzorca
wewnętrznego.
173
Oznaczanie ilo ciowe w HPLC.qxp 2004-06-04 00:45 Page 174
nia analitu w funkcji stosunku powierzchni piku analitu i wzorca wewnętrznego. Na rysunku 11.3
przedstawiono krzywą kalibracyjną dla substancji oznaczanej metodą wzorca wewnętrznego.
W celu oznaczenia zawartoS
ci substancji metodą wzorca wewnętrznego w próbce badanej
(o znanej masie lub objętoS
ci), dodaje się do niej znaną iloS
ć wzorca wewnętrznego. Następnie
z zarejestrowanego chromatogramu oblicza się stosunek powierzchni piku analitu i wzorca
wewnętrznego. ZawartoS
ć substancji wyznacza się metodą graficznej interpolacji, oblicza z rów-
nania krzywej kalibracyjnej lub z wykorzystaniem zależnoS
ci (2) i (3) w sytuacji, kiedy krzywa
kalibracyjna jest zależnoS
cią liniową typu f(x) = a1x:
Ax / Aist
Cx = (2)
Rf
Ai / Aist (i)
(3)
Rf =
ci
gdzie: Cx - oznaczona zawartoS
ć, Ax - powierzchnia piku analitu, Aist - powierzchnia piku wzor-
ca wewnętrznego, Rf - współczynnik odpowiedzi, Ai, Aist(i)- powierzchnia piku analitu i wzorca
wewnętrznego w roztworze kalibracyjnym, ci - stężenie analitu w roztworze kalibracyjnym.
Na rysunku 11.4 przedstawiono chromatogram mieszaniny wzorcowej substancji
oznaczanych oraz wzorca wewnetrznego.
Rys. 4. Chromatogram mieszaniny substancji oznaczanych A, B, C, D oraz wzorca
wewnętrznego (IST).
Wzorzec wewnętrzny powinien spełniać następujące wymagania:
musi być rozdzielony od innych składników występujących w próbce
czas retencji powinien być zbliżony do czasu retencji analitu(ów)
nie występuje w próbkach pierwotnych
właS
ciwoS
ci fizyko-chemiczne są podobne do analitu. Jest to szczególnie istotne na
etapie przygotowania próbek (oczyszczania, wzbogacania czy derywatyzacji)
powinien być możliwie wysokiej czystoS
ci
stabilny chemicznie
odpowiedx
detektora dla wzorca wewnętrznego powinna być zbliżona do odpowiedzi
substancji oznaczanych
174
Oznaczanie ilo ciowe w HPLC.qxp 2004-06-04 00:45 Page 175
Metoda ta ma zastosowanie szczególnie w przypadku metod analitycznych wymagających
złożonej, wieloetapowej procedury przygotowania próbki (izolacja, wzbogacanie, derywatyzac-
ja itp.), co może powodować straty analitów. Dodanie wzorca wewnętrznego do badanej próbki
jeszcze przed przystąpieniem do przegotowania próbki do analizy chromatograficznej pozwala
na skorygowanie tych strat.
Stosowanie metody wzorca wewnętrznego pozwala również na uniezależnienie otrzymy-
wanych wyników od wahań iloS
ci dozowanej próbki. Ograniczaniem w stosowaniu tej metody
może być bardzo bogata matryca, w której znajdują się anality. Trudne może być dobranie
odpowiedniej substancji jako wzorca wewnętrznego. W praktyce metoda ta jest też bardziej pra-
cochłonna niż metoda krzywej kalibracyjnej.
11.3. METODA DODATKU WZORCA
Metoda ta polega na dodaniu do próbki znanych iloS
ci substancji oznaczanych (analitów)
np. 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 i 0.5 mg/mL, zwykle jest to od 50 do 150% oczekiwanej zawartoS
ci
oznaczanej substancji. Po zanalizowaniu tych roztworów, na podstawie uzyskanych chro-
matogramów, wykreS
la się krzywą kalibracyjną, tj. zależnoS
ć powierzchni piku analitu w funkcji
iloS
ci analitu dodanej do próbki (Rysunek 11.5).
Rys. 11.5. Wykres krzywej kalibracyjnej otrzymanej przy zastosowaniu metody dodatku wzorca.
Następnie przeprowadza się graficzną ekstrapolację krzywej kalibracyjnej do punkt prze-
cięcia z osią odciętych i odczytuje się wartoS
ć Cx. Innym sposobem okreS
lenia zawartoS
ci sub-
stancji oznaczanej w próbce bez dodatku wzorca jest graficzne wyznaczenie przebiegu nowej
linii kalibracyjnej typu f(x) = a1x, o tym samym współczynniku nachylenia prostej, co krzywa
kalibracyjna. Przeprowadza się wówczas graficzną interpolację, bądx
oblicza się stężenie anali-
tu w próbce bez dodatku substancji oznaczanej z równania (4), na przykład: Cx=22.5/120=0.19.
a2(x = 0)
cx = (4)
a1
gdzie: a1 - współczynnik kierunkowy prostej, a2 - wartoS
ć w punkcie przecięcia się prostej z osią
rzędnych.
175
Oznaczanie ilo ciowe w HPLC.qxp 2004-06-04 00:45 Page 176
Zaletą metody dodatku wzorca jest wykonanie kalibracji w takich warunkach, że anality
znajdują się w rzeczywistej matrycy. Szczególnie, kiedy jest bardzo trudne bądx
niemożliwe
otrzymanie matrycy (placebo), w której nie znajdowałaby się substancja oznaczana, np. w przy-
padku próbek klinicznych i S
rodowiskowych. Szczególną cecha tej metody jest jej wysoka
"odpornoS
ć" na sytuację niepełnego rozdzielenia analitu oraz gdy pik substancji oznaczanej nie
jest rozdzielony do linii podstawowej od innych substancji, których piki są jednak znacznie
mniejsze w stosunku do substancji oznaczanej. Na rysunku 11.6 przedstawiono przykład takiego
chromatogramu, na którym pik substancji oznaczanej zaznaczono symbolem "1". W wyżej
wymienionych sytuacjach tylko metoda dodatku wzorca pozawala na oznaczenie zawartoS
ci sub-
Rys. 11.6. Chromatogram mieszaniny substancji, w której analit (1) nie jest w rozdzielony do linii
bazowej od innych substancji.
stancji w próbce. Wykonanie oznaczenia zawartoS
ci substancji metodą dodatku wzorca jest jed-
nak pracochłonne.
11.4. METODA PROSTEJ NORMALIZACJI
Metoda prostej normalizacji nie jest metodą kalibracji. Nie stosuje się w niej odniesienia
do znanej iloS
ci wzorca. Jednakże metoda ta umożliwia oszacowanie względnych iloS
ci sub-
stancji np. zawartoS
ci zanieczyszczeń w badanej próbce.
Na podstawie chromatogramu oblicza się sumaryczną powierzchnię pików, którą traktuje
się jak 100%. Następnie oblicza się udział powierzchni okreS
lonego piku względem sumy
powierzchni wszystkich lub tylko wybranych pików na chromatogramie. Otrzymanej wartoS
ci
dla danej substancji przypisuje się procentową zawartoS
ci względem innych substancji obecnych
w mieszaninie. Obliczenia wykonuje się zgodnie z poniższym równaniem (5).
Ai
ci = �100 (5)
ŁAi
gdzie: ci - udział % substancji i względem innych pików na chromatogramie, Ai - powierzchnia
piku, ŁAi - suma powierzchni wszystkich lub wybranych pików na chromatogramie
Na rysunku 11.7 chromatogram mieszaniny substancji oznaczanych oraz ich udziały pro-
centowe w próbce uzyskanę metodą prostej normalizacji.
176
Oznaczanie ilo ciowe w HPLC.qxp 2004-06-04 00:45 Page 177
Rys. 11.7. Chromatogram mieszaniny substancji, na którym podano udziały procentowe składników
otrzymane metodą prostej normalizacji.
Metoda prostej normalizacji opiera się na założeniu, że współczynniki odpowiedzi dla
każdego składnika próbki są takie same, tzn. takie same stężenia różnych substancji odpowiada-
ją takim samym powierzchniom ich pików chromatograficznych. Taką charakterystyką cechuje
się detektor FID (płomieniowo-jonizacyjny) stosowany w chromatografii gazowej do oznacza-
nia węglowodorów. W chromatografii cieczowej metoda uproszczonej normalizacji jest
stosowana bardzo rzadko. Wynika to stąd, że detektory stosowane w HPLC charakteryzują się
zróżnicowaną czułoS
cią względem substancji. Stosowanie detektora typu UV-VIS i metody
prostej normalizacji jest nie celowe, ponieważ nawet substancje należące do tego samego szeregu
homologicznego charakteryzują się zróżnicowanymi molowymi współczynnikami absorbancji
(�). Zatem odpowiedx
detektora UV-VIS zależy od stężenia substancji jak i molowego
współczynnika absorbancji
Korzystne może być stosowanie metody prostej normalizacji, gdy wykorzystywany jest
detektor refraktometryczny lub detektor S
wiatła rozproszonego. Detektory te wykazują zbliżoną
odpowiedx
dla różnych substancji o zbliżonej strukturze i masie cząsteczkowej.
11.5. METODA NORMALIZACJI ZE WSPÓŁCZYNNIKAMI
KOREKCYJNYMI
Metoda ta, podobnie jak metoda prostej normalizacji, polega na okreS
leniu względnej
powierzchni piku substancji badanej względem wybranych bądx
wszystkich pików na chro-
matogramie z uwzględnieniem współczynników korekcyjnych, uwzględniających zróżnicowaną
odpowiedx
detektora dla różnych składników próbki.
Współczynniki korekcyjne wykorzystuje się w celu oznaczenia rzeczywistego udziału
procentowego poszczególnych substancji w próbce analizowanej zgodnie z równaniem (6).
Ai � Rfi
ci = �100 (6)
Ł(Ai � Rfi )
gdzie: ci - udział % substancji i, Ai - powierzchnia piku, ŁAi - suma powierzchni wszystkich lub
wybranych pików na chromatogramie, Rf,i - współczynnik odpowiedzi (współczynnik korek-
cyjny) dla substancji i
177
Oznaczanie ilo ciowe w HPLC.qxp 2004-06-04 00:45 Page 178
W celu wyznaczenia współczynników korekcyjnych postępuje się w sposób następujący.
Na chromatogramie mieszaniny o znanych zawartoS
ciach substancji badanych oblicza się pola
powierzchni pików, a następnie oblicza się względny udział procentowy poszczególnych sub-
stancji metodą prostej normalizacji. W dalszej kolejnoS
ci oblicza się wartoS
ć współczynnika
korekcyjnego dla danej substancji korzystając z równania (7).
ci (znane)
(7)
Rfi =
ci (obliczone)
gdzie: ci (znane) - zawartoS
ć składnika i w roztworze wzorcowym, ci (obliczone) - udział skład-
nika i w rozworze wzorcowym obliczony metodą prostej normalizacji.
W praktyce, często zakłada się, że dla wybranej substancji w mieszaninie współczynnik
korekcyjny przyjmuje wartoS
ć 1.
Na przykład, dla substancji A, B, C, D przedstawionych na chromatogramie na rysunku 7
wyznaczone współczynniki korekcyjne wynoszą: RfA = 1, RfB = 1.1, RfC = 1.1, RfD = 1.2, stąd
uzyskane zawartoS
ci po uwzględnieniu współczynników korekcyjnych poszczególnych skład-
ników wynoszą: A - 20.1, B - 20.0, C - 43.5, D - 16.4 [%].
178