Genetyczne i epigenetyczne zmiany

UNIWERSYTET ŚLSKI
WYDZIAA BIOLOGII I OCHRONY ŚRODOWISKA
KATEDRA ANATOMII I CYTOLOGII ROŚLIN
Agnieszka BRSZEWSKA-ZALEWSKA
Genetyczne i epigenetyczne zmiany
Genetyczne i epigenetyczne zmiany
w diploidalnych i poliploidalnych
w diploidalnych i poliploidalnych
genomach Brassica
genomach Brassica
Promotor:
Prof. dr hab. Jolanta Małuszyńska
Praca doktorska wykonana w ramach
grantu promotorskiego Nr. N302 002 32/0402
Katowice 2008
Składam serdeczne podziękowania
Pani Prof. dr hab. Jolancie Małuszyńskiej
Za przekazaną wiedzę, poświęcony czas, wszechstronną pomoc oraz cenne uwagi
w trakcie prowadzenia badań i pisania pracy.
Wszystkim Pracownikom Katedry Anatomii i Cytologii Roślin UŚ
Za okazaną pomoc, a w szczególności mgr Marcie Hosiawie - Barańskiej za
konsultacje oraz za to, że zawsze mogłam na nią liczyć.
Panu dr Tytusowi Bernasiowi
Za pomoc w analizie z wykorzystaniem mikroskopu konfokalnego i cytometru
obrazowego.
Mojej Rodzinie
Za wsparcie i cierpliwość, a szczególnie mojemu mężowi za nieocenioną pomoc
w redagowaniu pracy oraz zrozumienie i dużą dawkę optymizmu.
Spis treści
SPIS TREŚCI
1. WSTP .......................................................................................................................... 3
1.1. CHARAKTERYSTYKA GATUNKÓW BRASSICA ................................................................ 3
1.2. POCHODZENIE I EWOLUCJA GATUNKÓW BRASSICA ...................................................... 4
1.3. CYTOGENETYCZNE BADANIA GENOMÓW BRASSICA ..................................................... 7
1.3.1. Lokalizacja sekwencji powtarzalnych z zastosowaniem metody FISH ................... 8
1.3.2. Lokalizacja genów rRNA ...................................................................................... 9
1.4. EPIGENETYCZNE MODYFIKACJE CHROMATYNY......................................................... 10
1.4.1. Metylacja DNA ................................................................................................... 11
1.4.1.1. Technika MSAP (Methylation Sensitive Amplification Polymorphism) ............ 13
1.4.2. Modyfikacje histonów ......................................................................................... 16
1.4.2.1. Metylacja histonów ........................................................................................ 17
1.4.2.2. Acetylacja histonów ....................................................................................... 18
1.4.2.3. Fosforylacja histonów .................................................................................... 19
1.4.3. Metylacja DNA i modyfikacje histonów remodeling chromatyny .................. 20
1.4.4. Rola modyfikacji epigenetycznych w organizmach roślinnych ............................. 21
1.4.4.1. Regulacja procesów związanych z rozwojem u roślin ..................................... 21
1.4.4.2. Wpływ czynników stresowych na modyfikacje chromatyny............................ 22
1.5. GENETYCZNE I EPIGENETYCZNE MODYFIKACJE U ROŚLIN ALLOPOLIPLOIDALNYCH ... 24
1.5.1. Powstawanie i rodzaje allopoliploidów ................................................................ 24
1.5.2. Genetyczne modyfikacje w genomach allopoliploidalnych .................................. 26
1.5.3. Epigenetyczne modyfikacje w genomach allopoliploidalnych .............................. 28
1.5.4. Rearanżacje chromosomowe w genomach poliploidalnych .................................. 31
2. CEL PRACY ............................................................................................................... 33
3. MATERIAA I METODY ............................................................................................ 35
3.1. MATERIAA ROŚLINNY ............................................................................................... 35
3.2. TRAKTOWANIE I UTRWALANIE MATERIAAU .............................................................. 36
3.3. WYKONYWANIE PREPARATÓW ................................................................................. 37
3.3.1. Przygotowanie preparatów do immunobarwień modyfikacje histonów .............. 37
3.3.2. Przygotowanie preparatów do FISH i immunobarwień - metylacja DNA ............. 37
3.4. IMMUNOBARWIENIA ................................................................................................. 38
3.4.1. Analiza wzoru modyfikacji histonów i metylacji DNA ........................................ 38
3.5. FLUORESCENCYJNA HYBRYDYZACJA IN SITU (FISH) ................................................. 40
3.5.1. Znakowanie DNA metodą PCR ........................................................................... 40
Spis treści
3.5.2. Znakowanie DNA metodą nick-translacji ............................................................ 41
3.5.3. Procedura FISH ................................................................................................... 41
3.5.4. Płukania pohybrydyzacyjne ................................................................................. 42
3.5.5. Detekcja i amplifikacja sygnałów ........................................................................ 43
3.6. IZOLACJA CAAKOWITEGO GENOMOWEGO DNA METOD MIKRO-CTAB .................. 43
3.6.1. Pomiar koncentracji i czystości wyizolowanego DNA ......................................... 44
3.7. ANALIZA POZIOMU METYLACJI DNA Z WYKORZYSTANIEM TECHNIKI MSAP
(METHYLATION SENSITIVE AMPLIFICATION POLYMORPHISM) .................................. 44
3.7.1. Reakcje restrykcji z użyciem enzymów metylowrażliwych .................................. 45
3.7.2. Reakcje ligacji adaptorów do miejsc restrykcyjnych ............................................ 46
3.7.3. Preamplifikacja i amplifikacja selektywna fragmentów DNA ............................. 46
3.7.4. Wizualizacja produktów amplifikacji selektywnej ............................................... 47
3.8. IZOLACJA DNA PLAZMIDOWEGO (CENTBR1 I CENTBR2) Z KULTUR BAKTERYJNYCH . 48
3.9. REJESTRACJA OBRAZÓW W MIKROSKOPIE FLUORESCENCYJNYM, KONFOKALNYM I
CYTOMETRZE OBRAZOWYM ...................................................................................... 49
3.10. SKAAD ROZTWORÓW WYKORZYSTYWANYCH W BADANIACH.................................. 50
4. WYNIKI ...................................................................................................................... 53
4.1. TYPY JDER INTERFAZOWYCH OBSERWOWANYCH U GATUNKÓW BRASSICA .............. 53
4.2. LOKALIZACJA SEKWENCJI 25S, 5S rDNA ORAZ SEKWENCJI CENTROMEROWYCH
CENTBR1 I CENTBR2. .............................................................................................. 54
4.2.1. Lokalizacja sekwencji 5S i 25S rDNA w chromosomach metafazowych u form
uprawnych i RC gatunków Brassica .................................................................... 54
4.2.2. Sekwencje centromerowe CentBr1 i CentBr2 w chromosomach metafazowych i
jądrach interfazowych ......................................................................................... 55
4.3. ANALIZA POZIOMU METYLACJI DNA Z WYKORZYSTANIEM TECHNIKI MSAP ............ 57
4.3.1. Kontrola jakości i koncentracji wyizolowanego DNA .......................................... 58
4.3.2. Reakcje restrykcji z użyciem enzymów MspI i HpaII........................................... 59
4.3.3. Reakcje amplifikacji selektywnej oraz analiza wzoru prążkowego ....................... 61
4.4. WZÓR METYLACJI DNA ........................................................................................... 65
4.4.1. Wzór metylacji DNA w chromosomach metafazowych ....................................... 65
4.4.2. Wzór metylacji DNA w jądrach interfazowych .................................................... 66
4.4.3. Wzór metylacji DNA w chromosomach pachytenowych...................................... 67
4.5. WZÓR METYLACJI HISTONU H3 ................................................................................ 68
4.5.1. Dimetylacja H3K4............................................................................................... 68
4.5.2. Dimetylacja H3K9............................................................................................... 69
4.5.3. Trimetylacja H3K9.............................................................................................. 69
4.6. WZÓR ACETYLACJI HISTONÓW H4 I H3..................................................................... 70
Spis treści
4.6.1. Acetylacja H4K5 ................................................................................................. 70
4.6.2. Acetylacja H4K16 ............................................................................................... 71
4.6.3. Acetylacja H3K18 ............................................................................................... 71
4.7. ANALIZA WZORU ACETYLACJI HISTONÓW H4 I H3 W CYTOMETRII OBRAZOWEJ ........ 72
4.7.1. Acetylacja H4K5 ................................................................................................. 72
4.7.2. Acetylacja H4K16 ............................................................................................... 74
4.7.3. Acetylacja H3K18 ............................................................................................... 75
4.8. PODSUMOWANIE& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & ... 76
5. DYSKUSJA ................................................................................................................. 78
5.1. GENY rRNA JAKO MARKER CHROMOSOMÓW ............................................................ 78
5.2. SEKWENCJE CENTROMEROWE................................................................................... 80
5.3. REMODELING CHROMATYNY .................................................................................... 82
5.3.1.Metylacja DNA .................................................................................................... 83
5.3.2.Modyfikacje histonów .......................................................................................... 86
6. WNIOSKI .................................................................................................................... 91
7. STRESZCZENIE ........................................................................................................ 93
8. LITERATURA ............................................................................................................ 95
Wykaz skrótów stosowanych w pracy 1
WYKAZ SKRÓTÓW STOSOWANYCH W PRACY
AA - akrylamid/bisakrylamid
AA - utrwalacz (kwas octowy z alkoholem metylowym 1:3)
ABA - kwas abscysynowy
APS - nadsiarczyn amonu
BAC - (ang. bacterial artificial chromosome) sztuczny chromosom
bakteryjny
BSA - bovine albumin serum
CLF - (ang. Curly Leaf), gen regulujący zakwitnienie
CMT3 - chromometylotransferaza histonów
C-TAB - N-cetylo-N,N,N-trimetyloaminowy bromek
DDM1 - (ang. Decrease in DNA Methylation), białko ATP - zależne
DAPI - 4`-6-diamidyno-2-fenyloindol
dNTP - deoksyrybonukleotyd (5`-trifosforan)
DS - siarczan dekstranu
EDTA - (ang. ethylenediaminetetraacetic acid) kwas wersenowy (kwas
etylenodiaminoczterooctowy)
FISH - (ang. fluorescence in situ hybridization) fluorescencyjna hybrydyzacja
in situ
FITC - (ang. fluorescein isothiocyanate) izotiocyjanian fluoresceiny
FLC - (ang. Flowering Locus C), gen kontrolujący zakwitanie represor
kwitnienia
HDAC - deacetylaza histonów
HAT - acetylotransferaza histonów
H3K4me2 - Anti-dimetyl-histone H3 (Lys4), dimetylacja lizyny 4. histonu H3
H3K9me2 - Anti-dimetyl-histone H3 (Lys9), dimetylacja lizyny 9. histonu H3
H3K9me3 - Anti-trimetyl-histone H3 (Lys9), trimetylacja lizyny 9. histonu H3
H4K5ac - Anti-acetyl-histone H4 (Lys5), acetylacja lizyny 5. histonu H4
H3K18ac - Anti-acetyl-histone H3 (Lys18), acetylacja lizyny 18. histonu H3
H4K16ac - Anti-acetyl-histone H4 (Lys16), acetylacja lizyny 16. histonu H4
Wykaz skrótów stosowanych w pracy 2
MBD - (ang. Methyl-Binding Protein), białko wiążące się z zmetylownym
DNA
MET1 - metylotransferaza histonów
MSAP - Methylation Sensitive Amplification Polymorphism
PBS - bufor fosforanowy
PCR - (ang. polymerase chain reaction) reakcja łańcuchowa polimerazy
RC-PCR - ang. Real-Time PCR
RC - Rapid Cycling Brassica
rDNA - (ang. ribosomal DNA) rybosomowy DNA (45S rDNA kodujące geny
18-5,8-26S rRNA)
RFP - (ang Ring Finger Protein), czynnik transkrypcyjny
RNaza - rybonukleaza
rpm - (ang. revolutions per minute) obroty na minutę
SDS - dodecylosiarczan sodu
SSC - bufor solankowy
SSS DNA - (ang. sheared salmon sperm DNA), blokujące DNA
SWI/SNF - (ang. SWItch/Sucrose NonFermentable), ATP zależny kompleks
remodelujący chromatynę
TBE - bufor do elektroforezy: tris, kwas borowy, EDTA
TE - bufor TE (tris-HCl, EDTA)
VRN - (ang. Vernalization), gen regulujący proces wernalizacji
5 mC - 5-metylocytozyna
Wstęp 3
1. WSTP
1.1. CHARAKTERYSTYKA GATUNKÓW BRASSICA
Gatunki z rodzaju Brassica znajdują szerokie zastosowanie w przemyśle
spożywczym jako rośliny oleiste, warzywa oraz przyprawy. Rodzaj Brassica
obejmuje ok. 100 gatunków pochodzących z obszaru śródziemnomorskiego oraz
z Eurazji (POLAKOWSKI, 1995). Analizowane w pracy uprawne formy B. oleracea,
B. rapa i B. napus stanowią ważną grupę roślin o bardzo dużym znaczeniu
ekonomicznym i agronomicznym na całym świecie. Jednym z najczęściej
uprawianych gatunków w klimacie umiarkowanym jest kapusta warzywna -
B. oleracea. Wytworzyła ona bardzo dużą liczbę różniących się między sobą
form, np.: kalafior, brokuł, czy kalarepa. Analizowana w pracy odmiana kapusta
głowiasta (B. oleracea var. capitata) charakteryzuje się gładkimi liśćmi
i twardymi główkami. Może występować jako kapusta biała lub czerwona.
Kolejnym badanym w pracy gatunkiem jest rzepa jadalna B. rapa (syn.
campestris, var. rapa). Posiada ona korzeń zgrubiały, łodygę wzniesioną, ku
górze rozgałęziającą się i pierzastodzielne liście. Kapusta rzepak B. napus (var.
biennis, rzepak ozimy) jest gatunkiem szeroko uprawianym w strefie klimatu
umiarkowanego i stanowi jedną z najważniejszych roślin oleistych w Polsce.
Charakteryzuje się łodygą wzniesioną i gałęzistą, natomiast liście mają
sinozielony kolor i są pierzastosieczne lub ząbkowane. Owocem
charakterystycznym dla kapustowatych jest łuszczyna. Rośliny z rodzaju Brassica
mają kwiaty żółte lub białe (POLAKOWSKI, 1995) oraz charakterystyczne małe,
koliste i ciemno-brunatne nasiona (TACIK, 1985).
W badaniach wykorzystywano również formy rapid cycling RC wyżej
opisanych gatunków Brassica. Pierwsze rośliny RC uzyskano w latach
sześćdziesiątych, natomiast w 1970 roku Paul Williams z Uniwersytetu Wisconsin
- Madison rozpoczął tworzenie kolekcji nasion sześciu gatunków Brassica:
Wstęp 4
B. oleracea, B. nigra, B. rapa, B. juncea, B. carinata i B. napus. Na drodze
selektywnej uprawy udało się wyodrębnić spośród każdego gatunku, osobniki
charakteryzujące się krótkim cyklem życiowym - od 35 (B. rapa) do 60 dni
(B. oleracea), małymi rozmiarami oraz wysoką liczbą nasion w każdym
pokoleniu. Obecnie, formy RC stanowią cenny materiał w badaniach biologii
molekularnej, ze względu na krótki cykl życiowy, ale również dlatego, że formy
RC posiadają swoje odpowiedniki w komercyjnie dostępnych formach uprawnych
(HIMELBLAU I IN., 2004).
1.2. POCHODZENIE I EWOLUCJA GATUNKÓW BRASSICA
Gatunki Brassica ze względu na wzajemne pokrewieństwa między
gatunkami diploidalnymi i allotetraploidalnymi, stanowią interesujący obiekt
badawczy do analiz genetycznych, cytogenetycznych czy też porównawczych
analiz genomów. U (1935) ustalił, iż w wyniku krzyżowania dwóch odpowiednich
gatunków o diploidalnej liczbie chromosomów (B. oleracea, B. rapa, B. nigra),
powstały trzy gatunki allotetraploidalne: B. juncea (2n=4x=36; genom AB),
B. carinata (2n=4x=34; genom BC) oraz B. napus (2n=4x=38; genom AC).
Zależności filogenetyczne między tymi gatunkami U przedstawił w postaci
trójkąta. Trójkąt ten został opracowany na podstawie analiz cytologicznych,
uwzględniających zachowanie się chromosomów w mejozie. Pózniejsze badania
potwierdziły poprawność teorii pochodzenia gatunków allotetraploidalnych,
przedstawionej przez U (SONG I IN., 1991; CHENG I IN., 1994; PARKIN I IN., 1995;
TRUCO I IN., 1996).
Istnieje kilka teorii wyjaśniających ewolucję i pokrewieństwo
filogenetyczne między gatunkami Brassica. CHEN I HENEEN (1991) założyli, że
podstawową liczbą chromosomów u diploidalnych gatunków Brassica jest x=3.
Hipotezę tę sformułowano, w oparciu o badania przeprowadzone na B. oleracea
o n=9. Założono, że genom ten powstał przez potrojenie podstawowej liczby
chromosomów u diploidalnych gatunków Brassica o x=3. Inną teorię
o pochodzeniu i liczbie chromosomów u gatunków Brassica przedstawił
LAGERCRANTZ (1998). Założył on, że diploidalne gatunki z rodzaju Brassica
wyewoluowały od wspólnego, heksaploidalnego przodka. Arabidopsis posiada
Wstęp 5
strukturę genomu, odpowiadającą hipotetycznemu genomowi diploidalnemu,
który mógł tworzyć owego przodka. Model zaproponowany przez Lagercrantza
zakłada, że linie ewolucyjne diploidalnych Brassica oddzieliły się od linii
Arabidopsis i przeszły triplikację genomu.
Ostatnie badania molekularne sugerują pojawienie się w trakcie ewolucji
współczesnych gatunków Brassica dwóch linii rozwojowych: linii
oleracea/rapa i linii nigra , dowodów na to dostarczają badania YANG A I
INNYCH (2002), prowadzone z wykorzystaniem niekodujących sekwencji DNA
chloroplastowego.
Od momentu zsekwencjonowania genomu Arabidopsis thaliana w 2000
roku rozpoczął się nowy etap badań, polegający na identyfikacji i badaniu funkcji
genów, analizie porównawczej genomów różnych gatunków, zwłaszcza tych
blisko spokrewnionych z Arabidopsis. Gatunek ten ma szczególne znaczenie
w badaniach genomów gatunków Brassica, należących do tej samej rodziny, co
Arabidopsis. LYSAK I INNI (2006) na podstawie porównania map genetycznych
między A. thaliana (n=5) i A. lyrata (n=8) jak również między A. thaliana
i Capsella rubella (n=8) zasugerowali, iż ancestralny kariotyp Arabidopsis
posiadał 8 chromosomów i strukturę genomu prawie identyczną, jaką posiadają
dwa współczesne gatunki A. lyrata i C. rubella. Na podstawie porównawczego
malowania chromosomów z wykorzystaniem kontigów klonów BAC
wywnioskowano, że kariotyp A. thaliana powstał z kariotypu ancestralnego przez
dwie wzajemne translokacje, trzy fuzje chromosomów i przynajmniej trzy
inwersje. W tym samym roku SCHRANZ I INNI (2006), na podstawie mapowania
porównawczego między A. thaliana oraz B. rapa, zidentyfikowali 24
konserwatywne, genomowe bloki, których porządek i orientacja były oparte na
ich pozycji w kariotypie ancestralnym Arabidopsis. W genomie B. rapa część
bloków zostało ztriplikowanych i często występowały one w orientacji
odwróconej w porównaniu do kariotypu ancestralnego np.: blok R
w chromosomie N2, N3 i N10 lub blok U w chromosomie N1, N3 i N8. Wyniki
tych badań potwierdzają teorię o triplikacji genomu ancestralnego gatunków
Brassica i pochodzeniu tych gatunków od heksaploidalnego ancestora
(ZIOLKOWSKI I IN., 2006). W wyniku heterologicznej hybrydyzacji z kontigami
klonów BAC, obejmujących miejsca rekombinacji, z chromosomu 2 A. thaliana
ujawniono w chromosomach B. oleracea 3 kopie tego regionu. Hybrydyzacja
Wstęp 6
wskazywała na to, że region z dwoma miejscami rekombinacji był
konserwatywny w genomie Arabidopsis i Brassica. ZIÓAKOWSKI I INNI (2006), na
podstawie tych badań, zaproponowali schemat ewolucji genomów Arabidopsis
i Brassica. Najpierw, ze wspólnego pnia ewolucyjnego Arabidopsis/Brassica
wyodrębnił się diploidalny przodek I Brassica, który przeszedł poliploidyzację, co
doprowadziło do uformowania się tetraploida I. Następnie doszło do rozejścia się
linii ewolucyjnych prowadzących do przodka Arabidopsis oraz przodka II
Brassica. Ostatecznie synteza tetraploida I i diploida II doprowadziła do
uformowania heksaploida III, który na skutek wtórnej diploidyzacji przekształcił
się w diploidalny gatunek B. oleracea. Teorię triplikacji genomu Brassica
potwierdzają także badania przeprowadzone przez LYSAKA I INNYCH (2007).
Dowody na dynamiczny i trwający proces diploidyzacji u gatunków
allopoliploidalnych Brassica przedstawili YANG I INNI (2006). Opisali oni
konsekwencje procesu diploidyzacji, stosując do analizy porównawczej genomu
A. thaliana i B. rapa sekwencje BAC, zawierające lokus genu FLC (Flowering
Locus C). Cztery z tych klonów BAC były homeologiczne do regionu 3,0 - 3,35
Mpz chromosomu piątego u A. thaliana i zostały nazwane u Brassica paralogami:
A (BrA), B (BrB), C (BrC) i C (BrC ). Autorzy oszacowali czas od rozejścia się
paralogicznych grup sprzężeń poprzez obliczenie tempa synonimicznych
substytucji nukleotydów Ks. Czas rozejścia się gatunków Brassica-Arabidopsis
określono na 17 - 18 milionów lat temu, natomiast triplikacja w genomie Brassica
miała miejsce 13 - 17 milionów lat temu. Wartość Ks między BrC i BrC była
bardzo niska i wynosiła 0,02 wskazując, że geny te były duplikowane niedawno
0,8 miliona lat temu.
Rok pózniej, YANG INNI (2007) zidentyfikowali 5 rodzin
retrotranspozonów TRIM (Terminal Repeat retrotranspozon In Miniature),
cztery u gatunków Brassica i jedną u Arabidopsis. Badano polimorfizm miejsc
insercji tych elementów w obrębie gatunków z rodziny Brassiceae, określono
także czas ich insercji. Autorzy sugerują, że elementy TRIM odgrywają aktywną
rolę w rearanżacjach zduplikowanych genów w genomie Brassica, a elementy
transpozonowe aktywowane po rozejściu się Arabidopsis - Brassica mogły pełnić
ważną rolę w ewolucji zduplikowanych genów.
Wstęp 7
1.3. CYTOGENETYCZNE BADANIA GENOMÓW BRASSICA
Cechą charakterystyczną wszystkich omawianych w pracy gatunków są
niewielkie rozmiary genomu jądrowego, wynoszące dla 1C DNA od 0,54 pg
u B. rapa i 0,71 pg u B. oleracea do 1,15 pg u B. napus (JOHNSTON I IN., 2005).
Mitotyczne chromosomy metafazowe gatunków Brassica są liczne i małe: 1,5
3,5 �m (HASTEROK I MAAUSZYCSKA, 1997) oraz charakteryzują się bardzo małym
zróżnicowaniem morfologicznym, co znacznie utrudnia badania cytogenetyczne.
Zastosowanie w badaniach tak małych chromosomów metod prążkowych
(OLSZEWSKA, 1981), nie ujawnia specyficznego wzoru prążkowego, gdyż często
wybarwieniu ulega tylko heterochromatyna przycentromerowa, jak to ma miejsce
w przypadku zastosowania techniki C - prążków u gatunków Brassica. Natomiast
wykorzystanie fluorescencyjnych barwień różnicowych, np.: CMA3/DAPI do
małych chromosomów, daje możliwość zidentyfikowania między innymi
rybosomalnego DNA, co wykazano dla B. napus (HASTEROK I MAAUSZYCSKA,
1997). Prawdziwy przełom w technikach cytogenetyki molekularnej stanowiło
wprowadzenie do badań nad strukturą genomu fluorescencyjnej hybrydyzacji
in situ (FISH).
Hybrydyzacja in situ jest metodą, która pozwala na fizyczną lokalizację
genów i różnych sekwencji DNA w chromosomach i jądrach interfazowych.
Technika ta polega na łączeniu wyznakowanego DNA sondy, z sekwencjami
komplementarnymi w chromosomie (MAAUSZYCSKA, 1995). W zależności od
rodzaju sondy i preparatu chromosomowego, można wyróżnić następujące typy
hybrydyzacji: FISH z jedną lub wieloma (mFISH) różnie wyznakowanymi
sondami; PRINS (Primed in situ hybridization) z wykorzystaniem termostabilnej
polimerazy do wydłużenia DNA w miejscu hybrydyzacji; GISH (Genomic in situ
hybridization) z wykorzystaniem sondy w postaci całkowitego, genomowego
DNA; oraz EDF-FISH (z ang. Extended DNA Fibers, rozciągnięte włókna
chromatynowe) (PARRA I WINDLE, 1993).
Wstęp 8
1.3.1. Lokalizacja sekwencji powtarzalnych z zastosowaniem metody FISH
Wykorzystując technikę FISH, zlokalizowano wiele niekodujących
sekwencji tandemowo powtórzonych. Jedną z nich jest telomerowe DNA,
wyizolowane z A. thaliana, które hybrydyzuje z telomerami chromosomów
różnych gatunków (SCHWARZACHER I HESLOP-HARRISON, 1991; SCHUBERT, 1992;
HAJDERA I IN., 2003). FISH stosowana jest także, w badaniach nad lokalizacją
DNA centromerowego u roślin. Badania molekularne DNA centromerowego
u roślin wyższych zostały zapoczątkowane w latach osiemdziesiątych na
modelowej roślinie Arabidopsis thaliana. Centromerową lokalizację sekwencji
180 pz (klon pAL1) metodą FISH u roślin, po raz pierwszy wykazali
MALUSZYNSKA I HELSOP-HARRISON (1991). W pózniejszych badaniach FRANSZ I
INNI (2000) wskazali, że centralną domenę w centromerach u Arabidopsis
stanowią tandemowe układy monomerów 180 pz, między którymi znajdują się
kopie retrotranspozonu Athila (grupa Ty3-gypsy). Sekwencje centromerowo -
specyficzne zidentyfikowano także u gatunków Brassica (HARRISON I HESLOP-
HARRISON, 1995). Z tandemowych sekwencji centromerowych o długości 360 pz
uzyskano dwa klony: pBoKB1 u B. oleracea i pBcKB4 u B. rapa. U B. oleracea
klon pBoKB1 hybrydyzował z 7 parami chromosomów homologicznych,
podobnie jak klon pBcKB4. Natomiast, u B. rapa klon pBcKB4 dawał sygnały
w 7 (wysoka siła płukań) lub 9 parach chromosomów (niska siła płukań), a z
klonem pBoKB1 uzyskano tylko 6 sześć sygnałów. U B. napus liczba sygnałów
obu sekwencji była równa liczbie chromosomów, przy czym obserwowano mniej
sygnałów dla sondy pBoKB1. Wyniki tych badań wskazują, że sekwencje
centromerowe mogą być genomowo - specyficzne (OLSZEWSKA, 2003).
Dystrybucję centromerowych sekwencji powtarzalnych - CentBr1
i CentBr2 w chromosomach B. rapa, określili LIM I INNI (2005). Użyli oni dwóch
klonów BAC z B. rapa: KBrH001B09 zawierający sekwencję CentBr1
i KBrH001E07 zawierający sekwencję CentBr2, do lokalizacji powtórzeń
centromerowych w jądrach interfazowych, chromosomach mitotycznych
i mejotycznych. Natomiast, w roku 2007 do wyników badań nad centromerami
u gatunków Brassica dołączono także lokalizację centromerowo - specyficznych
Wstęp 9
retrotranspozonów (CRB) i przycentromerowo - specyficznych retrotranspozonów
(PCRBr) (LIM I IN., 2007).
1.3.2. Lokalizacja genów rRNA
Geny rRNA występują tandemowo w wielu powtórzeniach, co umożliwia
ich stosunkowo łatwą lokalizację w chromosomach przy wykorzystaniu techniki
FISH. W genomach obecne są dwa rodzaje rDNA: 45S (18S-5,8S-26S) i 5S
rDNA. Sekwencje te mogą być zlokalizowane w genomie niezależnie od siebie,
na różnych chromosomach, w jednym locus lub w wielu loci (MALUSZYNSKA I
IN., 1998), bądz mogą występować wspólnie na jednym chromosomie, jak
u A. thaliana (MURATA I IN., 1997), czy B. rapa (HASTEROK I IN., 2001).
Występowanie genów 45S rRNA jest na ogół związane z przewężeniem wtórnym
i obszarem satelity, natomiast sekwencja 5S rDNA może występować w różnych
miejscach na chromosomie.
Wykorzystując technikę FISH określono liczbę i położenie genów rRNA
u różnych gatunków roślin: Hordeum vulgare (LEITCH I HESLOP-HARRISON,
1993), Beta vulgaris (SCHMIDT I IN., 1994), Secale cereale (CUADRADO I IN.,
1995), Amaranthus (KOLANO I IN., 2001) oraz u gatunków Brassica (HASTEROK I
MALUSZYNSKA, 2000A; HASTEROK I IN., 2001; HASTEROK I IN., 2006). Z badań nad
tymi ostatnimi wynika, że liczba loci rDNA u gatunków allotetraploidalnych jest
zwykle mniejsza, niż suma liczby loci u odpowiednich diploidalnych gatunków
ancestralnych. Może to świadczyć o zajściu licznych przemian chromosomowych
podczas ewolucji tych gatunków, które doprowadziły do redukcji liczby loci
genów rRNA u poliploidów (MALUSZYNSKA I HESLOP-HARRISON, 1993).
Geny rRNA cechują się konserwatywnym charakterem sekwencji
kodujących, dlatego wykazują wysoki stopień homologii między różnymi
gatunkami (MAAUSZYCSKA, 1999). Jednakże długość przerywnikowych jednostek
nietranskrybowanych rDNA i liczba kopii nawet w obrębie danego locus może
być zróżnicowana (SCHUBERT, 1984; HASTEROK I MALUSZYNSKA, 1998).
W wyniku różnych rearanżacji chromosomowych mających miejsce w toku
ewolucji, może dochodzić do polimorfizmu liczby i występowania loci genów
rRNA. Taki polimorfizm obserwowany był u wielu gatunków roślin: żyta
Wstęp 10
(CUADRADO I JOUVE, 1997), ryżu (SHISHIDO I IN., 2000), a także u gatunków
Brassica (HASTEROK I IN., 2001; HASTEROK I IN., 2006).
Geny rRNA nie są jednak wystarczającymi markerami dla identyfikacji
wszystkich chromosomów u gatunków Brassica. W tym celu coraz częściej
wykorzystywane są klony BAC, które użyte, jako sonda we fluorescencyjnej
hybrydyzacji in situ, umożliwiają fizyczne mapowanie zawartych w nich
sekwencji unikatowych. Klony BAC wykorzystywane są, jako chromosomowo -
specyficzne markery cytogenetyczne oraz służą do konstruowania bibliotek DNA
u różnych gatunków: A. thaliana (CHOI I IN., 2000), Hordeum vulgare (YU I IN.,
2000), B. rapa (PARK I IN., 2005), czy Brachypodium (HASTEROK I IN., 2006A).
Kilkanaście klonów BAC niosących sekwencję tego samego chromosomu
zastosowano do tworzenia chromosomowo - specyficznych sond DNA
i malowania chromosomów u A. thaliana (LYSAK I IN., 2001; 2003; 2006).
Badania struktury i ewolucji genomów gatunków Brassica, w których
wykorzystywane są klony BAC, w dużej mierze oparte są na porównawczym
mapowaniu fizycznym pomiędzy Arabidopsis i Brassica (patrz podrozdział 1.2).
1.4. EPIGENETYCZNE MODYFIKACJE CHROMATYNY
Prawidłowe funkcjonowanie genomu kontrolowane jest na kilku poziomach:
genetycznym, związanym z DNA, poprzez wiązanie czynników
transkrypcyjnych do promotorów genów, które ulegają transkrypcji,
epigenetycznym, czyli tzw. dziedzicznym wpływie na aktywność
określonych genów bez zmiany w sekwencji nukleotydów w łańcuchu
DNA. Epigenetyczna kontrola aktywności lub wyciszania genów odbywa
się między innymi poprzez mechanizmy metylacji DNA i modyfikacji
histonów korowych.
na poziomie struktury chromatyny, której stopień upakowania wpływa na
dostępność czynników transkrypcyjnych do promotorów genów, a co za
tym idzie na aktywność tychże genów (JASENCAKOVA I IN., 2003).
DNA w komórce występuje w postaci związanej z białkami histonowymi
i niehistonowymi (głównie enzymatycznymi) oraz niewielką ilością RNA,
tworząc chromatynę. Podstawową jednostką strukturalną chromatyny jest
Wstęp 11
nukleosom. Składa się on z rdzenia histonowego o średnicy 10 nm, w skład
którego wchodzą po dwie kopie każdego z białek histonowych: H2A, H2B, H3,
H4. Na trzon histonowy nawinięte jest DNA o długości około 150 pz. Pomiędzy
nukleosomami występuje tzw. DNA łącznikowy o długości od 10 do 95 pz.
Struktura nukleosomowa jest stabilizowana przez łącznikowy histon H1 (LUGER,
2003). Modyfikacje epigenetyczne chromatyny związane są z metylacją DNA
oraz z różnymi modyfikacjami potranslacyjnymi histonów. Opisane zmiany
epigenetyczne wpływają na stopień kondensacji chromatyny. Euchromatyna
stanowi dominujący składnik chromatyny, cechuje się luzną strukturą, jej DNA
replikuje we wczesnej i środkowej fazie S cyklu komórkowego, charakteryzuje
się brakiem lub niskim poziomem metylacji DNA oraz nadwrażliwością na
działanie DNaz-y (OLSZEWSKA, 2007). Euchromatyna obejmuje sekwencje
kodujące, jest aktywna transkrypcyjnie, w przeciwieństwie do wysoce
zkondensowanej heterochromatyny, która zawiera głównie sekwencje
powtarzalne i jest zazwyczaj nie aktywna transkrypcyjnie (VOLKOV I IN., 2006).
Heterochromatynę dzieli się na dwie frakcje:
konstytutywną, której DNA obejmuje sekwencje wysoko powtarzalne,
retroelementy i transpozony DNA. Jej dekondensacja następuje tylko
podczas replikacji DNA, podczas póznej fazy S cyklu komórkowego.
Heterochromatynę konstytutywną stanowią głównie regiony
przycentromerowe. W jądrze interfazowym gatunków, o stosunkowo
małej zawartości DNA, heterochromatyna konstytutywna widoczna jest
w postaci chromocentrów (Olszewska, 2007).
fakultatywną, nazywaną także skondensowaną euchromatyną, która
powstaje z euchromatyny w wyniku procesu zwanego
heterochromatynizacją (OLSZEWSKA, 2007).
1.4.1. Metylacja DNA
Metylacja DNA to przykład najczęściej występującej u roślin wyższych
modyfikacji epigenetycznej. Polega ona na kowalencyjnym przyłączeniu grupy
metylowej do węgla w pozycji 5 reszty cytozynowej (BENDER, 2004). Proces ten
katalizowany jest przez enzymy z grupy metylotransferaz. Metylacja DNA
u roślin może zachodzić w sekwencjach symetrycznych CG i CNG (gdzie N to
Wstęp 12
dowolny nukleotyd), bądz asymetrycznych CHH (gdzie H = A, C, T). Zawartość
metylowanej cytozyny u roślin stanowi od 5 do 25% całkowitej ilości cytozyny,
jest ona znacznie wyższa niż u zwierząt (VOLKOV I IN., 2006).
Metylacja DNA ma miejsce po procesie replikacji i jest przekazywana na
potomną nić przez metylotransferazy rozpoznające hemimetylowane DNA.
U Arabidopsis zidentyfikowano 10 genów kodujących metylotransferazy.
U gatunku tego wyróżnia się 3 klasy metylotransferaz: MET1, CMT i DRM.
MET1 homologiczna do metylotransferazy ssaków - DNMT1, jest
odpowiedzialna za metylację zachowawczą w czasie podziałów komórek.
W wyniku mutacji w genie kodującym MET1 następuje utrata metylacji w obrębie
sekwencji CG i ma ona skutki letalne dla komórki (FUCHS I IN., 2006). Geny
MET1 ulegają ekspresji w tkankach merystematycznych, wegetatywnych oraz
generatywnych (VOLKOV I IN., 2006). Zidentyfikowano kilka homologów MET1,
między innymi u: marchwi, grochu, tytoniu, pomidora, kukurydzy czy też ryżu
(FINNEGAN I KOVAC, 2000; NAKANO I IN., 2000; TEERAWANICHPAN I IN., 2004).
Za metylację zachowawczą sekwencji CNG i CHH odpowiedzialna jest
metylotransferaza CMT3. Klasa tych enzymów charakteryzuje się obecnością
chromodomeny, zlokalizowanej wewnątrz konserwatywnej katalitycznej domeny
metylotransferazy. U mutantów cmt3 kukurydzy obserwowano znaczne obniżenie
poziomu metylacji w sekwencjach CNG, podczas gdy nie obserwowano redukcji
poziomu metylacji DNA w układzie CG (FINNEGAN I KOVAC 2000).
Białka DRM są analogami metylotransferaz ssaków - DNMT3
i odpowiadają za metylację de novo (CAO I JACOBSEN, 2002). Zawierają one
domeny ubikwitynowe, które mogą brać udział w interakcjach białko-białko.
W procesie metylacji DNA aktywnie uczestniczą także ATP zależne
kompleksy remodelujące chromatynę, które są homologami SWI2/SNF2
(JEDDELOH I IN., 1999). U Arabidopsis wykryto ponad 40 takich kompleksów
(HSIEH I FISCHER, 2005). Wśród nich znajduje się białko DDM1, które jest
zaangażowane między innymi w utrzymanie metylacji DNA.
Liczne badania w kontekście zmian poziomu metylacji DNA prowadzone
są z wykorzystaniem mutantów Arabidopsis, które charakteryzują się mutacjami
w genach kodujących wymienione metylotransferazy. U tych mutantów obniżenie
poziomu metylacji DNA często wiąże się z aktywacją różnych elementów
ruchomych. LIPPMAN I INNI (2003) analizowali aktywację 6 elementów
Wstęp 13
ruchomych u mutantów ddm1, met1 i cmt3. Okazało się, że u ddm1 i met1
aktywacja wszystkich 6 elementów, związana była z utratą metylacji DNA
i metylacji lizyny 9. histonu H3 oraz metylacją lizyny 4. histonu H3. Badano
także, czy aktywność transkrypcyjna tych elementów zostanie utrzymana
w pokoleniu F1, powstałym ze skrzyżowania wstecznego mutanta i formy dzikiej.
U wymienionych powyżej mutantów wszystkie analizowane elementy ruchome
pozostały aktywne w pokoleniu F1. Odmiennie sytuacja kształtowała się
w przypadku mutanta cmt3, u którego aktywacji podlegał tylko retrotranspozon
ATLINE1-4 i ten sam był także aktywny w pokoleniu F1. Podobne badania
u mutantów Arabidopsis przeprowadził KATO I INNI (2003). Analizowali oni
aktywność transkrypcyjną i transpozycyjną elementów CACTA1. Okazało się, że
redukcja w metylacji DNA jest wystarczająca do mobilizacji tych transpozonów.
Transkrypty CACTA wykryto u mutantów met1 i ddm1, jednakże tylko u ddm1
obserwowano wysoką częstotliwość transpozycji tego elementu. U cmt3
stwierdzono natomiast, niską częstotliwość transpozycji.
Mutanty ddm1 i met1 cechują się mniejszymi chromocentrami, co
świadczy o częściowej eliminacji heterochromatyny z tych struktur (FRANSZ I IN.,
2003). SOPPE I INNI (2002), udowodnili, że sekwencje wysoce powtarzalne, np.:
pAL1, 45S i 5S rDNA u tych mutantów kolokalizują z chromocentami, natomiast
eliminacji z chromocentrów ulegają przede wszystkim elementy ruchome, takie
jak Emi12 czy AthE1.4, które znajdują się w heterochromatynie
przycentromerowej.
1.4.1.1. Technika MSAP (Methylation Sensitive Amplification
Polymorphism)
W badaniach poziomu metylacji DNA u różnych gatunków roślin bardzo
często wykorzystywana jest technika MSAP, będąca modyfikacją metody AFLP
(Amplified Fragment Length Polymorphism). Techniki te, łączą wykorzystanie
enzymów restrykcyjnych i reakcji PCR. Standardowy protokół AFLP opiera się
na selektywnej amplifikacji części fragmentów restrykcyjnych, otrzymanych po
cięciu DNA odpowiednimi enzymami. Technika ta, obecnie jest szeroko
stosowana do tworzenia map genetycznych, a przede wszystkim do wysycania już
istniejących (NEGI I IN., 2000; LOMBARD I DELOURME, 2001; PRADHAN I IN., 2004).
W metodzie AFLP można wyróżnić cztery główne etapy: restrykcję DNA, ligację
Wstęp 14
adaptorów, preamplifikację oraz amplifikację selektywną (VOS I IN., 1995).
W pierwszym etapie przeprowadza się cięcie totalnego DNA dwoma enzymami
restrykcyjnymi: częstotnącym (najczęściej MseI) i rzadkotnącym (najczęściej
EcoRI). W technice MSAP stosuje się parę enzymów metylowrażliwych, np.:
MspI i HpaII, zamiast MseI. Enzym rzadkotnący pozostaje niezmieniony. Kolejny
etap reakcji AFLP obejmuje ligację adaptorów do powstałych po restrykcji
fragmentów DNA. Adaptorami są oligonukleotydowe odcinki DNA o arbitralnej
sekwencji, w oparciu o które konstruuje się startery do reakcji amplifikacji.
Ligacja adaptorów powoduje zanik miejsca restrykcyjnego i zabezpiecza
połączone sekwencje przed ponownym przecięciem. Wykorzystuje się dwa
rodzaje adaptorów: jeden komplementarny do miejsca cięcia dla enzymu
częstotnącego, a drugi dla enzymu rzadkotnącego (Ryc. 1). W reakcji
preamplifikacji wykorzystuje się startery komplementarne do sekwencji
adaptorów, z których przynajmniej jeden posiada dodatkowy, selektywny
nukleotyd na końcu 3 . Reakcja ta pozwala na ograniczenie liczby
amplifikowanych fragmentów DNA. Natomiast, w amplifikacji selektywnej
stosuje się startery z dwoma lub trzema selektywnymi nukleotydami, co
dodatkowo zmniejsza liczbę fragmentów amplifikowanych tak, że mogą one być
rozdzielone w żelu poliakrylamidowym. Starter komplementarny do miejsca
cięcia dla enzymu rzadkotnącego jest znakowany fluorescencyjnie (np.: IRD 800)
lub radioaktywnie, co pozwala zwizualizować część produktów amplifikacji.
W technice MSAP opisane wyżej reakcje ligacji, preamplifikacji oraz amplifikacji
selektywnej przeprowadza się według tego samego protokołu, dokonując jedynie
modyfikacji poszczególnych warunków temperaturowych w kolejnych reakcjach
amplifikacji.
Wstęp 15
Miejsce cięcia MseI
Miejsce cięcia EcoRI
Fragment restrykcyjny
AATTCCAC TCGT
GAATTC TTAA
GGTG AGCAAT
Ligacja adaptorów
Adaptor EcoRI
CTCGTAGACTGCGTACCAATTCCAC TCGTTACTCAGGACTCAT
CATCTGACGCATGGTTAAGGTC AGCAATGAGTCCTGAGTAGCAG
Adaptor MseI
Nukleotydy
selektywne
Starter EcoRI
5
GACTGCGTACCAATTCCAC
AGCAATGAGTCCTGAGTAGCAG
GAGCATCATCATCTGACGCATGGTTAAGGTC
TCGTTACTCAGGACTCATCGTC
CTCGTAGACTGCGTACCAATTCCAC
AGCAATGAGTCCTGAGTAG
5
Nukleotydy Starter MseI
selektywne
amplifikacja
Ryc. 1 Schemat reakcji AFLP (wg VOS I IN., 1995, zmienione)
Zastosowanie pary enzymów restrykcyjnych umożliwia wykrycie
metylacji obu cytozyn w sekwencji CCGG. Enzym MspI przecina tą sekwencję
w przypadku wystąpienia metylacji cytozyny wewnętrznej, natomiast enzym
HpaII dokonuje cięcia, gdy hemimetylowana jest cytozyna zewnętrzna.
Dodatkowo oba enzymy przecinają tę sekwencję w przypadku braku metylacji
obu cytozyn. W rezultacie można otrzymać następujący wzór prążkowy (Ryc. 2).
Ryc. 2 Wzór metylacji po cięciu enzymami MspI i HpaII (elipsy oznaczają
brak prążka w danym locus).
Technika MSAP jest z powodzeniem stosowana w wykrywaniu metylacji
DNA, u wielu gatunków roślin (XIONG I IN., 1999; XU I IN., 2000; SHERMAN I
TALBERT, 2002). Badania te mają głównie na celu porównanie poziomu metylacji
w pokoleniach krzyżówek dwóch form rodzicielskich, czego przykładem mogą
Wstęp 16
być badania przeprowadzone u ryżu (XIONG I IN., 1999), czy też u pszenicy
(SHERMAN I TALBERT, 2002). Często technikę tę wykorzystuje się, jako jedno
z narzędzi w badaniach procesu allopoliploidyzacji. Takie analizy
przeprowadzono u resyntetyzowanych gatunków allotetraploidalnych z rodzaju
Arabidopsis (MADLUNG I IN., 2002) i Brassica (LUKENS I IN., 2006; GAETA I IN.,
2007). Badania te wskazują na istnienie zmian w poziomie metylacji DNA
u gatunków poliploidalnych (MADLUNG I IN., 2002). U resyntetyzowanych
B. napus reakcje MSAP przeprowadzono na cDNA, wykorzystując między
innymi startery RFLP i SSR. Stwierdzono, że u B. napus część fragmentów
pochodzących od gatunków rodzicielskich uległa zanikowi, jednak utrata
fragmentu specyficznego dla jednego z rodziców u B. napus, nie była
równoważona pojawieniem się nowego fragmentu. W pracy tej pokazano
również, że metylacja de novo była charakterystyczna dla fragmentów
pochodzących z genomu B. rapa (LUKENS I IN., 2006). Podobne badania
przeprowadził GAETA I INNI (2007), analizie MSAP poddano ponad 50 linii
resytetyzowanych B. napus, a zmiany w poziomie metylacji porównywano
w przeciągu pięciu kolejnych pokoleń. Stwierdzono, iż wzór metylacji DNA
w pokoleniu S0 jest, z wyjątkiem niewielkich zmian, utrwalony w pokoleniu S5.
Technika MSAP w połączeniu z analizą ChIP (Chromatin
Immunoprecipitation) oraz RT-PCR bardzo często jest wykorzystywana
w badaniach zmian poziomu ekspresji genów u poliploidów, które są związane
między innymi z modyfikcjami epigenetycznymi (COMAI I IN., 2000; LEE I CHEN,
2001).
1.4.2. Modyfikacje histonów
Histony to małe, zasadowe białka, które są zasocjowane z jądrowym
DNA. Rdzeń każdego histonu ma postać globularnej domeny, tworzonej przez
trzy helisy, a motywy N - końcowe (ogony histonu) zawierają duże ilości
zasadowych aminokwasów, takich jak lizyna czy arginina oraz pośredniczą
w tworzeniu heterodimerów histonów w nukleosomie. Istnieje pięć klas histonów:
H1 - zwany histonem łącznikowym (bogaty w lizynę) oraz H3, H4 (bogate
w argininę), H2A, H2B - budujące rdzeń nukleosomu. N końcowe ogony
histonów są poddawane różnego rodzaju modyfikacjom potranslacyjnym:
Wstęp 17
metylacji, acetylacji, fosforylacji, a także w domenach globularnych -
ubikwitynacji. Modyfikacje te mogą dotyczyć reszt argininowych, lizynowych
oraz serynowych poszczególnych histonów (Tab. 1).
Tab. 1 Najczęściej modyfikowane aminokwasy histonów korowych
Modyfikacja
Histon
metylacja acetylacja fosforylacja ubikwitynacja
*K4, K9, K27, K9, K18, K18, *S10, S28, *Tr3,
H3 -
*R2, R17, R26 K23, Tr11
K5, K8, K12,
H4 K20, R3 S1 -
K16, K20
H2A - K5, K9 S1 K119
K5, K12, K15,
H2B - - K120
K20
* K lizyna, R arginina, S seryna, Tr - treonina
Histony to ewolucyjnie wysoko konserwatywne białka, dotyczy to
zarówno aminokwasów jak i ich kowalencyjnych modyfikacji. Mimo, iż
modyfikacjom podlegają, w większości te same aminokwasy u różnych grup
organizmów, to efekt tych zmian może mieć różny wpływ na strukturę
chromatyny. Wszystkie opisane modyfikacje zmieniają właściwości chemiczne
białek histonowych, co prowadzi do rearanżacji struktury chromatyny i wpływa
na dostępność do DNA różnego rodzaju czynników transkrypcyjnych, regulując
w ten sposób aktywność poszczególnych genów (JASENCAKOVA, 2003).
1.4.2.1. Metylacja histonów
Metylacja histonów zachodzi po ich biosyntezie i jest katalizowana przez
metylotransferazy histonów HMT, z rodziny białek SU(VAR)3-9. Dołączenie
grupy metylowej do aminokwasów wywołuje zmianę w architekturze chromatyny
i w zdolności do wiązania białek. Aminokwasy argininowe mogą podlegać mono-
lub dimetylacji, natomiast reszty lizynowe są mono-, di- i trimetylowane
(VOLKOV I INNI 2006).
Wstęp 18
Metylacja poszczególnych aminokwasów w danym histonie związana jest
z różnym stanem chromatyny (JACKSON I IN., 2004). Dla euchromatyny
charakterystyczne jest występowanie mono-, di- i trimetylowanego histonu H3
w lizynie w pozycji 4. (JASENCAKOVA I IN., 2003; FUCHS I IN., 2006), natomiast
metylowane lizyny 9. i 27. histonu H3 oraz 20. histonu H4, na ogół związane są
z heterochromatyną (FUCHS I INNI, 2006). Modyfikacje te są konserwatywnymi
wyznacznikami heterochromatyny konstytutywnej, choć obecne są również
w wyciszonej transkrypcyjnie euchromatynie (OLSZEWSKA, 2007).
Również ilość przyłączonych grup metylowych do konkretnych
aminokwasów, decyduje o stanie chromatyny. U Arabidopsis trimetylacja lizyny
9. i 27. histonu H3 oraz di- i trimetylacja lizyny 20. histonu H4 są typowe dla
euchromatyny, natomiast chromocentra są bogate w mono- i dimetylowane lizyny
9. i 27. histonu H3 oraz monometylowaną lizynę 20. w histonie H4 (FUCHS I IN.,
2006). Ostatnie badania wskazują, iż H3K27me3 u Arabidopsis związana jest
z sekwencjami regulatorowymi DNA i różnymi czynnikami transkrypcyjnymi
(ZHANG I IN., 2007). Modyfikacja ta u Arabidopsis została również wykryta
w miejscu wiązania białka LHP1, pełniącego rolę w represji transkrypcji genów
z obszaru euchromatyny (TURCK I IN., 2007).
Różnice we wzorze metylacji H3K9 u różnych gatunków mogą zależeć od
różnej zawartości jądrowego DNA, czyli jak proponuje HOUBEN I INNI (2003), są
skorelowane z wielkością genomu.
1.4.2.2. Acetylacja histonów
Modyfikacja ta powoduje rozluznienie chromatyny, wpływa na wzrost
aktywności transkrypcyjnej, przez neutralizowanie ładunku dodatniego ogonów
histonu i zmniejszanie ich powinowactwa do DNA. Enzymy katalizujące reakcję
przeniesienia grup acetylowych z acetylo-CoA, na wolne grupy aminowe lizyn
w ogonach histonów, to acetylotransferazy (HAT) (VOLKOV I INNI, 2006).
Wyróżniamy dwie grupy HAT: A jądrowe oraz B cytoplazmatyczne. Typ A
obejmuje cztery odmienne klasy HAT: rodzinę białek MIST, p300/CBP,
TAF 250 i GCN5 (CHEN I TIAN, 2007). W komórkach roślin występują również
II
enzymy HDAC katalizujące proces deacetylacji histonów. Możemy wyróżnić
trzy główne klasy tych enzymów: RPD3/HDA1, SIR2 i HD2 (PANDEY I IN., 2002;
Wstęp 19
VOLKOV I IN., 2006). Histony deacetylowane są charakterystyczne dla
heterochromatyny.
LI I INNI (2005) badali zmiany acetylacji histonów H3 i H4 u Nicotina
tabacum, podczas cyklu komórkowego. Okazało się, że poziom acetylacji
zmniejsza się w trakcie mitozy. Deacetylacja histonu H4 zaczyna się w profazie
i trwa do telofazy, wpływając na kondensację chromosomów, natomiast
deacetylacja histonu H3 zachodzi pomiędzy metafazą, a anafazą i utrzymuje się
do telofazy. U bobu stwierdzono hypoacetylację w obrębie lizyny 18. i 14. histonu
H3 w rejonach heterochromatyny, zbudowanej z tandemowych powtórzeń
sekwencji Fok-I. Natomiast hyperacetylację tych aminokwasów obserwowano
w obrębie NOR (BELYAEV I IN., 1998). W jądrach interfazowych bobu
i jęczmienia najwyższy poziom acetylacji H4K5 ma miejsce w trakcie fazy S.
Zastosowanie przeciwciał skierowanych przeciwko acetylowanym lizynom 5.
i 12. histonu H4 u bobu ujawniło zróżnicowany wzór acetylacji w eu-
i heterochromatynie podczas faz G1, S i G2 cyklu komórkowego. Może to
wskazywać, że acetylacja tego histonu jest związana z procesem replikacji DNA,
gdzie do nowozreplikowanej chromatyny włączane są acetylowane izoformy
histonu H4 (JASENCAKOVA I IN., 2000).
1.4.2.3. Fosforylacja histonów
U roślin fosforylacja histonu H3 jest związana z regulacją cyklu
komórkowego (HOUBEN I IN., 2007). Zależna od cyklu komórkowego zamiana
zdekondensowanej chromatyny interfazowej w skondensowaną chromatynę
chromosomów metafazowych jest najbardziej dynamiczną modyfikacją struktury
chromatyny. Fosforylacja H3S10 i H3S28 rozpoczyna się zwykle od regionu
centromerowego podczas mitozy (GERNAND I IN., 2003), również podczas mejozy
we wczesnej profazie I od regionu centromerowego, a następnie rozprzestrzenia
się wzdłuż ramion chromosomów. U roślin monocentrycznych np.: (Secale
cereale) rozmieszczenie fosforylowanych seryn 10. i 28. różni się pomiędzy
dwoma podziałami mejotycznymi. Podczas pierwszego podziału chromosomy
posiadają ufosforylowane histony na całej długości, natomiast w czasie drugiego
podziału fosforylacja jest ograniczona jedynie do regionów przycentromerowych
(HOUBEN I IN., 2007).
Wstęp 20
Różnice we wzorze fosforylacji poszczególnych aminokwasów H3
w obrębie chromosomów występują między roślinami i ssakami. Histony
posiadające ufosforylowaną treoninę w pozycji 3. i 11. u roślin występują wzdłuż
ramion chromosomów, co jest związane z kondensacją chromosomów podczas
mitozy i mejozy (FUCHS I IN., 2006). Inna sytuacja jest obserwowana u ssaków,
gdzie fosforylacja seryny 10. i 28. wzdłuż ramion chromosomów jest związana
z kondensacją chromosomów, a fosforylacja treoniny 11. w centromerach wpływa
na kohezję centromerów (FUCHS I IN., 2006).
1.4.3. Metylacja DNA i modyfikacje histonów remodeling chromatyny
Ekspresja genów u organizmów eukariotycznych zależy w głównej mierze
od dostępności DNA dla czynników transkrypcyjnych. Decydują o tym dwa
główne mechanizmy, powodujące wyciszanie genów: metylacja DNA
i modyfikacje histonów (STAWSKI I IN., 2005). Wyciszanie genów w wyniku
metylacji DNA jest powiązane z deacetylacją histonów poprzez białka MBD,
które wiążą się z metylowanym DNA, powodując z kolei wiązanie deacetylaz
histonów - HDAC (BERG I IN., 2003; ZEMACH I IN., 2005). Istnieje także
niezaprzeczalny związek między metylacją DNA, a metylacją histonów.
U mutantów Arabidopsis kyp (mutacja w genie kodującym metylotransferazę
histonów KYP=SUVH4) i cmt3 następuje znaczna utrata metylacji DNA
w sekwencjach CNG, spada także poziom metylacji H3K9, natomiast nie zmienia
się poziom metylacji DNA w sekwencjach CG. Wniosek stąd taki, iż metylacja,
a dokładniej H3K9me2, jest krytyczną modyfikacją powodującą wyciszanie
genów oraz metylację DNA, przynajmniej w sekwencjach CNG (JACKSON I IN.,
2004). SOPPE I INNI (2002) oraz następnie TARIQ I INNI (2003) na podstawie badań
mutantów ddm1 i met1, zaproponowali nieco odmienny model współzależności
między modyfikacjami histonów, a metylacją DNA w wyciszaniu genów -
mianowicie, iż metylacja H3K9 jest powodowana metylacją DNA w sekwencjach
CG. SOPPE I INNI (2003) w swoim modelu zaznaczyli również, że w powstawaniu
heterochromatyny u Arabidopsis, prócz metylacji DNA i histonu H3, ważną rolę
pełnią deacetylacja H4K16 oraz wiązanie białka LHP1.
Modyfikacje chromatyny zależą w dużej mierze od tzw. wariantów
histonów. Wariant histonu H3.3 jest włączany do aktywnej chromatyny, gdzie
Wstęp 21
charakteryzuje się modyfikacjami specyficznymi dla aktywności transkrypcyjnej,
jak dimetylacja H3K4 (MCKITTRICK I IN., 2004).
Na stan chromatyny istotny wpływ mają także mechanizmy
potranskrypcyjnego wyciszania genów PTGS oraz metylacji DNA za
pośrednictwem RNA RdDM (AUFSATZ I IN., 2002; STAWSKI I IN., 2005).
U roślin wykryto obecność małych cząsteczek RNA: małe wyciszające RNA
(siRNA) oraz mikro RNA (miRNA). miRNA to 20-22 nukleotydowe
jednoniciowe fragmenty RNA, natomiast siRNA to 21-26 nukleotydowe,
dwuniciowe cząsteczki RNA, posiadające wolne niesparowane dwunukleotydowe
końce 3 i ufosforylowane końce 5 . siRNA powstają w wyniku degradacji
dwuniciowego RNA (dsRNA), które może powstać w komórce wskutek replikacji
wirusa, lub transkrypcji transgenu mającego postać odwróconych powtórzeń.
U Arabidopsis thaliana kluczowymi białkami zaangażowanymi w formowanie
heterochromatyny przy udziale siRNA są: DICER-LIKE 3 (DCL 3),
ARGONAUTE 4 (AGO 4), Polimeraza RNA zależna od RNA 2 (RDR 2) i dwie
formy jądrowej polimerazy RNA IV (Pol IV a i Pol IV b) (PONTES I IN., 2006).
1.4.4. Rola modyfikacji epigenetycznych w organizmach roślinnych
1.4.4.1. Regulacja procesów związanych z rozwojem u roślin
W ostatnich latach zidentyfikowano u roślin wiele mutantów
charakteryzujących się zaburzeniami w rozwoju, u których nie ulegały ekspresji
geny kodujące czynniki związane z modyfikacjami chromatyny (REYES I IN.,
2002). Okazało się, że modyfikacje epigenetyczne pełnią ważną rolę w regulacji
rozwoju u roślin. Ekspresja wielu genów i czynników transkrypcyjnych,
związanych z rozwojem, jest regulowana poprzez zmiany w poziomie metylacji
DNA oraz modyfikacje histonów.
Metylacja DNA pełni ważną rolę w regulacji procesów związanych
z rozwojem u roślin. Przykładem może być powstawanie endospermu, które jest
regulowane przez geny FIE-1, FIS i MEA represory autonomicznych podziałów
komórki centralnej przed zapłodnieniem (LI I IN., 2002). U hypometylowanych
mutantów fie-1 dochodzi do autonomicznego rozwoju endospermu (KIYSUE I IN.,
1999; LUO I IN., 1999; OHAD I IN., 1999; VINKENOOG I IN., 2000; GROSSNIKLAUS I
IN., 2001). Bardzo istotną rolę regulacyjną w genomach roślinnych spełniają
Wstęp 22
kompleksy aktywnie remodelujące chromatynę. Ostatnie badania SARNOWSKIEGO
I INNYCH (2005) wskazują, iż u Arabidopsis mutacje w genach AtSWI3a
i AtSWI3b, należących do rodziny SWI-SNF, powodują defekty w rozwoju
zarodka w stadium globularnym, natomiast w genie AtSWI3c prowadzą do
półkarłowatości roślin, zaburzeń w rozwoju korzeni i kwiatów.
Procesem ściśle kontrolowanym przez czynniki remodelujące chromatynę
jest zakwitanie roślin. Obniżonie poziomu deacetylaz histonów: HDAC i HDA1,
oraz mutacje w genach z rodziny polycomb: VRN, CLF, czy w genie kodującym
białko LHP1, powodują zaburzenia w zakwitaniu u Arabidopsis (GAUDIN I IN.,
2001; GENDALL I IN., 2001; TIAN I CHEN, 2001).
Modyfikacje histonów uczestniczą również w regulacji rozwoju u roślin.
COSTA I SHAW (2006) badali zależność między modyfikacjami epigenetycznymi,
a powstawaniem różnego typu komórek w epidermie korzenia Arabidopsis.
Wykazali oni, iż ekspresja genu GL2 jest zależna od typu komórek i ma miejsce
w atrichoblastach, komórkach, które nie wytwarzają włośników, natomiast nie
ulega ekspresji w komórkach trichoblastów. Brak ekspresji genu GL2 związany
był z modyfikacjami epigenetycznymi w chromatynie GL2, a dokładnie
z metylacją H3K9 oraz niskim poziomem acetylacji H3 (CARO I IN., 2007).
Z kolei PRYMAKOWSKA-BOSAK I INNI (1999) wykazali, że transgeniczne
rośliny tytoniu, u których zawartość wariantów histonów H1: H1A i H1B,
zredukowano do 25%, charakteryzowały się występowaniem znacznie słabiej
skondensowanej chromatyny w chromosomach metafazowych, rośliny te miały
defekty w budowie kwiatów, co skutkowało męską sterylnością.
1.4.4.2. Wpływ czynników stresowych na modyfikacje chromatyny
Potranslacyjne modyfikacje histonów u roślin, regulują ekspresję genów
w odpowiedzi na różne czynniki zewnętrzne, takie jak: atak patogenów, zmiany
temperatury, czy zasolenia oraz fotoperiod (MADLUNG I COMAI, 2004; PFLUGER I
WAGNER, 2007).
Roślinne GCN5 acetylotransferazy są włączane w odpowiedzi na stres
termiczny, np. oddziałują z czynnikami transkrypcyjnymi (CBF1)
odpowiedzialnym za ekspresję genów odpowiedzi na zimno. Acetylotransferaza
HAC1 jest niezbędna do ekspresji genu odpowiedzi na szok temperaturowy
HSP17 (BHARTI I IN., 2004). Mutacje w genach kodujących acetylotransferazy
Wstęp 23
GCN powodują zaburzenia w ekspresji genów WUS i AG, odpowiedzialnych za
prawidłowy rozwój części podziemnej i nadziemnej pędu (mutanty topless)
(SRIDHA I WU, 2006; CHEN I TIAN, 2007).
W odpowiedz na czynniki stresowe u roślin zaangażowane są także
deacetylazy histonów. Obniżenie poziomu ekspresji genów kodujących AtHD1
przez insercję T-DNA, powodują u Arabidopsis defekty rozwojowe, w tym pózne
zakwitanie. Ekspresja genów kodujących AtHD1 wzrasta po zranieniu, infekcji
patogenami, lub działaniu egzogennych hormonów roślinnych, jak etylen czy
ABA. Deacetylaza HDA19 i HDA6 jest zaangażowana w odpowiedz na
traktowanie etylenem i kwasem jasmonowym u Arabidopsis (ZHOU I IN., 2005).
Najnowsze wyniki badań ZHU I INNYCH (2008) wskazują, iż białko HOS15 jest
zaangażowane w deacetylację histonu H4 w odpowiedzi na zimno u Arabidopsis.
U mutantów hos15 obserwowano podwyższony poziom acetylacji H4, mutanty te
były ponadto bardziej wrażliwe na działanie niskich temperatur, w porównaniu
z roślinami typu dzikiego.
Traktowanie hormonami, zmiany poziomu zasolenia, czy temperatury
powodują zmiany w poziomie acetylacji i fosforylacji poszczególnych histonów.
Zaobserwowano wzrost poziomu fosforylacji H3S10 i acetylacji H3K14 u tytoniu
pod wpływem NaCl, ABA i chłodu. Podobne wyniki uzyskano dla Arabidopsis,
gdzie stwierdzono wzrost acetylacji i fosforylacji histonu H3, jednakże tylko po
działaniu NaCl. Nastomist pod wpływem ABA i temperatury obserwowano
wzrost jedynie poziomu fosforylacji H3. U obu gatunków nastąpiło także
podwyższenie poziomu ekspresji genów odpowiedzi na stres (tytoń - Tsi1, NtC7,
osm; Arabidopsis - DREB2A, RD29A, COR15A) (SOKOL I IN., 2007).
Wernalizacja, czyli indukowanie kwitnienia przez działanie niskich
temperatur, jest również procesem regulowanym epigenetycznie. W procesie tym
główna rolę odgrywa gen FLC (Flowering Locus C), który jest represorem
zakwitania. Represja FLC jest powiązana z kowalencyjnymi modyfikacjami
histonów w chromatynie tego genu. U roślin niewernalizowanych chromatyna
FLC jest w stanie aktywnym, czyli występują w niej modyfikacje histonów,
charakterystyczne dla euchromatyny, takie jak: acetylacja H3K9, H3K14 oraz
metylacja H3K4, natomiast po wernalizacji modyfikacje histonów zmieniają się
na charakterystyczne dla nieaktywnej transkrypcyjnie chromatyny: metylacja
H3K27 i H3K9. Ostatnio zidentyfikowano w aktywnej chromatynie genu FLC,
Wstęp 24
wariant histonu H2A.Z, którego obecność jest związana z aktywnością
transkrypcyjną (BASTOW I IN., 2004; FINNEGAN I IN., 2005; WOOD I IN., 2006;
SCHMITZ I AMASINO, 2007).
Temperatura może również wpływać na proces wyciszania przez siRNA
i miRNA. SZITTYA I INNI (2003) prowadzili badania na Nicotiana benthamina
transfekowanym wirusem CYMRSV (Cymbidium ring spot virus) oraz na
N. benthamina transformowanym Agrobacetrium z transgenem 35S - GFP.
Wyciszanie przez siRNA na skutek wprowadzenia wirusa i transformacji okazało
się być zależne od temperatury (15-27�C) i przy niskich temperaturach było
hamowane. Nie stwierdzono takiej zależności dla miRNA u Arabidopsis
(miR157, miR169, miR171), gdzie akumulację miRNA obserwowano we
wszystkich badanych przedziałach temperatury. Z badań tych autorzy
wnioskowali, iż generowanie siRNA i miRNA u roślin jest kontrolowane przez
dwa typy enzymów DICER, jeden - temperaturo-zależny i drugi - niezależny od
temperatury. Natomiast, SUNKAR I ZHU (2004) stwierdzili, iż traktowanie roślin
Arabidopsis przez 24 h temperaturą 0�C powodowało podwyższenie poziomu
ekspresji dwóch mikro RNA: miR393, miR319. Różnice w akumulacji miRNA
w zależności od zmian temperatury, w tych dwóch eksperymentach mogą
wypływać z zastosowania innych zakresów temperatur.
1.5. GENETYCZNE I EPIGENETYCZNE MODYFIKACJE
U ROŚLIN ALLOPOLIPLOIDALNYCH
1.5.1. Powstawanie i rodzaje allopoliploidów
Gatunki poliploidalne to takie, w komórkach których występują więcej niż
dwa haploidalne zespoły chromosomów (MAAUSZYCSKA, 2001). Jeżeli genomy
w komórce poliploidalnej pochodzą od więcej niż jednego gatunku ancestralnego,
to mówimy o allopoliploidach, natomiast, jeżeli zawierają więcej niż dwa
identyczne genomy, to wówczas mówimy o autopoliploidach. Analizowany
w pracy Brassica napus to gatunek allotetraploidalny, dla którego znane są
diploidalne gatunki ancestralne. Możemy wyróżnić kilka mechanizmów
powstawania naturalnych gatunków allopoliploidalnych. Jednym z najbardziej
Wstęp 25
prawdopodobnych jest proces wytwarzania przez roślinę gamet
o niezredukowanej liczbie chromosomów, pochodzących od gatunków
diploidalnych, co daje początek płodnym mieszańcom międzygatunkowym
i prowadzi do powstania nowego gatunku allotetraploidalnego. Przykładem
kolejnego mechanizmu może być zwielokrotnienie liczby chromosomów
w komórkach somatycznych, które stają się następnie komórkami macierzystymi
mikro- lub megaspor (RAMSEY I SCHEMSKE, 1998; MAAUSZYCSKA, 2001).
U gatunków allopolipolidalnych podczas mejozy chromosomy tworzą
biwalenty między chromosomami homologicznymi jednego genomu, stąd
zachowany jest u nich disomiczny charakter dziedziczenia. Zdarza się jednak, że
u allopoliploidów powstałych w wyniku krzyżowania gatunków blisko
spokrewnionych, ze względu na niewielkie zróżnicowanie w strukturze
chromosomów, podczas mejozy może dochodzić do koniugacji homeologicznej.
U niektórych gatunków znane są mechanizmy hamujące koniugację
chromosomów homeologiczych, dlatego tworzą one prawidłowe biwalenty
w mejozie. Przykładem wykształcenia takiego mechanizmu jest
alloheksaploidalna pszenica T. aestivum (AABBDD), u której każdy chromosom
może koniugować z chromosomem homologicznym, ale także z dwiema parami
chromosomów homeologicznych. W rzeczywistości jednak, koniugują ze sobą
tylko chromosomy homologiczne, za co odpowiedzialny jest dominujący gen
Ph1, który znajduje się na długim ramieniu chromosomu 5B i nie dopuszcza do
koniugacji chromosomów homeologicznych (SEARS, 1976; MAAUSZYCSKA, 2001).
Ostatnio zidentyfikowano także podobny gen u B. napus (PrBn) (JENCZEWSKI I
IN., 2003).
Obecnie szacuje się, że około 80% roślin okrytonasiennych to poliploidy,
a ponad połowa wszystkich naturalnie występujących poliploidów to gatunki
allopoliploidalne (SOLTIS I SOLTIS, 1999). Do tej obszernej grupy należą ważne
rośliny uprawne, takie jak: rzepak, pszenica, bawełna (LEITCH I BENNETT, 1997;
MAAUSZYCSKA, 2001). Istnieją także przykłady poliploidów powstałych całkiem
niedawno, bo w okresie ostatnich 150 lat (SOLTIS I IN., 2003): Tragopogon mirus,
T. miscellus (SOLTIS I IN., 2004), Spartina anglica, (AINOUCHE I IN., 2004)
i Senecio cambresis (ABBOTT I LOWE, 2004).
Wiele gatunków uważanych za diploidalne ma w swojej historii nawet po
kilka rund poliploidyzacji, dlatego są one współcześnie nazywane
Wstęp 26
paleopoliploidami (MA I GUSTAFSON, 2005). Do tej grupy roślin możemy
zaliczyć: kukurydzę (GAUT I DOEBLEY, 1997), soję (SHOEMAKER I IN., 1996),
Arabidopsis (GRANT I IN., 2000), czy też gatunki z rodzaju Brassica B. rapa,
B. oleracea oraz B. nigra (LAGERCRANTZ I LYDIATE, 1996).
Bardzo istotną rolę w poznaniu ewolucji genomów, odgrywają badania
prowadzone na resyntetyzowanych (analogiczne do naturalnie występujących)
i syntetycznych (nieposiadających analogów w przyrodzie) (OSBORN I IN., 2003)
gatunkach poliploidalnych, które dostarczają cennej wiedzy o procesach
zachodzących po allopoliploidyzacji oraz ewolucji roślin poliploidalnych
(MADLUNG I IN., 2002; LUKENS I IN., 2006).
Genom jądrowy gatunków poliploidalnych charakteryzuje się
intensywnymi przemianami na różnych stopniach organizacji DNA. Jego
struktura jest wypadkową wielu procesów, które zachodzą w niedługim czasie, po
procesie poliploidyzacji. W genomach poliploidalnych często obserwowane są
liczne delecje, związane z eliminacją sekwencji, rearanżacje chromosomowe oraz
zmiany wzoru ekspresji wielu genów. Wszystkie wymienione procesy mają
podłoże genetyczne bądz epigenetyczne, a często są wypadkową tych dwóch
procesów. Genomy poliploidalne w trakcie ewolucji podlegają procesom
diploidyzacji. Wszystkie opisane zmiany prowadzą do znacznego zróżnicowania
genomów ancestralnych u gatunków poliploidalnych, a w efekcie ich wtórną
diploidyzację (MA I GUSTAFSON, 2005), która jest gwarancją zachowania
dziedziczenia o charakterze disomicznym.
1.5.2. Genetyczne modyfikacje w genomach allopoliploidalnych
Genomy poliploidalne charakteryzują się dynamicznymi zmianami
w organizacji sekwencji DNA, a także zmianami w poziomie ekspresji licznych
genów. Modyfikacje te są odpowiedzią na tzw. szok genomowy (MCCLINTOCK,
1984), który ma miejsce po procesie poliploidyzacji. SONG I INNI (1995), jako
pierwsi pokazali, iż rzeczywiście zmiany takie zachodzą u roślin poliploidalnych.
Badania na resyntetyzowanych B. napus potwierdziły liczne rearanżacje
w genomie allotetraploida, które były związane z utratą, bądz pojawieniem się
nowych fragmentów RFLP. Zmiany te najprawdopodobniej powodowane były
niewzajemną transpozycją pomiędzy chromosomami homeologicznymi.
Wstęp 27
Najwięcej zmian w genomie B. napus wykryto w pokoleniu F5 i miały one
charakter przypadkowy. W przeciwieństwie do B. napus u allotetraploidalnej
pszenicy obserwowano najczęściej utratę sekwencji już w pierwszym pokoleniu.
Eliminowane były sekwencje chromosomowo lub genomowo specyficzne.
Eliminacja ta była nieprzypadkowa i miała charakter konserwatywny
u naturalnych alloheksaploidów oraz resyntetyzowanych allotetraploidów, jak
również diploidalnych gatunków ancestralnych pszenicy (FELDMAN I IN., 1997).
OZKAN I INNI (2001) badali eliminację sekwencji genomowo
i chromosomowo specyficznych u poliploidów pszenicy. Okazało się, że
eliminacja sekwencji chromosomowo specyficznych zachodzi już w pokoleniu F1
u allopoliploidów. Zauważono także, iż eliminacja sekwencji zaczyna się
wcześniej u resyntetyzowanych gatunków allopoliploidalnych w porównaniu do
gatunków syntetycznych. Proces eliminacji sekwencji obserwowany był także
u allopoliploidów pszenżyta, którego genomy ancestralne charakteryzują się
mniejszym stopniem pokrewieństwa niż ma to miejsce u poliploidalnych
gatunków pszenicy. MA I GUSTAFSON (2006) stwierdzili, iż ponad 40%
fragmentów AFLP pochodzących z genomu pszenicy i ponad 70% z genomu żyta
ulega eliminacji u pszenżyta.
U resyntetyzowanych gatunków allopoliploidalnych dochodzi do częstych
zmian we wzorze ekspresji genów. Przykładem mogą być badania prowadzone
u pszenicy (KASHKUSH I IN., 2002). Autorzy w pracy tej analizowali fragmenty
cDNA-AFLP, stwierdzono iż 48 transkryptów zostało wyciszonych, a 12 uległo
aktywacji u allotetraploidalnej pszenicy. Wśród aktywowanych genów większość
stanowiły retroelementy. Zmiany w ekspresji genów analizowano także
u allotetraploidalnej bawełny (ADAMS I IN., 2004). Badania te wykazały, że 5%
genów zduplikowanych u bawełny (genom AG) ulega wyciszeniu. Dodatkowo
wyciszenie kopii genów pochodzących z jednego genomu rodzicielskiego było
tkankowo-specyficzne. U poliploidów tych obserwowano proces
nonfunkcjionalizacji wśród genów zduplikowanych. Przykład może stanowić
wyciszenie matecznej kopii genu Em2025, we wszystkich analizowanych
organach z wyjątkiem liści i zalążków. U bawełny (genom AD) stwierdzono także
subfunkcjonalizację genów, gdzie jeden homeolog ulegał wyciszeniu w innych
organach niż druga kopia tego samego genu. Taki schemat wyciszania był
Wstęp 28
charakterystyczny dla wielu genów u analizowanej pszenicy, np.: adhD, A1520
(ADAMS I IN., 2003).
Nie wszystkie, omówione wyżej zmiany genetyczne, zachodzą
u stosunkowo młodych gatunków poliploidalnych. Przykład może stanowić
Spartina anglica (BAUMEL I IN., 2001) gatunek, u którego nie wykazano
znaczących zmian genetycznych po procesie allopoliploidyzacji. Genomy
ancestralne charakteryzowały się wysokim stopniem konserwatywności
w genomie tego poliploida. Inaczej było w przypadku allotetraploidalnego
gatunku Tragopogon miscellus, którego powstanie datowane jest na około 80 lat
temu. W genomie tym stwierdzono eliminację fragmentów cDNA-AFLP
pochodzących od obu gatunków ancestralnych (TATE I IN., 2006).
1.5.3. Epigenetyczne modyfikacje w genomach allopoliploidalnych
Badania prowadzone w przeciągu ostatnich lat, wskazują na coraz większą
rolę modyfikacji epigenetycznych w procesie stabilizacji, jak również ewolucji
roślin allopoliploidalnych (FINNEGAN, 2002). U wielu resyntetyzowanych
allopoliploidów obserwowano zmiany w poziomie metylacji DNA, które miały
miejsce bardzo często już w pierwszych pokoleniach po procesie
allopoliploidyzacji. SONG I INNI (1995) wykorzystując analizę typu Southern
wskazali na zachodzące w sposób przypadkowy zmiany w poziomie metylacji
(zrówno hypermetylację jak i hypometylację) w sekwencjach CpG i CpNpG
u resyntetyzowanych B. napus. W badaniach tych zastosowano parę enzymów
metylowrażliwych MspI i HpaII. Autorzy zaobserwowali zmiany w metylacji
DNA dla dwóch loci RFLP w pokoleniu F5, jednakże jako główny czynnik
wpływający na rearanżacje genomu u analizowanych alloteraploidów, wskazano
zmiany związane z utratą lub pojawieniem się nowych fragmentów RFLP.
Podobne badania przeprowadzono u resyntetyzowanych allotetraploidów
Arabidopsis (MADLUNG I IN., 2002). Stosując technikę MSAP wykazano, iż
spośród 8,3% polimorficznych loci pod względem metylacji DNA, aż 62,5%
z nich było demetylowanych, a 37,5% charakteryzowało się podwyższonym
poziomem metylacji. COMAI I INNI (2000) wskazali, że głównym czynnikiem
wpływającym na zmiany w ekspresji genów u resynetyzowanych allopoliploidów
są zmiany w poziomie metylacji DNA. Z badań prowadzonych na
Wstęp 29
allotetraploidalnych Arabidopsis wynika, że ekspresja 1% genów kodujących
różnego rodzaju białka ulega zmianom w pokoleniu F2 u resyntetyzowanych
allotetraploidów. Analiza RT-PCR potwierdziła wyciszenie trzech genów.
Stosując natomiast cDNA-AFLP stwierdzono, że 20 z 700 analizowanych genów
podlegało supresji u poliploidów, w porównaniu z gatunkami rodzicielskimi.
Natomiast wyciszenie trzech analizowanych genów (K7, K9, L6) u Arabidopsis
suecica było związane z metylacją DNA w tych loci. Wykazane zmiany
w ekspresji genów u allopoliploidalnych Arabidopsis były związane ze zmianami
w morfologii, czasie zakwitania oraz płodności analizowanych roślin (COMAI I IN
2000). Podobne badania na resyntetyzowanych A. suecica przeprowadzili LEE I
CHEN (2001). Stwierdzli oni, iż spośród 110 loci AFLP-cDNA, 2,5% genów
uległa wyciszeniu u allopoliploidów. Badano między innymi aktywność dwóch
genów: RFP i TCP3. Okazało się, że są one wyciszone u A. suecica i jest to
związane z metylacją DNA w obrębie promotorów tych genów.
LIU I INNI, (1998A) analizowali zmiany w poziomie metylacji
u resyntetyzowanych i naturalnych allopoliploidów Aegilops-Triticum. Zmiany te
nie były przypadkowe i dotyczyły tych samych loci u różnych osobników, np.:
locus pWST. Autorzy porównali wzór metylacji w locus genu pWST dla
resyntetyzowanych poliploidów pszenicy z wzorem metylacji u naturalnej
alloheksaploidalnej T. aestivum. Wyniki potwierdziły konserwatywny charakter
wzoru metylacji w przypadku obu analizowanych poliploidów pszenicy.
Może to wskazywać na istnienie zaprogramowanych zmian
epigenetycznych, które prowadzą do genetycznej diploidyzacji genomów
i wpływają na proces ewolucji roślin allopoliploidalnych (LIU I WENDEL, 2003).
Zmiany w poziomie metylacji DNA u poliploidów mogą preferencyjnie dotyczyć
loci pochodzących od jednego z genomów rodzicielskich, jak ma to miejsce
u resyntetyzowanej allotetraploidalnej pszenicy (SHAKED I IN., 2001).
KASKUSH I INNI (2002) prowadząc badania na resyntetyzowanej,
allotetraploidalnej pszenicy stwierdzili, iż zmianom genetycznym związanym
z utratą sekwencji, towarzyszą także zmiany epigenetyczne, związane
z wyciszaniem sekwencji DNA. Stosując analizę typu Southern wykazano, iż
wśród analizowanych sekwencji cDNA, osiem z nich nie charakteryzowało się
żadnymi zmianami genetycznymi, a w przypadku czterech genów (RAIF3,
RAIF30, RAIF34, RAIF40) stwierdzono metylację de novo .
Wstęp 30
W przeciwieństwie do opisanych wyżej gatunków poliploidlanych
u syntetycznej alloheksaploidalnej bawełny, nie stwierdzono zmian w poziomie
metylacji DNA, co może wskazywać na inny rodzaj modyfikacji, możliwe, że
także epigenetycznych, które mają miejsce po procesie allopoliploidyzacji
u bawełny (LIU I IN., 2001).
Dominacja jąderkowa to kolejny przykład epigenetycznie kontrolowanego
procesu, który powszechnie występuje u allopoliploidów. CHEN I PIKAARD
(1997A) badali ekspresję genów rRNA u B. napus. Okazało się, że u tego
alloteraploida wykrywano jedynie transkrypty rRNA pochodzące od jednego
gatunku ancestralnego B. rapa. Po zastosowaniu inhibitora metylotransferazy
aza-dC, stwierdzono, iż redukcja w metylacji cytozyny prowadzi do aktywacji
genów rRNA pochodzących od B. oleracea, podobny efekt otrzymano stosując
inhibitor deacetylazy histonów. Z kolei FRIEMAN I INNI (1999), prowadząc badania
u B. napus, dowiedli, iż wiązanie czynnika transkrypcyjnego Pol I do promotora
genów rRNA B. oleracea, nie jest związane bezpośrednio z metylacją cytozyny,
a na brak ekspresji tych genów mogą mieć wpływ białka wiążące się
z hypermetylowanym DNA, które działają jako represory transkrypcji. CHEN I
INNI (1998) analizowali wyciszenie genów rRNA u alloteraploidalnych
A. suecica. Stwierdzono, iż u tego gatunku wyciszeniu podlegają geny rRNA
pochodzące od A. thaliana i jest to związane z metylacją DNA.
Dominacja jąderkowa jest procesem odwracalnym, a ekspresja wcześniej
wyciszonych genów rRNA może zależeć od procesów rozwojowych. Dowodów
na to stwierdzenie dostarczyły badania CHEN I PIKAARD (1997B). Geny rRNA
wyciszone w tkankach wegetatywnych, ulegały ekspresji we wszystkich organach
kwiatu, w tym także w płatkach i działkach kielicha, co dodatkowo wskazywało
na to, że mejoza nie jest konieczna, aby reaktywować wyciszone geny rRNA.
Stwierdzenie, iż dominacja jąderkowa może być tkankowo - specyficzna, znalazło
potwierdzenie w badaniach HASTEROKA I MALUSZYNSKIEJ (2000). Liczba
aktywnych loci rDNA u gatunków allotetraploidalnych Brassica była równa
sumie tych loci z odpowiednich gatunków ancestralnych, co świadczyło o braku
zjawiska dominacji jąderkowej, w analizowanej tkance merystematycznej
korzenia gatunków allotetraploidalnych.
Proces epigenetycznych modyfikacji DNA jest odwracalny
w przeciwieństwie do utraty (delecji) określonych sekwencji i zachodzi zwykle
Wstęp 31
zaraz po procesie allopoliploidyzacji, o czym świadczą liczne zmiany w ekspresji
genów już w pierwszym pokoleniu u resyntetyzowanych poliploidów (KASHKUSH
I IN., 2002). Wzór metylacji DNA w przeważającej liczbie sekwencji jest
zachowywany w następnych pokoleniach, czego dowodem są badania
prowadzone na resytetyzowanych gatunkach allopoliploidlnych (GAETA I IN.,
2007). W przeciwieństwie do zmian epigenetycznych, genetyczne modyfikacje
w sekwencji DNA u gatunków allopoliploidalnych zachodzą z większą
częstotliwością w dalszych pokoleniach (SONG I INNI 1995, GAETA I IN., 2007). To
właśnie epigenetyczne modyfikacje mogą prowadzić w konsekwencji do zmian
genetycznych i powodować np.: utratę określonych loci. Utrata sekwencji bardzo
często spowodowana jest niewzajemną homeologiczną transpozycją między
chromosomami pochodzącymi z genomów ancestralnych. Prawdopodobnie sam
proces eliminacji sekwencji może być także sterowany epigenetycznie, o czym
świadczą ostatnie badania prowadzone u Tetrahymena. Dowodzą one, iż
eliminacja sekwencji jest nieprzypadkowa i kierowana epigenetycznie poprzez
metylację lizyny dziewiątej histonu H3 oraz poprzez małe interferencyjne RNA
scnRNAs, których wzmożoną akumulację wykryto w eliminowanych
sekwencjach u tego gatunku (TAVERNA I IN., 2002).
1.5.4. Rearanżacje chromosomowe w genomach poliploidalnych
Do analizy rearanżacji chromosomowych, które zachodzą po procesie
poliploidyzacji, najczęściej wykorzystuje się techniki fluorescencyjnej
i genomowej hybrydyzacji in situ (FISH, GISH). BELYAYEV I INNI (2000) stosując
GISH u allotetrapliodalnej pszenicy (genom AB) wskazali na wystąpienie
przemian międzygenomowych, objawiających się znacznym wzbogaceniem
genomu A w sekwencje powtarzalne pochodzące z drugiego genomu
ancestralnego.
Podobne wyniki otrzymano dla allotetraploidalnej bawełny (ZHAO I IN.,
1998). Analiza FISH wykazała, że część sekwencji powtarzalnego DNA (np.:
pXP224, pXP137) charakterystyczna dla genomu A, rozprzestrzeniła się
w chromosomach pochodzących z genomu D. Z kolei zastosowanie GISH,
pozwoliło uwidocznić przemiany chromosomowe zachodzące u Poa jemtlandica.
U gatunku tego wykazano, że 3 pary chromosomów homeologicznych
Wstęp 32
charakteryzują się międzygenomowymi translokacjami (BRYSTING I IN., 2000).
Translokacje międzygenomowe wykryto także u alloheksaploidlanego gatunku
owsa Avena fatua, u którego obserwowano osiem par chromosomów
z translokacjami między genomami A, D i C (YANG I IN., 1999). Natomiast
IRIGOYEN I INNI (2002) stosując FISH z sekwencjami powtarzalnymi wykazali
translokacje między poszczególnymi trzema genomami ancestralnymi,
obserwowane w dziesięciu parach chromosomów u Avena sativa. LIM I INNI
(2004) badali reranżacje genomowe u naturalnych i resyntetyzowanych
allotetraploidów Nicotiana tabacum. Okazało się, że poliploidy naturalne
charakteryzują się licznymi translokacjami międzygenomowymi. Podobne wyniki
dla tytoniu otrzymali LEITCH I INNI (2006).
Rearanżacje chromosomowe po procesie allopoliploidyzacji potwierdzono,
wykorzystując technikę FISH u pszenicy. We wszystkich analizowanych
poliploidach pszenicy obserwowano eliminację sekwencji pGc1R-1 (HAN I IN.,
2005). SALINA I INNI (2006) prowadzili badania na poliploidalnej pszenicy,
wykorzystując FISH z dwiema powtarzalnymi sekwencjami - Spelt1 i Spelt52.
Wyniki tych badań pokazują różną liczbę loci tych sekwencji u różnych
ancestorów i gatunków poliploidlanych pszenicy, co związane jest z amplifikacją
tych sekwencji podczas ewolucji, prowadzącej do powstania gatunku
alloheksaploidalnego.
Cel pracy 33
2. CEL PRACY
Gatunki z rodzaju Brassica, należące do tzw. trójkąta U, stanowią bardzo
ważną ze względów gospodarczych grupę roślin. Duża różnorodność
morfologiczna oraz znajomość pokrewieństwa między tymi gatunkami sprawiają,
że są one interesującym materiałem do analiz genetycznych, cytogenetycznych
oraz ewolucyjnych.
W niniejszej pracy obiektem badań były dwa diploidalne gatunki: Brassica
oleracea (2n=2x=18, genom C) i Brassica rapa (2n=2x=20, genom A) oraz
gatunek allotetraploidalny Brassica napus (2n=4x=38, genom AC), który powstał
w wyniku krzyżownia wymienionych diploidów. Analizie cytogenetycznej
poddano dwie formy gatunków Brassica, uprawną i krótkiego cyklu RC. Ta
ostatnia jest często wykorzystywana w badaniach genetycznych i molekularnych,
a ostatnio również cytogenetycznych. Zaistniała potrzeba porównawczej analizy
genomów tych form oraz sprwadzenie czy istnieje jakaś korelacja między krótkim
cyklem życiowym form RC i zmianami epigenetycznymi.
Cytogenetyka molekularna dostarcza cennych informacji na temat losu
chromosomów podczas mitozy, ale nadal niewiele wiadomo o losach
chromosomowego DNA w jądrze komórkowym, a przede wszystkim o jego
modyfikacjach epigenetycznych. Z tego względu większość badań, w niniejszej
pracy, prowadzona była na jądrach interfazowych w mikroskopie konfokalnym
i cytometrze obrazowym. Analizę modyfikacji chromatyny prowadzono
z wykorzystaniem technik immunobarwień z przeciwciałami skierowanymi,
przeciwko metylowanym i acetylowanym histonom oraz metylowanemu DNA.
W pracy stosowano także fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH) z rDNA
i sekwencjami centromerowymi, jako sondami oraz technikę MSAP z enzymami
metylowrażliwymi.
Celem pracy było porównanie modyfikacji chromatyny u ancestralnych
gatunków diploidalnych i gatunku allotetraploidalnego oraz charakterystyka
Cel pracy 34
struktury jądra interfazowego, pod względem rozmieszczenia hetero-
i euchromatyny, w zależności od wielkości genomu, poziomu poliploidyzacji,
a także w różnych fazach cyklu komórkowego.
Cel pracy realizowany był przez następujące badania:
�� Porównanie modyfikacji genetycznych mierzonych liczbą i lokalizacją loci
genów rRNA u gatunków diploidalnych oraz gatunku allotetraploidalnego;
�� Porównanie poziomu oraz wzoru metylacji DNA w chromosomach
i jądrach interfazowych gatunków Brassica;
�� Analiza wzoru metylacji i acetylacji histonów w jądrach interfazowych;
�� Porównanie poziomu acetylacji histonów H3 i H4 w heterochromatynie
konstytutywnej w trakcie cyklu komórkowego.
Materiał i metody 35
3. MATERIAA I METODY
3.1. MATERIAA ROŚLINNY
Materiał roślinny do badań stanowiły formy uprawne trzech gatunków
z rodzaju Brassica: diploidalne Brassica rapa (L.) (syn. B. campestris)
(2n=2x=20, genom A) i Brassica oleracea (L.) (2n=2x=18, genom C) oraz
allotetraploidalny B. napus (L.) (2n=4x=38, genom AC). W badaniach
wykorzystano także formy krótkiego cyklu (Rapid Cycling - RC), wymienionych
wyżej gatunków Brassica. Szczegółowe dane dotyczące pochodzenia materiału
roślinnego przedstawiono w Tab. 2.
Tab. 2 yródło pochodzenia badanych gatunków Brassica
Odmiana/
Gatunek/forma yródło
nazwa hodowlana
var. capitata PNOS,
B. oleracea kapusta
głowiasta
Amager Ożarów Mazowiecki, Polska
var. rapa PNOS,
B. rapa (syn. campestris)
rzepa jadalna
Goldball Ożarów Mazowiecki, Polska
var. annua/ biennis ZDHiAR,
B. napus - rzepak
Kana Małyszyn Polska
Crucifer Genetics Cooperative
B. oleracea RC C3-1 020197
Madison USA
Crucifer Genetics Cooperative
B. rapa RC C1-1 102780
Madison USA
Crucifer Genetics Cooperative
B. napus RC C5-1 020197
Madison USA
Materiał i metody 36
Hodowla roślin była prowadzona w szklarnii Katedry Anatomii i Cytologii
Roślin. Nasiona form uprawnych oraz RC wysiewano do doniczek wypełnionych
ziemią wymieszaną z wermikulitem w stosunku 4:1. Hodowlę prowadzono
w stałych warunkach temperatury: 19 ą 1�C i oświetlenia: 14h dnia i 10h nocy
(światło białe, jarzeniowe, neutralne, 10000 lux), przy wilgotności H"50%. Po 7-10
dniach od wysiania nasion zbierano pierwsze liście osobno z każdej rośliny,
następnie umieszczano w silica żelu (Sigma), w celu wysuszenia tkanki. Materiał
ten wykorzystywano następnie do izolacji DNA. Rośliny form RC, przeznaczone
do badań mejozy, pozostawiano w szklarni do momentu zakwitania, tj. 4-6
tygodni i następnie zbierano pączki szczytowe. W celu uzyskania kolejnych
pokoleń Brassica RC rośliny pozostawiano w szklarni do czasu zawiązania nasion
(6-10 tygodni).
Do badań cytogenetycznych nasiona były wysiewane na szalki Petriego,
które wyłożono trzema warstwami bibuły filtracyjnej zwilżonej wodą kranową.
Nasiona pozostawiano w warunkach pełnego zaciemnienia w temperaturze ok.
20�C do momentu skiełkowania (3-4 dni), następnie siewki traktowano
i utrwalano według metody opisanej poniżej.
3.2. TRAKTOWANIE I UTRWALANIE MATERIAAU
Siewki posiadające korzenie o długości 1,5 2 centymetrów, traktowano
0,002 M roztworem 8-hydroksychinoliny przez 4 godziny, na wytrząsarce
w ciemności. Traktowanie prowadzono w celu nagromadzenia komórek
w stadium metafazy. Następnie, materiał utrwalano przez 2 godziny w temp.
pokojowej w mieszaninie kwasu octowego i alkoholu metylowego - AA
(w stosunku 1:3), lub w roztworze 4% formaldehydu w 1�PBS przez 40 min.
w temperaturze pokojowej. Jeżeli jako utrwalacz stosowano formaldehyd,
materiał po jego usunięciu przenoszono natychmiast do roztworu 1�PBS
i przechowywano w temp. 4�C. Do analizy wzoru modyfikacji histonów materiał
utrwalano w formaldehydzie, natomiast do badań nad wzorem metylacji DNA,
oraz do fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ, siewki utrwalano w AA.
Materiał i metody 37
3.3. WYKONYWANIE PREPARATÓW
3.3.1. Przygotowanie preparatów do immunobarwień modyfikacje
histonów
Materiał przeznaczony do immunobarwień utrwalano w roztworze 4%
formaldehydu. Preparaty wykonywano z merystemów wierzchołkowych korzeni.
W tym celu materiał płukano w roztworze 1�PBS przez 5 - 10 minut, następnie
korzenie przenoszono do mieszaniny maceracyjnej (w 1�PBS), która zawierała
2.5% pektynazę (Sigma), 2.5% celulazę Onozuka R-10 (Serva) i 2.5%
pektoliazę (Sigma). Macerację prowadzono w temperaturze 37�C przez 35 - 40
min. Następnie usuwano enzym i płukano materiał w buforze 1�PBS. Preparaty
wykonywano z jednego merystemu, umieszczając go w kropli 1�PBS na szkiełku
podstawowym. Po usunięciu czapeczki merystem rozdrabniano igłami
preparacyjnymi i nakładano szkiełko nakrywkowe. Po delikatnym przygnieceniu
preparaty zamrażano, a następnie usuwano szkiełka nakrywkowe. Tak
przygotowane preparaty natychmiast przenoszono do schłodzonego roztworu
1�PBS. W celu dłuższego przechowywania preparatów, umieszczano je
w bezwodnej glicerynie (POCH) i przechowywano w lodówce w temperaturze
4�C.
3.3.2. Przygotowanie preparatów do FISH i immunobarwień - metylacja
DNA
Materiał wykorzystywany do FISH i badań wzoru metylacji DNA
utrwalano w AA. Preparaty wykonywano według zmodyfikowanej metody
podanej przez MALUSZYNSKA I HELSOP-HARRISON (1991). Przeznaczone do
badania merystemy wierzchołkowe korzeni, w celu usunięcia utrwalacza, płukano
w dwóch zmianach buforu cytrynianowego. Następnie, materiał macerowano
w mieszaninie enzymów: 20% pektynaza (Sigma) i 2% celulaza Onozuka R-10
(Serva), w temperaturze 37�C przez 1,5 2 h. Po maceracji merystemy płukano
w buforze cytrynianowym przez 20 min. W celu wykonania preparatu
przenoszono jeden merystem do szkiełka maceracyjnego, zawierającego 45%
Materiał i metody 38
kwas octowy, po czym odcinano czapeczkę. Wypreparowany merystem z kroplą
kwasu octowego umieszczano na szkiełku podstawowym, nakładano szkiełko
nakrywkowe i zgniatano. Po zamrożeniu usuwano szkiełko nakrywkowe,
preparaty suszono, a następnie przechowywano w temp. 4�C.
Preparaty mejotyczne wykonywano z utrwalonych w AA pączków
kwiatowych, które macerowano w mieszaninie enzymów: 1% pektynaza (w/w),
1% celulaza (w/w) i 1% cytohelikaza (Sigma). Do badań pobierano komórki
mejotyczne pochodzące z pylników. Procedurę przygotowania preparatów
prowadzono tak jak opisano powyżej.
3.4. IMMUNOBARWIENIA
3.4.1. Analiza wzoru modyfikacji histonów i metylacji DNA
Do badań wzoru metylacji i acetylacji histonów stosowano przeciwciała
dostępne ze zródeł komercyjnych (Upstate, Invitrogen), natomiast do badań
wzoru metylacji DNA wykorzystano przeciwciała I-rzędowe przeciwko 5-
metylocytozynie, otrzymane przez PODESTA I IN. (1993). Wśród stosowanych
przeciwciał były: królicze (rabbit) lub mysie (mouse) przeciwciała
pierwszorzędowe oraz kozie przeciwciała drugorzędowe (goat-anti-rabbit, goat-
anti-mouse), skoniugowane z fluorochromem Alexa488. Szczegółowe dane
dotyczące stosowanych przeciwciał zestawiono w Tab. 3.
Tab. 3 Przeciwciała stosowane w immunobarwieniach
Numer katalogowy/
Nazwa/Rozcieńczenie Skrót
yródło
Przeciwciała pierwszorzędowe
Anti-dimetyl-histone H3 (Lys4)
07-030
Rabbit polyclonal IgG H3K4me2
Upstate
1:300 w 1% BSA w 1�PBS
Anti-dimetyl-histone H3 (Lys9)
05-768, 07-212
Rabbit monoclonal IgG H3K9me2
Upstate
1:100 w 1% BSA w 1�PBS
Materiał i metody 39
Numer katalogowy/
Nazwa/Rozcieńczenie Skrót
yródło
Anti-trimetyl-histone H3 (Lys9)
07-442
Rabbit polyclonal IgG H3K9me3
Upstate
1:50 w 1% BSA w 1�PBS
Anti-acetyl-histone H4 (Lys5)
04-118
Rabbit monoclonal IgG H4K5ac
Upstate
1:200 w 1% BSA w 1�PBS
Anti-acetyl-histone H3 (Lys18)
07-354
Rabbit polyclonal IgG H3K18ac
Upstate
1:200 w 1% BSA w 1�PBS
Anti-acetyl-histone H4 (Lys16)
06-762
Rabbit polyclonal IgG H4K16ac
Upstate
1:200 w 1% BSA w 1�PBS
Anti-metyl-cytosine
Mouse monoclonal IgG 5 mC Podesta i in. (1993)
1:300 w 1% BSA w 1�PBS
Przeciwciała drugorzędowe
Goat anti-rabbit Alexa488
A-11008
IgG (H+L)
Invitrogen
1:100-1:300 w 1% BSA w 1�PBS
Goat-anti mouse Alexa488
A-11001
IgG (H+L)
Invitrogen
1:300 w 1% BSA w 1�PBS
Immunobarwienia z zastosowaniem wyżej wymienionych przeciwciał
przeprowadzano według zmodyfikowanej metody opisanej przez JASENCAKOVA I
INNI (2000; 2001). Na przygotowane preparaty nakrapiano roztwór 5% BSA
(Bovine Albumin Serum, Sigma) w 1�PBS i inkubowano w temperaturze
pokojowej przez godzinę. Następnie na preparat nakrapiano 40 �l przeciwciała
pierwszorzędowego w odpowiednim rozcieńczeniu (Tab. 3) i pozostawiano na
noc w 4�C. Następnego dnia przeprowadzano płukania w trzech zmianach 1�PBS,
nakrapiano 40 �l przeciwciała drugorzędowego w odpowiednim rozcieńczeniu
(Tab. 3) i inkubowano 1 h w temp. 37�C. Po trzykrotnym płukaniu w 1�PBS
preparaty zamykano na mokro w buforze Vectashield (Vector Labolatories)
z DAPI w stężeniu 4 �l/ml.
Materiał i metody 40
W celu detekcji metylacji cytozyny, preparaty przed nakropieniem BSA
denaturowano w 70% formamidzie w 2�SSC przez 2 minuty w temperaturze
65�C, a następnie odwadniano w szeregu alkoholowym (70 i 99%). Na wysuszone
preparaty nakrapiano blok BSA i w dalszej części procedury postępowano jak
opisano powyżej.
3.5. FLUORESCENCYJNA HYBRYDYZACJA IN SITU (FISH)
Procedurę FISH przeprowadzano według protokołu opracowanego przez
SCHWARZACHER I HESLOP-HARRISON (2000), a następnie zmodyfikowanego przez
HASTEROK I INNI (2001). Do badań wykorzystywano preparaty wykonane metodą
maceracji enzymatycznej.
Pochodzenie sond do FISH (jako sondy stosowano następujące sekwencje DNA):
�� 5S rDNA sekwencja pTa794 o długości 410 pz wyizolowana
z Triticum aestivum (GERLACH I DYER, 1980),
�� 25S rDNA - odcinek kodujący geny 25S rRNA o długości 2,3 kpz,
otrzymany w wyniku trawienia fragmentu 18S-5,8S-26S rDNA
Arabidopsis thaliana (UNFRIED I GRUENDLER, 1990) enzymem
restrykcyjnym ClaI,
�� CentBr1 i CentBr2 sekwencje centromerowe o długości 176 pz,
wyizolowane z B. rapa (LIM I IN., 2005), wklonowane w wektory
pBluscript. Otrzymane z Department of Horticulture, Chungnam National
University, Daejeon, Korea.
3.5.1. Znakowanie DNA metodą PCR
Metodą PCR znakowano sondy 5S rDNA oraz CentBr1 i CentBr2. W celu
wyznakowania sond stosowano następującą mieszaninę reakcyjną: 10�bufor dla
polimerazy (Taq Polymerase Buffer, Promega); 0,1 mM nukleotydy - dNTP
(Promega); 0,04 mM znakowane nukleotydy (rodamina-5-dUTP lub
digoksygenina-11-dUTP); 0,4 �M startery pUC M13 (5`-CAG GGT TTT CCC
AGT CAC GA-3`) (5`-CGG ATA ACA ATT TCA CAC AGG A-3`); 2 jednostki
Materiał i metody 41
polimerazy Taq (Promega) oraz matrycowe DNA. Reakcję amplifikacji
prowadzono w termocyklerze (PCR-Gene Amp PCR System 9700), według
programu: 94�C przez 1 min., następnie 35 cykli: 94�C � 40 sek., 55�C � 40 sek.,
72�C � 1,5 min., następnie 72�C przez 5 minut.
Wyznakowaną sondę następnie precypitowano, dodając 3 M CH3COONa
w ilości 1/10 objętości końcowej mieszaniny oraz 99% alkohol etylowy zmrożony
do -20�C w objętości 2,5 razy całkowitej objętości mieszaniny reakcyjnej. Sondę
pozostawiano w temp. -20�C na noc, następnego dnia wirowano przez 30 min.
w temp. 4�C, przy 14000 rpm (wirówka mikro 22R, Hettich). Zlewano
supernatant, a pelet przemywano 70% etanolem (-20�C). Osad suszono
w urządzeniu Speed Vac (Savant) przez 5 10 min., następnie rozpuszczano w 10
mM TE i przechowywano w temperaturze -20�C.
3.5.2. Znakowanie DNA metodą nick-translacji
Metodą nick-translacji znakowano sondę 25S rDNA. Do znakowania
wykorzystano Nick Translation Kit (Roche). Skład mieszaniny reakcyjnej
stanowiły: dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP oraz znakowane digoksygenina-
11-dUTP lub rodamina-5-dUTP), 1,5-2 �g/�l DNA matrycowego, bufor
reakcyjny i mieszanina enzymów (DNA polimeraza I z E. coli i DNaza I z trzustki
ssaków). Reakcję amplifikacji prowadzono w termocyklerze, w temperaturze
15�C przez 95 minut, następnie inaktywowano enzymy w temperaturze 60�C
przez 12 - 16 minut. Po zakończeniu znakowania przeprowadzano precypitację
sondy.
3.5.3. Procedura FISH
Na preparaty nakrapiano 150 �l RNaz y o koncentracji 100 �l/ml
i inkubowano w wilgotnej komorze przez godzinę w temperaturze 37�C.
Następnie preparaty płukano dwukrotnie po 5 min. w 2�SSC. Kolejno
przenoszono do 1% formaldehydu w 1�PBS na 10 minut w temperaturze
pokojowej. Po płukaniu w 2�SSC (2 razy po 5 min.) preparaty odwadniano
w szeregu alkoholowym (70%, 90%, 99%) i suszono. Następnie,
Materiał i metody 42
przygotowywano mieszaninę hybrydyzacyjną, której skład przedstawiono poniżej
(Tab. 4).
Tab. 4 Skład mieszaniny hybrydyzacyjnej
Składniki Stężenie końcowe
100% formamid 50%
50% DS (siarczan dekstranu) 10%
20 x SSC 2 x SSC
10% SDS (dodecylosiarczan sodu) 0,25%
SSS DNA (blokujące DNA) 10 �g
Sonda 100 120 ng
Sterylna woda destylowana do 40 �l
Mieszaninę hybrydyzacyjną denaturowano w temperaturze 75�C przez 10
min. Zdenaturowaną sondę umieszczano na lodzie w celu stabilizacji
jednoniciowej struktury DNA. Następnie nakrapiano na preparaty 38 �l
mieszaniny hybrydyzacyjnej, nakrywano termostabilną folią. Preparaty
umieszczano w temocyklerze (Omnislide Thermal Cycler) i przeprowadzano
denaturację w temperaturze 70�C przez 5 min. Po zakończonej denaturacji
preparaty przenoszono do wilgotnej komory i pozostawiano w temperaturze 37�C
przez 16 - 18 godzin.
3.5.4. Płukania pohybrydyzacyjne
Dla sond CentBr stosowano siłę płukań wynoszącą 79% lub 85%,
natomiast dla sond 25S i 5S rDNA 79%. Siłę tę uzyskiwano inkubując preparaty
w temperaturze 42�C w roztworze odpowiednio 10% lub 20% dejonizowanego
formamidu w 0,1�SSC, odpowiednio dla siły płukań 79% i 85%. Płukania
powtarzano dwukrotnie po 4 minuty. Następnie preparaty płukano w 2�SSC (2
razy w temp. 42�C oraz 2 razy w temp. pokojowej, każdorazowo po 3 min).
W przypadku stosowania sond znakowanych wyłącznie rodaminą, preparaty
odwadniano w szeregu alkoholowym (70%, 90%, 99%), następnie suszono
i zamykano w buforze Vectashield z DAPI.
Materiał i metody 43
3.5.5. Detekcja i amplifikacja sygnałów
Sondy znakowane digoksygeniną, wykrywano z wykorzystaniem
przeciwciał pierwszorzędowych skoniugowanych z izotiocyjanianem fluoresceiny
FITC (anty-dig-fluoresceine, Roche). W tym celu preparaty płukano w 4�SSC
z 0,2% Tween 20 przez 5 min. w temp. pokojowej. Następnie na preparaty
nakrapiano blok w postaci 5% odtłuszczonego mleka i inkubowano przez 30 min.
w temp. pokojowej. Następnie, na preparaty nakrapiano 40 �l I-rzędowego
przeciwciała, w rozcieńczeniu 1:11 w mleku (w/w) i inkubowano w temp. 37�C
przez godzinę. Kolejno przeprowadzano trzykrotne płukania w 4�SSC z 0,2%
Tween 20 w temp. 37�C. Odwadniano preparaty w szeregu alkoholowym,
suszono i zamykano w buforze Vectashield z DAPI.
3.6. IZOLACJA CAAKOWITEGO GENOMOWEGO DNA
METOD MIKRO-CTAB
Liście do izolacji DNA zbierano z 7 dniowych roślin. Zbierano zawsze
pierwsze pojawiające się liście, będące w porównywalnej dla analizowanych
gatunków wielkości. Liście suszono w woreczkach strunowych, wypełnionych
substancją o właściwościach higroskopijnych - silica gel (Sigma), przez co
najmniej tydzień. Dobrze wysuszone kawałki liści (ok. 0,03g) umieszczano
w probówkach typu eppendorf (2,2 ml), do których wsypywano po 5 - 6
szklanych kulek. Następnie eppendorfy umieszczano w młynie (Retsch MM 200)
i mielono tkankę przez 20 min. przy częstotliwości 30 drgań na sekundę. Dla
wszystkich gatunków, prócz przygotowania próbek indywidualnych z każdej
rośliny, stworzono także pulę tkanki, tzw. bulk , po 6 - 8 fragmentów liści
z różnych roślin danego gatunku. DNA ze wszystkich próbek izolowano
zmodyfikowaną metodą mikro C-TAB (DOYLE I DOYLE, 1987). Do
rozdrobnionej tkanki dodawano 1 ml podgrzanego buforu ekstrakcyjnego C-TAB,
następnie delikatnie mieszano i inkubowano próbki w temperaturze 60�C przez 30
min. w termomikserze (Eppendorf Thermomixer comfort). Po inkubacji
dodawano 800 �l roztworu chloroform alkohol izoamylowy, w stosunku 24 : 1
Materiał i metody 44
i dokładnie mieszano zawartość eppendorfów przez kilkukrotne ich odwrócenie.
Następnie próbki wirowano przez 20 min. przy 14000 rpm, w temp. 4�C
(wirówka mikro 22R, Hettich). Supernatant przenoszono do nowej probówki
eppendorfa i dodawano po raz drugi 600 ml roztworu chloroform alkohol
izoamylowy (24 : 1). Powtórnie wirowano przez 10 min. przy 14000 rpm,
w temp. 4�C. Po przeniesieniu supernatantu dodawano do niego 1 ml 95%
etanolu, w celu wytrącenia osadu kwasów nukleinowych, wirowano przez 20 min
przy 14000 rpm. Osad przemywano 1ml 70% etanolu i wirowano dwukrotnie
przez 5 min., następnie suszono w urządzeniu Speed Vac (Savant) przez 5 10
min. Do wysuszonego osadu dodawano 100 �l buforu TE i pozostawiano próbki
na noc w temp. 4�C, do całkowitego rozpuszczenia osadu. W celu usunięcia
komórkowego RNA próby inkubowano z roztworem RNazy o stężeniu 0,1 mg/ml
w temperaturze 37�C przez 60 minut. DNA przechowywano w temperaturze
-20�C.
3.6.1. Pomiar koncentracji i czystości wyizolowanego DNA
Pomiar koncentracji i czystości DNA wykonano przy zastosowaniu
spektrofotometru (NanoDrop ND-1000). Koncentrację DNA mierzono przy
długości fali 260 nm, a czystość DNA oznaczano na podstawie stosunku
współczynnika absorbancji przy długości fali A260/A280 (ratio A260/280). W celu
sprawdzenia, czy wyizolowany DNA nie jest zdegradowany, wykonano
elektroforezę DNA w 1% żelu agarozowym, jako buforu elektrodowego użyto
0,5�TBE z bromkiem etydyny o stężeniu 0,5 �g/ml.
3.7. ANALIZA POZIOMU METYLACJI DNA Z WYKORZY-
STANIEM TECHNIKI MSAP (METHYLATION
SENSITIVE AMPLIFICATION POLYMORPHISM)
W technice MSAP stosowano enzymy metylowrażliwe, częstotnące - MspI
i HpaII oraz rzadkotnący enzym EcoRI. Szczegółowe dane dotyczące
wykorzystywanych w reakcji MSAP enzymów, adaptorów i starterów
przedstawiono w Tab. 5.
Materiał i metody 45
Tab. 5 Odczynniki stosowane w reakcjach MSAP
Nazwa Sekwencja yródło
ENZYMY
Rozpoznaje
New England
Enzym EcoRI
BioLabs
sekw. 5 GAATTC3
Rozpoznaje New England
Enzym MspI/HpaII
sekw. 5 CCGG3 BioLabs
ADAPTORY
5 CTCGTAGACTGCGTACC3
Adaptor EcoRI M. Huber
5 AATTGGTACGCAGTCTAC3
5 GACGATGAGTCCTGAA3
Adaptor MspI/HpaII MWG Biotech
5 CGTTCAGGACTCAT3
STARTERY DO PREAMPLIFIKACJI
Starter EcoRI + A 5 GACTGCGTACCAATTCA3 M. Huber
Starter MspI/HpaII + T 5 GATGAGTCCTGAACGGT3 M. Huber
STARTERY DO AMPLIFIKACJI SELEKTYWNEJ
Startery EcoRI + ACT,
ACC, ATC, AGG 5 GACTGCGTACCAAT TCA (CCA, CTA)3 MWG Biotech
5 IRD800
Startery MspI/HpaII +
5 GATGAGTCCTGAACGG AAC (TGC,
AAC, TGC, AAG, MWG Biotech
AAG)3
TAC
3.7.1. Reakcje restrykcji z użyciem enzymów metylowrażliwych
Wyizolowany DNA rozcieńczano sterylną wodą dejonizowaną do
koncentracji 50 ng/�l. Następnie przygotowywano mieszaninę do reakcji
restrykcji, której skład przedstawiono poniżej (objętość na 1 próbkę):
dd H2O 12,6 l
10 � NE bufor 2 2 l
EcoRI (20 U/ l) 0,125 l
MspI (20 U/ l) 0,125 l lub
HpaII (10 U/ l) 0,25 l
Materiał i metody 46
Reakcję restrykcji przygotowywano osobno dla enzymu MspI + EcoRI oraz HpaII
+ EcoRI. Do mieszaniny restrykcyjnej dodawano 5 l DNA (50 ng/�l) i reakcję
restrykcji prowadzono w temperaturze 37�C przez 3 godziny. Następnie
inaktywowano enzymy restrykcyjne w temp. 70�C przez 15 min.
3.7.2. Reakcje ligacji adaptorów do miejsc restrykcyjnych
Ze stoków jednoniciowych adaptorów wykonano roztwór dwuniciowych
adaptorów, osobno dla EcoRI, HpaII i MspI, o stężeniu odpowiednio: 5 pmol/ l
i 50 pmol/ l. Następnie sporządzono mieszaninę reakcyjną do ligacji adaptorów
(objętość na 1 próbkę):
dd H2O 1,8 l
10 bufor dla ligazy 1 l
adaptor MspI /HpaII(50 pmol/ l) 0,6 l
adaptor EcoRI (5 pmol/ l) 0,6 l
T4 DNA ligaza (1U/ l) (MBI Fermentas) 0,6 l
Do próbek po restrykcji dodawano po 5 �l mieszaniny ligacyjnej, zwirowywano
i prowadzono ligację w temp. 37�C przez 16 18 godz.
3.7.3. Preamplifikacja i amplifikacja selektywna fragmentów DNA
Ze stoków primerów do preamplifikacji wykonano rozcieńczenia, aby
uzyskać finalną koncentrację 50 ng/�l dla primera EcoRI+A i MspI/HpaII+T.
Mieszanina reakcyjna do preamplifikacji (objętość na 1 próbkę) zawierała:
dd H2O 4,1 l
10 bufor 0,6 l
dNTPs (5mM) (Promega) 0,2 l
Primer MspI/HpaII+T 0,15 l
Primer Eco+A 0,15 l
Polimeraza Taq (2U/ l) (Promega) 0,1 l
Mieszaninę do preamplifikacji rozpipetowywano do nowych probówek po 5,3 �l
i dodawano 0,7 �l DNA po ligacji. Reakcję preamplifikacji prowadzono
w termocyklerze (PCR-Gene Amp PCR System 9700) w warunkach: wstępna
Materiał i metody 47
denaturacja - 94�C przez 2 min, następnie 20 cykli: denaturacja - 94�C przez 30
sek., przyłączanie starterów - 52�C przez 30 sek. i elongacja 72 �C przez 1 min.
Produkty reakcji preamplifikacji rozcieńczano pięciokrotnie w sterylnej wodzie
dejonizowanej, a następnie pobierano do reakcji amplifikacji selektywnej
z użyciem starterów posiadających trzy selektywne nukleotydy na końcu 3
(Tabela 4.). Reakcję amplifikacji selektywnej prowadzono w następujących
warunkach: wstępna denaturacja - 94�C przez 2 min, następnie 12 cykli:
denaturacja - 94�C przez 30 sek., przyłączanie starterów - 65�C-56,6�C (12
kroków o 0,7�C) przez 30 sek. i elongacja - 72�C przez 1 min; następnie 23 cykle:
denaturacja - 94�C przez 30 sek., przyłączanie starterów - 56�C przez 30 sek.
i elongacja - 72�C przez 1 min.
3.7.4. Wizualizacja produktów amplifikacji selektywnej
Produkty amplifikacji selektywnej wizualizowano przez elektroforezę
w 6% denaturującym żelu poliakrylamidowym. W tym celu sporządzano
mieszaninę żelową, która zawierała: 7M mocznik, 10�TBE, 30% AA
(akrylamid/bisakrylamid, Sigma), temed oraz 10% APS (nadsiarczyn amonu).
Następnie, przygotowywano szyby do elektroforezy w automatycznym
sekwenatorze (Li-Cor). Na dolnej szybie układano spacery , przykrywano górną
szybą i zakładano szyny zaciskające obie szyby. Wylewano mieszaninę żelową
między szyby i wkładano grzebień wyznaczający czoło żelu. Następnie, żel
pozostawiano na 1 godz. do całkowitego spolimeryzowania. Po wyznaczonym
czasie wyciągano grzebień, dokładnie czyszczono czoło żelu, a grzebień
wkładano odwrotnie tak, aby wyznaczał ścieżki elektroforezy. Pojemniki aparatu
wypełniano buforem 1�TBE. Następnie, prowadzono elektroforezę wstępną, tzw.
pre-run przez 20 min., stosując parametry: 3000 V, 35 mA i 40 W. Po jej
zakończeniu czyszczono kieszonki żelu buforem i nakładano do nich 1 �l
zdenaturowanego (94�C, 3 min.) DNA ze stop buforem . Do skrajnej kieszonki
nakładano 0,6 �l markera wielkości (Li-Cor). Elektroforezę prowadzono przez 4
godziny.
Materiał i metody 48
3.8. IZOLACJA DNA PLAZMIDOWEGO (CENTBR1
I CENTBR2) Z KULTUR BAKTERYJNYCH
Izolację DNA plazmidowego przeprowadzono z wykorzystaniem kitu
firmy Qiagen, według protokołu producenta. Bakterie E. coli zawierające wektory
pBluscript hodowano na pożywce stałej zestalonej agarem (LA) i płynnej LB.
Pożywki sterylizowano w autoklawie, w temperaturze 121�C i ciśnieniu 0,1 MPa
przez 20 minut. Po wystudzeniu pożywek do temp. ok. 50�C, dodawano do nich
antybiotyk ampicylinę, o stężeniu 100 mg/ml. Płynne hodowle bakteryjne
prowadzono w sterylnych probówkach typu Falcon o pojemności 25 ml,
w temperaturze 37�C z wytrząsaniem o częstotliwości 200 drgań/minutę przez 20
godzin. Następnie, zlewano zawiesinę do probówek 2,2 ml i wirowano przez 5
min. przy 4 000 rpm (wirówka mikro 22R, Hettich). Czynność powtarzano w tych
samych probówkach do momentu całkowitego zlania zawiesiny bakteryjnej
z falkonów. Następnie supernatant usuwano, a do osadu bakteryjnego dodawano
250 �l schłodzonego do 4�C buforu P1. Po rozbiciu osadu dodawano 250 �l
buforu P2, kilkakrotnie mieszano. Na końcu dodawano 250 �l schłodzonego do
temperatury 4�C buforu P3 i wirowano przy 13 000 rpm przez 10 minut
w temperaturze pokojowej. Supernatant dekantyzowano na kolumnach
osadzonych w nowych probówkach i wirowano przy 10 000 rpm przez 1 min.
w temperaturze pokojowej. Następnie kolumny przenoszono do nowych
probówek i przemywano 700 �l buforu PE i wirowano 1 min. przy 10 000 rpm.
Po odwirowaniu pozostałości po buforze przemywającym przeprowadzano elucję
DNA, dodając 30 �l buforu EB, następnie wirowano 1 min. przy 14 000 rpm.
Kolumny usuwano, a wyizolowane DNA przechowywano w temp. -20�C. DNA
po amplifikacji i wyznakowaniu metodą PCR (w/w), wykorzystywano jako sondy
do hybrydyzacji in situ.
Materiał i metody 49
3.9. REJESTRACJA OBRAZÓW W MIKROSKOPIE
FLUORESCENCYJNYM, KONFOKALNYM
I CYTOMETRZE OBRAZOWYM
Mikroskop szerokiego pola
W badaniach wzoru metylacji DNA oraz lokalizacji sekwencji
powtarzalnych, techniką FISH, wykorzystano mikroskop epifluorescencyjny
Olympus Provis, wyposażony w lampę rtęciową (160 W). Fluorescencja DAPI
(absorpcja 325 - 375 nm, emisja 440 - 475 nm), Alexa488 (abs. 475 - 495 nm, em.
520 - 560 nm), rodaminy (Tetramethylrodamine, maksimum abs. 555 nm,
maksimum em. 580 nm) oraz fluoresceiny (FITC, maksimum abs. 494 nm,
maksimum em. 518 nm) rejestrowane były przy użyciu kamery CCD Hamamatsu
c5810.
Mikroskop konfokalny
Do analizy wzoru modyfikacji histonów wykorzystano system konfokalny
FV1000, wyposażony w mikroskop odwrócony - Olympus IX81 (obiektyw
60xPlanApo), 50 mW diodę laserową 405 nm (Coherent BV, The Netherlands)
oraz 100 mW wieloliniowy laser argonowo-jonowy (Melles Griot BV, The
Netherlands). Intensywność światła wzbudzającego była regulowana przy pomocy
filtra akustooptycznego (AOTF). Przekroje optyczne przez jądra w osi Z
(z-stocks) były rejestrowane przy użyciu dwóch oddzielnych fotopowielaczy
(R6357 Haamamatsu, Japonia), pracujących w trybie integracji przy 4 źs w czasie
rezydencji piksela oraz 12-bitowej precyzji digitalizacji sygnału. Fluorescencję
DAPI i Alexa488 rejestrowano sekwencyjnie, celem przeciwdziałania aliasingowi
spektralnemu. Przekroje w osi Z były rejestrowane przy przesłonie konfokalnej
(confocal pinhole) ustawionej na 1.0. Grubość skrawków w osi Z wynosiła 330
nm.
Cytometr obrazowy
Wzór acetylacji histonów analizowano z wykorzystaniem
cytometru obrazowego Olympus SCAN^R wyposażonego w kamerę Hamamatsu
Materiał i metody 50
Orca AG CCD. Segmentację obrazów przeprowadzono stosując wartość progową
static thresolding , wyliczoną na podstawie algorytmu. Współczynniki
kolokalizacji Pearsona (P) wyliczono przy użyciu programu Matlab 7.1
(MathWorks Inc.). Uzyskane dane pogrupowano w dwie kategorie: o wysokiej
(P>0,65) i niskiej (P<=0,65) wartości współczynnika. Pomiaru intensywności
fluorescencji DAPI i Alexa488 dokonywano piksel po pikselu, z poszczególnych
jąder interfazowych.
3.10. SKAAD ROZTWORÓW WYKORZYSTYWANYCH
W BADANIACH
Bufor cytrynianowy pH 4,8
A. 0,1 M C6H8O7�H2O
B. 0,1 M C6H5Na3O7�2 H2O
Aączono 40 ml roztworu A i 60 ml roztworu B (roztwór podstawowy). Przed
użyciem rozcieńczano wodą destylowaną w stosunku 1:9 (roztwór stosowany).
Bufor do izolacji DNA
2% CTAB
100 mM Tris-HCl pH 8
1,4 M NaCl
20 mM EDTA pH 8
1% 2-merkaptoetanol
Bufor EB
10 mM Tris-Cl
Bufor TE
10 mM Tris-HCl pH 8
1 mM EDTA pH 8
Materiał i metody 51
Bufor P1
15 mM Tris-HCl pH 8
10 mM EDTA pH 8
100 �g/ml roztwór RNazy A
Bufor P2
0,2 N NaOH
1% SDS
Bufor P3
3 M octan potasu pH 5,5
Mieszanina do żeli poliakrylamidowych
Mocznik 7M
10�TBE
30% AA (akrylamid/bisakrylamid)
TEMED
10% APS ( nadsiarczyn amonu)
Woda destylowana
Podłoże LB o pH 7,2
1% baktotrypton (DIFCO)
0,5% ekstrakt drożdżowy (POCH Polskie Odczynniki Chemiczne)
1% NaCl
Ampicylina
Roztwór żelu agarozowego
150 ml 0,5xTBE
1,5 g agar (Sigma)
woda destylowana
Materiał i metody 52
Roztwór 8-hydroksychinoliny
0,28 g substancji rozpuszczono w 1 litrze wody destylowanej o temperaturze 60�C
i mieszano na mieszadle magnetycznym do rozpuszczenia, przechowywano 4�C
w ciemności.
Stałe podłoże LA pH 7,2
Podłoże LB pH 7,2
15 g/L agar (DIFCO)
Stop bufor do elektroforezy w żelach poliakrylamidowych
Formamid 98%
10 mM EDTA pH 8
Bromofenol blue + Cyanol
10 x PBS pH 7,3
137 mM NaCl,
2.7 mM KCl,
4.3 mM Na2HPO4�2H2O,
1.4 mM KH2PO4
10 x PBS pH 7
140 mM NaCl
10 mM Na2HPO4�2H2O
10 x TBE (objętość na 1 litr)
324 g Tris
55 g kwasu borowego
18,6 g EDTA 0,5 M pH 8
woda destylowana
20 x SSC pH 7
3 M NaCl
0,3 M C6H5Na3O7�2 H2O
Wyniki 53
4. WYNIKI
4.1. TYPY JDER INTERFAZOWYCH OBSERWOWANYCH
U GATUNKÓW BRASSICA
U badanych gatunków Brassica wyróżniono różne typy jąder
interfazowych, podziału dokonano ze względu na obecność lub brak
chromocentrów oraz ze wzgledu na ich wielkość. U B. rapa wszystkie
obserwowane jądra interfazowe chrakteryzowały się występowaniem wyraznych
chromocentrów (Ryc. 3A), w części jąder większość tych chromocentrów była
podobnej wielkości (Ryc. 3B), znacznie częściej jednak poszczególne
chromocentra chrakteryzowały się zróżnicowanymi rozmiarami. Obserwowano
najczęściej od 12 - 16 chromocentrów w jądrze interfazowym. U B. oleracea
można było wyróżnić dwa główne typy jąder: z wyraznie zaznaczonymi
chromocentrami różnej wielkości (Ryc. 3C) oraz takie gdzie heterochromatyna
była rozmieszczona bardziej równomiernie w całym jądrze (Ryc. 3D). W tym
typie jąder można było wyróżnić jedynie małe domeny/skupienia
heterochromatyny w obrębie obszarów euchromatynowych. Natomiast u gatunku
allotetraploidalnego zdecydowana wiekszość jąder interfazowych
chrakteryzowała się wyraznie zaznaczonymi chromocentrami, przeważnie
o różnej wielkości (Ryc. 3E). Największe chromocentra występowały zazwyczaj
w liczbie 20 - 25 w jądrze interfazowym.
Takie zróżnicowane rozmieszczenie heterochromatyny w jądrach
interfazowych analizowanych gatunków, odbiega od tego obserwowanego
u A. thaliana, gdzie prócz wyraznie zaznaczonych chromocentrów nie obserwuje
się mniejszych skupisk heterochromatyny.
Wyniki 54
4.2. LOKALIZACJA SEKWENCJI 25S, 5S rDNA ORAZ
SEKWENCJI CENTROMEROWYCH CENTBR1
I CENTBR2.
Lokalizację genów rRNA i sekwencji centromerowych badano
w chromosomach metafazowych. Przeprowadzono także analizę lokalizacji
sekwencji centromerowych w jądrach interfazowych form uprawnych gatunków
Brassica. Dla każdego gatunku badano średnio 10 - 15 płytek metafazowych,
natomiast w przypadku jąder interfazowych średnio po 20 - 30 z różnych miejsc
na preparacie.
4.2.1. Lokalizacja sekwencji 5S i 25S rDNA w chromosomach
metafazowych u form uprawnych i RC gatunków Brassica
U form uprawnych gatunków Brassica stwierdzony został polimorfizm
liczby i rozmieszczenia loci 5S i 25S rDNA w chromosomach metafazowych
(HASTEROK I IN., 2001). W pracy potwierdzono występowanie polimorfizmu
i przedstawiono najczęściej obserwowane typy chromosomów u obu
analizowanych form. Zauważono, iż liczba sygnałów dla sekwencji rDNA
w chromosomach była zawsze taka sama u gatunku B. oleracea, natomiast
najczęstszym zmianom liczby i lokalizacji loci rDNA podlegały genomy B. rapa
i B. napus.
U obu form B. oleracea stwierdzono występowanie 4 sygnałów dla sondy
25S rDNA i 2 dla 5S rDNA (Ryc. 4C, 4D, 5C, 5D). Sekwencję 25S rDNA
zlokalizowano w obszarze przewężenia wtórnego i satelity w jednej parze
chromosomów, natomiast w drugiej parze geny 25S rDNA występowały na końcu
krótkiego ramienia chromosomu. Sekwencję 5S rDNA zlokalizowano
przycentromerowo w jednej parze chromosomów.
U gatunku B. rapa formy uprawnej stwierdzono 8 sygnałów dla sondy 25S
rDNA i tyle samo dla 5S rDNA (Ryc. 4A, 4B). Dwie pary chromosomów
posiadały oba sygnały: w parze chromosomów NOR sonda 25S rDNA zajmowała
obszar przewężenia wtórnego i satelity, natomiast sonda 5S rDNA kolokalizowała
Wyniki 55
z nią przytelomerowo, a w drugiej parze chromosomów obie sondy
kolokalizowały w obszarze przycentromerowym. U tej formy zidentyfikowano
także 2 pary chromosomów z sekwencją 5S rDNA, w jednej zlokalizowana ona
była przycentromerowo, natomiast w drugiej parze chromosomów terminalnie.
Wyróżniono także dwie pary chromosomów z sygnałami dla sondy 25S rDNA,
zlokalizowanymi przycentromerowo. U formy RC B. rapa obserwowano podobne
typy chromosomów, przy czym występowały tu jedna (Ryc. 5A) lub dwie pary
(Ryc. 5B) chromosomów z przycentromerowo zlokalizowaną sekwencją 25S
rDNA.
U formy uprawnej B. napus stwierdzono występowanie 10 (Ryc. 4F) lub
12 (Ryc. 4E) sygnałów dla sondy 25S rDNA i 10 dla sondy 5S rDNA, a u formy
RC 12 dla 25S rDNA i 10 (Ryc. 5F) lub 12 (Ryc. 5E) dla 5S rDNA. Obie formy
posiadały jedną parę chromosomów NOR z sondą 25S rDNA zlokalizowaną
w obrębie przewężenia wtórnego i satelity oraz kolokalizującą z nią terminalnie
sekwencją 5S rDNA. U formy uprawnej występowały 2 pary chromosomów
z przycentromerowo lub interstycjalnie zlokalizowanymi obiema sekwencjami.
Natomiast u formy RC obserwowano dwie lub trzy takie pary chromosomów.
U obu form występowało także po jednej parze chromosomów z terminalnie
i przycentromerowo zlokalizowanymi sekwencjami 5S rDNA. Natomiast
sekwencję 25S rDNA w okolicy centromeru wykryto w jednej lub dwóch parach
chromosomów u obu form. Tą samą sekwencję, ale zlokalizowaną terminalnie
posiadała jedna para chromosomów także u obu analizowanych form.
4.2.2. Sekwencje centromerowe CentBr1 i CentBr2 w chromosomach
metafazowych i jądrach interfazowych
U wszystkich badanych gatunków obie sondy zlokalizowano w obrębie
centromerów. Nie stwierdzono różnic w rozmieszczeniu badanych sond
w chromosomach i jądrach interfazowych, między formą uprawną i RC gatunków
Brassica. Zaobserwowano różną intensywność sygnałów w poszczególnych
chromosomach. Część chromosomów posiadała sygnały wyraznie większe
i o intensywniejszej fluorescencji od pozostałych. Dla każdego gatunku
analizowano średnio 10 płytek metafazowych oraz 20 jąder interfazowych.
Przedstawione wyniki pochodzą z FISH, w której zastosowano 79% siłę płukań.
Wyniki 56
Lokalizacja sekwencji CentBr1
U B. rapa sondę CentBr1 zlokalizowano w 9 parach chromosomów. Jedna
para chromosomów NOR posiadała bardzo słabe sygnały, które nie były
widoczne w części analizowanych płytek metafazowych. Sygnały u tego gatunku
charakteryzowały się różną intensywnością fluorescencji, przy czym 4
chromosomy posiadały mniejsze sygnały o słabszej intensywności fluorescencji
(Ryc. 6A). U drugiego gatunku diploidalnego sondę CentBr1 zlokalizowano we
wszystkich 9 parach chromosomów. Jednakże cztery chromosomy
charakteryzowały się mniejszymi sygnałami o słabszej fluorescencji (Ryc. 6B).
U allotetraploidalnego B. napus obserwowano najczęściej 34 chromosomy
z sygnałami dla CentBr1 (Ryc. 6C).
W jądrach interfazowych B. rapa i B. oleracea stwierdzono najczęściej 16
- 18 sygnałów dla sondy CentBr1 (Ryc. 7A, B), natomiast u B. napus 24 - 30
sygnałów, przy czym 18 - 20 z nich było znacznie intensywniejszych od
pozostałych (Ryc. 7C).
Lokalizacja sekwencji CentBr2
Sondę CentBr2 zlokalizowano we wszystkich chromosomach u trzech
badanych gatunków Brassica. Obserwowano 4 intensywniejsze sygnały
w chromosomach B. rapa (Ryc. 8A). B. oleracea i B. napus charakteryzowały się
sygnałami o podobnej intensywności fluorescencji w poszczególnych
chromosomach (Ryc. 8B, C). W jądrach interfazowych B. rapa obserwowano
najczęściej 16 - 20 sygnałów (Ryc. 9A), B. oleracea 18 sygnałów (Ryc. 9B),
natomiast B. napus 34 - 36 sygnałów (Ryc. 9C).
Sekwencje centromerowe CentBr1 i CentBr2 kolokalizowały ze sobą
w obrębie centromerów. Chromosomy charakteryzujące się silniejszymi
sygnałami dla jednej z sond, posiadały zazwyczaj dużo słabsze sygnały dla
drugiej. U B. rapa, B. oleracea i B. napus większość chromosomów
posiadających mocne sygnały dla sondy CentBr1 miało dużo słabsze sygnały dla
sondy CentBr2 (Ryc. 10A-D, 11A, B).
W jądrach interfazowych analizowanych gatunków najczęściej
obserwowano intensywne sygnały dla obu sond, które w większości
chromocentrów kolokalizowały ze sobą. Jądra interfazowe B. rapa posiadały 4
intensywne sygnały dla sondy CentBr2, te same chromocentra charakteryzowały
Wyniki 57
się znacznie słabszymi sygnałami dla CentBr1 (Ryc. 12A, B). U B. oleracea
i B. napus większość intensywnych sygnałów dla obu sond pokrywało się
w chromocentrach (Ryc 12C - F).
4.3. ANALIZA POZIOMU METYLACJI DNA
Z WYKORZYSTANIEM TECHNIKI MSAP
W badaniach poziomu metylacji cytozyny w sekwencji CCGG,
wykorzystywano enzymy metylowrażliwe MspI i HpaII. Przeprowadzano dwa
etapy analizy, mające na celu identyfikację loci polimorficznych między
systemami MspI/HpaII oraz loci polimorficznych między badanymi gatunkami
Brassica. W pracy porównywano wzór metylacji cytozyn w sekwencji CCGG
między formami uprawnymi i RC, a także wzór metylacji u gatunku
allotetraploidalnego i jego gatunków ancestralnych. Dany locus klasyfikowano
jako demetylowany u danej formy/gatunku, jeżeli nie stwierdzono metylacji
żadnej z cytozyn w sekwencji CCGG, podczas gdy u drugiej formy/gatunku
w tym samym locus obserwowano metylację obu cytozyn. Jako hipermetylowany
klasyfikowano locus u danej formy/gatunku, jeżeli obie cytozyny w sekwencji
CCGG pozostawały zmetylowane, podczas gdy u drugiej formy/gatunku obie
cytozyny nie były metylowane. Jeżeli zmiana metylacji dotyczyła wyłącznie
jednej cytozyny, danego locus nie klasyfikowano jako demetylowany bądz
hipermetylowany.
Pierwsze reakcje MSAP przeprowadzano przygotowując podwójne reakcje
restrykcji dla każdego z izoschizomerów. Skład obu mieszanin reakcyjnych był
ten sam. Przygotowanie podwójnych reakcji restrykcji miało na celu sprawdzenie
poprawności działania enzymów. O prawidłowo przeprowadzonej reakcji
restrykcji wnioskowano po analizie wzoru prążkowego uzyskanego po cięciu
DNA odpowiednim enzymem. W przypadku, gdy nie stwierdzono różnic we
wzorze prążkowym dla podwójnych restrykcji, dalszą część reakcji MSAP
prowadzono wykorzystując pojedyncze restrykcje.
Wyniki 58
4.3.1. Kontrola jakości i koncentracji wyizolowanego DNA
Reakcje MSAP prowadzono na DNA genomowym trzech analizowanych
gatunków Brassica. Czystość i koncentrację wyizolowanego DNA mierzono
z wykorzystaniem spektrofotometru, wyniki pomiarów zamieszczono w Tab. 6.
Tab. 6 Wyniki pomiarów spektrofotometrycznych DNA wykorzystywanego
w reakcjach MSAP
Gatunek Koncentracja (ng/�l) Czystość
B. rapa uprawny 1822,7 2,15
B. rapa RC 3417,2 2,15
B. oleracea uprawny 2779,3 2,15
B.oleracea RC 2991,5 2,11
B. napus uprawny 2708,4 2,11
B. napus RC 2288,1 2,15
Koncentracja DNA mieściła się w przedziale między 1800 a 3400 ng/�l,
natomiast czystość w prawidłowym przedziale współczynnika A260/280
wynoszącym 1,8 2,5. Uzyskana koncentracja DNA była wystarczająca do
przeprowadzenia reakcji MSAP, do których wykorzystywano DNA o koncentracji
50 ng/�l. Jakość wyizolowanego DNA sprawdzano również poprzez elektroforezę
w żelu agarozowym (Ryc. 13). Wszystkie badane próbki nie wykazywały cech
DNA zdegradowanego, o czym świadczyło występowanie w żelu jednego
wyraznego prążka dla danego gatunku.
1 2 3 4 5 6
Ryc. 13 Zdjęcie żelu agarozowego z DNA genomowym gatunków Brassica
(marker wielkości, 1 - B. oleracea RC, 2 B. oleracea uprawny, 3 B. rapa
RC, 4 - B. rapa uprawny, 5 - B. napus RC, 6 - B. napus uprawny)
Wyniki 59
4.3.2. Reakcje restrykcji z użyciem enzymów MspI i HpaII
Analiza wzoru prążkowego dla podwójnych reakcji restrykcji z enzymami
EcoRI/MspI, nie wykazała występowania prążków polimorficznych między tymi
restrykcjami w badanych loci. W celu potwierdzenia poprawności obserwacji
wzoru prążkowego, zastosowano program ImageJ z funkcją analizy żeli. Na
podstawie analizy przeprowadzonej w programie ImageJ dla wszystkich
gatunków Brassica, nie stwierdzono różnic w przebiegu poszczególnych
histogramów reprezentujących podwójne reakcje restrykcji z enzymami
EcoRI/MspI. Przykładowe wyniki dla gatunku B. oleracea, przedstawiono na Ryc.
14. Poniżej zamieszczono również fragment żelu, na którym przeprowadzono
analizę w programie ImageJ (Ryc. 15).
Ryc. 14 Porównanie wzoru prążkowego podwójnych reakcji restrykcji
u B. oleracea (enzym EcoRI/MspI, kombinacja starterów: E ACT,
H/M AAC)
Wyniki 60
Ryc. 15 Fragment żelu poliakrylamidowego przedstawiający wzór prążkowy
dla podwójnych reakcji restrykcji DNA gatunku B. oleracea
(prostokąt), (enzym EcoRI/MspI, kombinacja starterów: E ACT,
H/M AAC)
Dwa histogramy reprezentujące podwójne reakcje restrykcji dla enzymów
EcoRI/MspI (Ryc. 14) nie różnią się od siebie pod względem ilości i miejsca
występowania pików. Nieznaczne różnice występują jedynie w wysokości
poszczególnych pików, co uwarunkowane jest różną intensywnością fluorescencji
prążków w danym locus.
Taką samą analizę przeprowadzono dla podwójnych reakcji restrykcji
z enzymami EcoRI/HpaII. W tym przypadku jednak, stwierdzono występowanie
różnic we wzorze prążków między tymi restrykcjami. Średnio od 3 do 5 loci
w analizowanej kombinacji starterów, było polimorficznych między obiema
reakcjami restrykcji. Z tego względu zdecydowano się prowadzić pozostałą część
reakcji MSAP na podwójnych restrykcjach dla enzymów EcoRI/HpaII. Dalszej
analizie poddawano wówczas tylko loci niepolimorficzne między podwójnymi
restrykcjami.
Wyniki 61
4.3.3. Reakcje amplifikacji selektywnej oraz analiza wzoru prążkowego
Analizę poziomu metylacji cytozyny w sekwencji CCGG przeprowadzono
stosując osiem kombinacji starterów do amplifikacji selektywnej. Startery te
różniły się sekwencją trzech nukleotydów na końcu 3 (Tab. 7).
Tab. 7 Sekwencja nukleotydów na końcu 3 starterów wykorzystywanych
w amplifikacji selektywnej
Sekwencja nukleotydów 3 Sekwencja nukleotydów 3
EcoRI HpaII/MspI
E - ACT H/M - AAC
E - ACT H/M - TGC
E - ACT H/M - TAC
E - ACT H/M - AAG
E - ATC H/M - AAG
E - ACC H/M - TGC
E - ACC H/M - TAC
E - ACG H/M - AAC
Zastosowanie ośmiu kombinacji starterów w amplifikacji selektywnej umożliwiło
analizę dostatecznej liczby loci polimorficznych między systemami MspI i HpaII
oraz między poszczególnymi formami/gatunkami Brassica.
Dane zestawione w Tab. 8 11 odnoszą się do wszystkich analizowanych
kombinacji starterów w amplifikacji selektywnej. W Tab. 8 przedstawiono
porównawcze wyniki poziomu metylacji DNA u badanych gatunków Brassica.
Stwierdzono najwyższy poziom metylacji u formy uprawnej B. rapa wynoszący
ponad 43%, natomiast najniższy procent metylacji wykazano dla formy RC tego
samego gatunku. Formy uprawne B. rapa oraz B. napus charakteryzowały się
wyższym procentem metylacji w porównaniu do form RC. Odwrotną sytuację
zaobserwowano dla gatunku B. oleracea, gdzie metylacja u formy RC była
nieznacznie wyższa, niż u formy uprawnej. Największe różnice w poziomie
metylacji między formami uprawnymi, a formami RC zaobserwowano dla
gatunku B. rapa prawie 14%, podczas gdy różnica ta u pozostałych gatunków
nie przekraczała 5%.
Wyniki 62
Tab. 8 Poziom metylacji DNA u gatunków Brassica
Gatunek/forma Liczba Liczba loci Metylacja w sekwencji
analizowanych loci polimorficznych CCGG (%)*
między HpaII a MspI
B. rapa uprawny 153 66 43,1
B. rapa RC 195 57 29,2
B. oleracea uprawny 248 94 37,9
B. oleracea RC 240 93 38,7
B. napus uprawny 249 88 35,3
B. napus RC 271 76 30,5
* Odchylenie standardowe ą5%
W pracy analizowano również liczbę loci demetylowanych
i hipermetylowanych u form uprawnych i RC. Dany locus klasyfikowano, jako
demetylowany, jeżeli nie stwierdzono metylacji żadnej z cytozyn w sekwencji
CCGG u formy RC, natomiast u formy uprawnej w tym samym locus
obserwowano metylację obu cytozyn. Dany locus klasyfikowano, jako
hipermetylowany, jeśli u formy RC stwierdzono metylację obu cytozyn
w sekwencji CCGG, a u formy uprawnej obie cytozyny pozostawały
niezmetylowane. U form RC gatunków B. rapa i B. napus stwierdzono większą
liczbę loci demetylowanych od liczby loci hipermetylowanych, podczas gdy
u formy RC gatunku B. oleracea liczba loci demetylowanych była prawie równa
liczbie loci hipermetylowanych (Tab. 9).
Tab. 9 Liczba loci demetylowanych i hipermetylowanych u form uprawnych
i RC gatunków Brassica.
Gatunek/forma Liczba loci Liczba loci Liczba loci
polimorficznych między demetylowanych hipermetylowanych
gatunkami uprawnymi a u form RC u form RC
formami RC
B. rapa uprawny/
51 11 6
B. rapa RC
B. oleracea uprawny/
60 7 8
B. oleracea RC
B. napus uprawny/
67 13 5
B. napus RC
Analizę porównawczą poziomu demetylacji i hipermetylacji sekwencji
CCGG przeprowadzono także dla gatunków diploidalnych i allotetraploidalnych
Wyniki 63
(Tab. 10). W tym przypadku analizowano loci polimorficzne między gatunkami
ancestralnymi B. rapa i B. oleracea a gatunkiem allotetraploidalnym. Za locus
demetylowany uważano locus występujący u B. napus, w którym nie
obserwowano metylacji żadnej z cytozyn, jeżeli jednocześnie locus ten u obu
gatunków ancestralnych posiadał zmetylowane obie cytozyny w sekwencji
CCGG. Za locus hipermetylowany u B. napus uważano taki, w którym
obserwowano metylację obu cytozyn, podczas gdy nie stwierdzono jej
u gatunków ancestralnych (Tab. 11 C, D). Liczba loci demetylowanych
u B. napus była znacznie wyższa od liczby loci hipermetylowanych, którą
stwierdzono jedynie dla jednego locus u obu analizowanych form (Tab. 10).
Tab. 10 Liczba loci demetylowanych i hipermetylowanych u gatunków
ancestralnych i gatunku allotetraploidalnego
Liczba loci polimorficznych Liczba loci Liczba loci
między gatunkami demetylowanych hipermetylowanych
ancestralnymi i gat. u gatunku u gatunku
allotetraploidalnym allotetraploidalnego allotetraploidalnego
B. rapa uprawny/
B. napus uprawny B. napus uprawny
B. oleracea uprawny
97 11 1
B. rapa RC/
B. napus RC B. napus RC
B. oleracea RC
118 9 1
W Tab. 11 przedstawiono szczegółową analizę porównawczą zmian we
wzorze metylacji sekwencji CCGG u gatunków allotetraploidalnych i gatunków
ancestralnych. Rozpatrywano przypadki, gdy wzór metylacji u gatunku
allotetraploidalnego był taki sam w danym locus, jak u jednego z gatunków
ancestralnych (Tab. 11A, B, E), bądz gatunek allotetraploidalny posiadał nowy
wzór metylacji, którego nie stwierdzono w danym locus u żadnego z gatunków
diploidalnych (Tab. 11C, D).
Jeżeli jeden z gatunków ancestralnych posiadał zmetylowaną, co najmniej
jedną, cytozynę w sekwencji CCGG, a u drugiego gatunku ancestralnego nie
obserwowano metylacji w sekwencji CCGG, to u B. napus formy uprawnej
sekwencja CCGG była metylowana na co najmniej jednej cytozynie. Taką
sytuację stwierdzono dla 27 loci (Tab. 11A). Podobna była także liczba loci
Wyniki 64
u B. napus formy uprawnej, gdy nie obserwowano u tego gatunku metylacji
żadnej z cytozyn (Tab. 11B). Natomiast, u formy RC B. napus stwierdzono
nieznaczną przewagę liczby loci, gdzie obie cytozyny pozostawały
niezmetylowane (Tab. 11A i B). Przypadki loci podlegających demetylacji bądz
hipermetylacji u obu form B. napus (Tab. 10, Tab. 11C i D) opisano przy okazji
omawiania wyników przedstawionych w Tab. 10. W Tab. 11, wiersz-E
przedstawiono sytuację, gdy oba gatunki ancestralne i gatunek allotetraploidalny
posiadały zmetylowaną, co najmniej jedną z cytozyn. Liczba loci u formy
uprawnej i RC B. napus była w tym przypadku podobna i wynosiła odpowiednio
27 i 29.
Podsumowując zamieszczone w Tab. 11 wyniki stwierdzono, iż u obu
analizowanych form B. napus nieznacznie przeważała liczba loci o takim wzorze
metylacji, jak u gatunku ancestralnego B. oleracea. Liczba loci o nowym wzorze
metylacji, który nie występował u żadnego z gatunków ancestralnych, była
podobna u obu badanych form i stanowiła mniejszość wśród analizowanych
przypadków (Tab. 12).
Tab. 11 Wzór metylacji sekwencji CCGG u gatunków ancestralnych
i allotetraploidalnych
Oznaczenie Wzór metylacji Wzór metylacji Liczba
literowe typu sekwencji CCGG u sekwencji CCGG zmodyfikowanych
modyfikacji gatunków ancestralnych u gatunku loci u gatunku
allotetraploidalnego allotetraploidalnego
m m
CmCGG + CCGG CmCGG
27 - uprawny
m m
A CCGG + CCGG CCGG
30 - RC
CmCGG + CCGG CmCGG
m
CmCGG + CCGG
31 - uprawny
m
B CCGG + CCGG CCGG
49 - RC
CmCGG + CCGG
1- uprawny
m
C CCGG + CCGG CmCGG
1 - RC
11 - uprawny
m
D CmCGG + mCmCGG CCGG
9 - RC
m
CmCGG
m
CmCGG + mCCGG 27 - uprawny
m
E CCGG
m
CmCGG + CmCGG 29 - RC
CmCGG
Wyniki 65
Tab. 12 Porównanie liczby loci u B. napus, o wzorze metylacji sekwencji
CCGG jak u B. rapa lub B. oleracea
Wzór metylacji u B.napus Wzór metylacji u B. napus Nowy wzór metylacji
jak u B. rapa/ jak u B. oleracea/ B. napus / liczba loci
liczba loci liczba loci
B. napus uprawny
37 39 21
B. napus RC
47 55 16
4.4. WZÓR METYLACJI DNA
Analizę wzoru metylacji DNA prowadzono z wykorzystaniem techniki
immunobarwienia z przeciwciałami monoklonalnymi, skierowanymi przeciwko
metylowanej cytozynie w łańcuchu DNA (5 mC). Wzór metylacji badano
w chromosomach metafazowych oraz w jądrach interfazowych form uprawnych
i RC gatunków Brassica, natomiast chromosomy pachytenowe analizowano tylko
u form RC. Związane to było z możliwością szybkiego otrzymania kolejnych
zakwitających roślin oraz zebrania wystarczającej do analizy liczby pączków
szczytowych. Dla każdego gatunku analizowano średnio po 10 15 płytek
metafazowych oraz 30 jąder interfazowych z różnych miejsc na preparacie.
W przypadku analizy preparatów mejotycznych zliczano średnio około 50
komórek w stadium pachytenu.
4.4.1. Wzór metylacji DNA w chromosomach metafazowych
Badane gatunki Brassica charakteryzują się małymi i słabo
zróżnicowanymi chromosomami, dlatego też nie obserwowano w chromosomach
tych gatunków wzoru metylacji w postaci prążków, charakterystycznego dla
gatunków o większych chromosomach, np.: Vicia faba. Większość chromosomów
metafazowych charakteryzowała się rozmieszczeniem sygnałów immunodetekcji
zmetylowanego DNA (5 mC) prawie w całych chromosomach. Jednakże,
zaobserwowano pewne różnice w dystrybucji sygnałów dla 5 mC
w poszczególnych chromosomach danego gatunku. B. rapa zaobserwowano
intensywne sygnały metylacji w niektórych chromosomach metafazowych,
Wyniki 66
podczas gdy pozostałe chromosomy bądz nie posiadały sygnałów wcale, bądz
wykryto je tylko w części chromosomu (Ryc. 16A, 16B). Najczęściej
obserwowano od 8 do 10 chromosomów gdzie metylację DNA wykryto w całym,
lub prawie całym chromosomie. Takiej sytuacji nie stwierdzono dla form RC
i uprawnej gatunku B. oleracea. Wszystkie chromosomy B. oleracea posiadały
sygnały dla 5 mC i były one rozmieszczone przeważnie w okolicy centromerów,
bądz prawie równomiernie na całej powierzchni chromosomów (Ryc. 16C, 16D).
U gatunku allotetraploidalnego zaobserwowano różnice w dystrybucji sygnałów
w chromosomach pomiędzy formami RC i uprawnymi. U formy uprawnej
B. napus sygnały dla 5 mC wykryto we wszystkich chromosomach
i charakteryzowały się one bardziej równomiernym rozmieszczeniem (Ryc. 16E),
podczas gdy u formy RC część chromosomów była mocniej zmetylowana (Ryc.
16F). Chromosomów takich obserwowano od 18 do 23, w zależności od
analizowanej płytki metafazowej. Wśród tych chromosomów wyróżniało się
zazwyczaj 8 charakteryzujących się znacznie silniejszymi sygnałami dla 5 mC,
sygnały te prawie równomiernie pokrywały całe chromosomy (Ryc. 16F strzałki).
Należy zaznaczyć, iż przedstawione wyniki immunobarwień były uzyskane przy
zastosowaniu takich samych dla wszystkich gatunków rozcieńczeń przeciwciał
pierwszo- i drugorzędowych, a reakcje immunobarwień prowadzono w tych
samych warunkach.
4.4.2. Wzór metylacji DNA w jądrach interfazowych
Wzór metylacji w jądrach interfazowych form uprawnych i RC nie różnił
się, stąd też otrzymane wyniki zobrazowano zdjęciami jedynie dla form
uprawnych gatunków Brassica. U B. rapa w jądrach interfazowych stwierdzono
silne sygnały dla 5 mC, zlokalizowane w barwiących się intensywnie DAPI
chromocentrach. Liczba tych sygnałów wynosiła od 16 do 20, przy czym od 8 do
10 sygnałów w chromocentrach było znacznie większych i o intensywniejszej
fluorescencji od pozostałych (Ryc. 17A). U B. oleracea sygnały dla 5 mC
wykryto w całym jądrze interfazowym, w niektórych jądrach można było
zaobserwować intensywniejszą fluorescencję w chromocentrach, jednak różnica
w intensywności fluorescencji pomiędzy chromocentrami, a pozostałą częścią
jądra interfazowego nie była tak wyrazna jak u B. rapa (Ryc. 17B). Natomiast
Wyniki 67
u gatunku allotetraploidalnego stwierdzono występowanie sygnałów metylacji
DNA zarówno w heterochromatynowych chromocentrach, jak i poza nimi (Ryc.
17C). Część jąder interfazowych B. napus charakteryzowała się wzorem metylacji
DNA podobnym do tego obserwowanego u B. rapa, z wyraznie zmetylowanymi
chromocentrami, jednak sygnały metylacji u B. napus zlokalizowane były też
poza chromocentrami, czego nie obserwowano u B. rapa.
4.4.3. Wzór metylacji DNA w chromosomach pachytenowych
Ze względu na wysoką kondensację chromatyny w chromosomach
metafazowych, a jednocześnie dużą liczbę sygnałów anty-5 mC w obrębie
chromosomu, zdecydowano się wykorzystać do immunobarwienia także
chromosomy pachytenowe, które dają możliwość dokładnej lokalizacji sygnałów
wzdłuż chromosomów. Chromosomy pachytenowe charakteryzowały się
niejednolitym wzorem metylacji. Wzdłuż chromosomów obserwowano
powtarzający się wzór z naprzemiennie występującą mocniejszą fluorescencją
i jej brakiem. Wzór ten tworzył strukturę na kształt sznurka z koralikami
miejscami o intensywnej fluorescencji (Ryc. 18A kwadrat). Dodatkowo
u wszystkich trzech gatunków w stadium pachytenu zaobserwowano
charakterystyczne miejsca o intensywniejszej fluorescencji, które były
zgrupowane w kilka wyraznych punktów (Ryc. 18A -C strzałki). Miejsca te
kolokalizowały z intensywną fluorescencją DAPI. W celu sprawdzenia, jakie
sekwencje powtarzalne lokalizują w mocno metylowanych miejscach
chromosomów pachytenowych, wykonano fluorescencyjną hybrydyzację in situ
z sondami 25S i 5S rDNA. Na rycinie 19 przedstawiono wyniki uzyskane dla
gatunku B. rapa (Ryc. 19A) i B. oleracea (Ryc. 19B). Po przeanalizowaniu około
50 komórek w stadium pachytenu stwierdzono, iż sygnały intensywnej
fluorescencji przeciwciała anty-5 mC pokrywają się z lokalizacją sygnałów dla
badanych sond rDNA. Sygnały dla sondy 25S rDNA w większości
kolokalizowały z sekwencjami 5S rDNA (Ryc. 19A, B) w miejscu intensywnej
fluorescencji DAPI. W niektórych komórkach sygnały 5S rDNA wykryto także
poza miejscami jej kolokalizacji z sondą 25S rDNA (Ryc. 19C strzałka).
Wyniki 68
4.5. WZÓR METYLACJI HISTONU H3
Analizę wzóru metylacji histonu H3 przeprowadzono dla lizyny w pozycji
czwartej i dziewiątej histonu H3 w jądrach interfazowych gatunków Brassica.
Wzór metylacji H3 nie różnił się w jądrach interfazowych form RC i uprawnych,
dlatego do dlaszych badań wykorzystywano jedynie formę uprawną gatunków
Brassica. Analizę prowadzono na około 30 jądrach interfazowych dla każdego
gatunku. Obserwacje przeprowadzono z wykorzystaniem mikroskopu
konfokalnego, gdzie preparaty analizowano w osi X, Y i Z. Na rycinach
zamieszczono serię przekrojów w osi Z przez jądra interfazowe.
4.5.1. Dimetylacja H3K4
Dimetylację lizyny w pozycji czwartej histonu H3 u Brassica rapa
wykryto w rejonach euchromatynowych jąder interfazowych. Silnie barwiące się
DAPI heterochromatynowe chromocentra nie posiadały sygnałów anty-
H3K4me2, co było widoczne na wszystkich przekrojach optycznych przez jądra
interfazowe (Ryc. 20A-N). U B. oleracea w większości analizowanych jąder
interfazowych nie wykryto sygnałów anty-H3K4me2 w chromocentrach (Ryc.
21A-L), a obserwowano je głównie w euchromatynie. U B. napus metylacja
lizyny w pozycji czwartej była związana z euchromatyną, w chromocentrach nie
obserwowano sygnałów anty-H3K4me2 (Ryc. 22A-N). Taki wzór metylacji był
charakterystyczny dla wszystkich analizowanych jąder interfazowych
i obserwowany we wszystkich przekrojach przez jądra u tego gatunku. Nie
stwierdzono dimetylacji H3K4 w obszarze jąderek, zarówno u gatunków
diploidalnych, jak i u allotetraploida. Na rycinie 23 przedstawiono porównawczo
wzór dimetylacji H3K4 u trzech analizowanych gatunków. Do ilustracji wybrano
po jednym przekroju optycznym z każdego gatunku.
Analiza rozmieszczenia sygnałów anty-H3K4me2 w chromosomach
w stadium metafazy u B. napus (Ryc. 24A) i anafazy u B. oleracea (Ryc. 24B)
wykazała, iż obszary przycentromerowe charakteryzują się brakiem sygnałów,
natomiast występują one w częściach dystalnych ramion.
Wyniki 69
4.5.2. Dimetylacja H3K9
U B. rapa we wszystkich analizowanych jądrach interfazowych
intensywne sygnały anty-H3K9me2 kolokalizowały z chromocentrami (Ryc.
25A-L). Natomiast u B. oleracea większość chromocentrów nie posiadała
sygnałów anty-H3K9me2, co obserwowano na przekrojach optycznych (Ryc.
26A-L). Przekroje z części powierzchniowej jąder interfazowych
charakteryzowały się brakiem metylacji w obszarze chromocentrów (Ryc. 26A, B,
K, L), podczas gdy w przekrojach z części środkowej jąder, niektóre
chromocentra posiadały sygnały (Ryc. 26H, I). Fluorescencję, u tego gatunku,
zlokalizowano przede wszystkim w całym obszarze jądra interfazowego,
z wyjątkiem jąderka. U gatunku allotetraploidalnego jądra interfazowe
charakteryzowały się rozmieszczeniem sygnałów zarówno w chromocentrach, jak
i poza nimi w euchromatynie (Ryc. 27A-N). U B. napus nie obserwowano
sygnałów w jąderku. Dla lepszego porównania wzoru H3K9me2, na rycinie 28
przedstawiono centralne przekroje optyczne przez jądra interfazowe trzech
gatunków.
4.5.3. Trimetylacja H3K9
Trimetylację lizyny w pozycji 9. zlokalizowano głównie w obszarze
jąderka u B. rapa i B. oleracea (Ryc. 29A-M i 30A-L), lub w jąderku
i euchromatynie jądra interfazowego u B. napus (Ryc. 31A-J). U wszystkich
trzech gatunków nie obserwowano sygnałów anty-H3K9me3 w chromocentrach.
Na serii przekrojów B. rapa i B. oleracea wyraznie zaznaczają się sygnały
skupione w jąderku, widoczne jest to na wszystkich przekrojach przez jądra,
w których uwidocznione jest jąderko. U B. napus obserwowano sygnały, które
były skupione wokół jąderka, tworząc charakterystyczny pierścień. U tego
gatunku fluorescencję, o podobnej intensywności jak w jąderku, zlokalizowano
również w euchromatynie jądra interfazowego, co było widoczne na
poszczególnych przekrojach optycznych.
Wyniki 70
4.6. WZÓR ACETYLACJI HISTONÓW H4 I H3
Wzór acetylacji histonu H4 badano w lizynie w pozycji 5. i 16., natomiast
histonu H3 w lizynie w pozycji 18. Analizę prowadzono na około 30 jądrach
interfazowych dla każdego gatunku. Materiału do przygotowania preparatów nie
traktowano w roztworze 8-hydroksychinoliny, tylko bezpośrednio utrwalano
w formaldehydzie. Te same preparaty wykorzystywano następnie do analizy
w cytometrze obrazowym, gdzie badano wzór acetylacji w zależności od faz
cyklu komórkowego. Analizę wzoru acetylacji prowadzono z wykorzystaniem
mikroskopu konfokalnego. Na rycinach zamieszczono serię przekrojów
optycznych przez jądra interfazowe.
4.6.1. Acetylacja H4K5
U wszystkich trzech gatunków Brassica obserwowano zróżnicowany wzór
acetylacji H4K5 w poszczególnych jądrach interfazowych danego gatunku.
W większości jąder interfazowych B. rapa intensywne sygnały anty-H4K5
zlokalizowano w chromocentrach (Ryc. 32a A-K), podczas gdy w pozostałych
jądrach sygnały obserwowano w euchromatynie, a większość chromocentrów nie
była acetylowana (Ryc. 32b A-L). Oba analizowane przypadki znajdowały
potwierdzenie we wszystkich przekrojach w osi Z. U drugiego gatunku
diploidalnego w części jąder obserwowano intensywną acetylację H4K5
w chromocentrach (Ryc. 33a A-N), natomiast w pozostałych sygnały
zlokalizowane były w całym obszarze jądra interfazowego z wyjątkiem
chromocentrów i jąderka (Ryc. 33b A-N). U B. napus większość jąder
interfazowych posiadała intensywne sygnały anty-H4K5 w chromocentrach (Ryc.
34a A-N), natomiast pozostała część jąder, w euchromatynie (Ryc. 34b A-N).
Brak sygnałów w chromocentrach obserwowano szczególnie wyraznie na
pierwszych przekrojach od powierzchni jądra (34b A-C).
Wyniki 71
4.6.2. Acetylacja H4K16
Wzór acetylacji lizyny w pozycji 16. nie był tak zróżnicowany
w poszczególnych jądrach interfazowych danego gatunku, jak to miało miejsce
dla acetylacji H4K5. U B. rapa sygnały anty-H4K16 były zlokalizowane
w obszarze euchromatyny, przy czym większość analizowanych jąder
charakteryzowała się częściową antykolokalizacją tych sygnałów
z chromocentrami (Ryc. 35A-H). Na niektórych przekrojach przez jądra
interfazowe u B. oleracea stwierdzono antykolokalizację sygnałów
z chromocentrami, jednak w większości przekrojów sygnały były rozproszone
w euchromatynie oraz w chromocentrach (Ryc. 36A-I). W części jąder
interfazowych u tego gatunku stwierdzono wyrazne sygnały w obszarze jąderka
(Ryc. 36C, D, E, F). B. napus cechował się najmniej zróżnicowanym wzorem
acetylacji, sygnały rozmieszczone były w euchromatynie oraz w chromocentrach
(Ryc. 37A-L), mniejszość stanowiły jądra interfazowe, gdzie obserwowano
antykolokalizację z chromocentrami.
4.6.3. Acetylacja H3K18
Wzór acetylacji lizyny w pozycji 18 histonu H3 u badanych gatunków
Brassica przedstawiał się podobnie jak wzór acetylacji H4K16. Większość jąder
interfazowych B. rapa charakteryzowała się brakiem acetylacji H3K18
w chromocentrach, a sygnały zlokalizowane były w euchromatynie (Ryc. 38A-N).
Natomiast u B. oleracea sygnały anty-H3K18 były rozmieszczone równomiernie
w całym jądrze (z wyj. jąderka) również w chromocentrach, lub w całym jądrze
z wyjątkiem jąderka i części chromocentrów (Ryc. 39A-L). Podobny wzór
acetylacji H3K18 obserwowano dla B. napus (Ryc. 40A-L).
Wyniki 72
4.7. ANALIZA WZORU ACETYLACJI HISTONÓW H4 I H3
W CYTOMETRII OBRAZOWEJ
Badania wzoru acetylacji w cytometrii obrazowej przeprowadzono
u B. rapa. Wybrany gatunek charakteryzował się lokalizacją heterochromatyny
konstytutywnej w intensywnie barwiących się DAPI chromocentrach.
Immunobarwienia z zastosowaniem przeciwciał anty H4K5ac, H4K16ac
i H3K18ac wykazały, że u badanych gatunków można zaobserwować trzy główne
wzory acetylacji w jądrach interfazowych. Cześć jąder charakteryzowała się
intensywnymi sygnałami w chromocentrach, w części obserwowano
antykolokalizację sygnałów z chromocentrami, lub tylko częściową kolokalizację
z chromocentrami. Postanowiono sprawdzić, czy dany wzór acetylacji jest
skorelowany z cyklem komórkowym oraz czy heterochromatyna konstytutywna
charakteryzuje się wysoką acetylacją histonów H3 i H4 w poszczególnych fazach
interfazy. W tym celu zsegmentowane jądra interfazowe podzielono, na podstawie
uzyskanego histogramu względnej intensywności fluorescencji DAPI, na trzy
frakcje: G1, S i G2, a następnie badano kolokalizację intensywności fluorescencji
przeciwciała anty-H4K5 (Alexa488) z intensywnością fluorescencji DAPI
w heterochromatynie konstytutywnej co wyliczano stosując współczynnik
kolokalizacji Pearsona (P). Uzyskane wyniki przedstawiono za pomocą
histogramów i wykresów.
4.7.1. Acetylacja H4K5
Badania wzoru acetylacji H4K5 przeprowadzono na 760 jądrach
interfazowych. Skonstruowano histogram przedstawiający całkowitą
intensywność fluorescencji DAPI, która jest skorelowana z zawartością DNA
w poszczególnych fazach (Ryc. 41). Na podstawie uzyskanego histogramu
dokonano podziału na jądra interfazowe reprezentujące fazę G0/G1, S i G2/M.
Następnie wyliczono współczynnik kolokalizacji Pearsona (P) w poszczególnych
fazach. Jądra interfazowe podzielono na dwie frakcje, reprezentujące niski
(P<0,65) i wysoki (P>=0,65) współczynnik kolokalizacji Pearsona.
Wyniki 73
U B. rapa 45,2% jąder interfazowych znajdowało się w fazie G1, 24,1%
w S i 30,7% w fazie G2. Spośród jąder w fazie G1 86,9% charakteryzowało się
wysokim współczynnikiem kolokalizacji Pearsona (P>=0,65), natomiast w fazie S
i G2 aż 99% jąder interfazowych (Ryc. 42). Jedynie nieco ponad 0,5% wszystkich
analizowanych jąder interfazowych posiadało ujemny współczynnik kolokalizacji
i prawie wszystkie te jądra znajdowały się w fazie G1.
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0.0 1.4 2.8 4.2 5.7 7.1 8.5 9.9 11.4
Całkowita intensywność DAPI (x106)
Ryc. 41 Częstotliwość jąder o danej intensywności fluorescencji DAPI
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0 200 400 600 800
-0.2
-0.4
G1
-0.6
S
G2
-0.8
Liczba jąder
Ryc. 42 Liczba jąder interfazowych charakteryzujących się niskim (P<0,65)
lub wysokim (P>=0,65) współczynnikiem kolokalizacji Pearsona
Liczba jąder
Współczynnik kolokalizacji Pearsona (P)
Wyniki 74
4.7.2. Acetylacja H4K16
Analizę wzoru acetylacji H4K16 przeprowadzono dla 1295 jąder
interfazowych B. rapa. Spośród tych jąder 66,1% było w fazie G1, 15,4% w fazie
S i 18,5% w fazie G2 (Ryc. 43). Wysoki współczynnik kolokalizacji był
charakterystyczny dla: 32,9%, 47,5% i 48,1%, jąder interfazowych, odpowiednio
w fazach G1, S i G2, natomiast niski dla: 67,1%, 52,5% i 51,9% jąder
interfazowych w odpowiednich fazach. Ujemny współczynnik kolokalizacji
posiadało 0,6% analizowanych jąder interfazowych (Ryc. 44).
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0.0 2.5 5.1 7.6 10.2 12.7
Całkowita intensywność DAPI (x106)
Ryc. 43 Częstotliwość jąder o danej intensywności fluorescencji DAPI
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
-0.2
-0.4
G1
-0.6
S
G2
-0.8
Liczba jąder
Ryc. 44 Liczba jąder interfazowych charakteryzujących się niskim (P<0,65)
lub wysokim (P>=0,65) współczynnikiem kolokalizacji Pearsona
Liczba jąder
Współczynnik kolokalizacji Pearsona (P)
Wyniki 75
4.7.3. Acetylacja H3K18
Badania wzoru acetylacji H3K18 przeprowadzono dla 3359 jąder
interfazowych B. rapa. W fazie G1, S i G2 znajdowało się odpowiednio: 52,3%,
14,9% i 32,8% jąder interfazowych (Ryc. 45). Wysokim współczynnikiem
kolokalizacji charakteryzowało się: 19,9% jąder w fazie G1, 22,8% w S i 14,8%
w G2. Znacznie więcej jąder interfazowych posiadało niski współczynnik
Pearsona i było to: 80,1% jąder w fazie G1, 77,2% w S i 85,2% w G2. Ujemny
współczynnik kolokalizacji charakteryzowało 10% wszystkich jąder
interfazowych (Ryc. 46).
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
0.0 2.3 4.6 6.9 9.2 11.5 13.8
Całkowita intensywność DAPI (x106)
Ryc. 45 Częstotliwość jąder o danej intensywności fluorescencji DAPI
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
-0.2
-0.4
G1
-0.6
S
G2
-0.8
Liczba jąder
Ryc. 46 Liczba jąder interfazowych charakteryzujących się niskim (P<0,65)
lub wysokim (P>=0,65) współczynnikiem kolokalizacji Pearsona
Liczba jąder
Współczynnik kolokalizacji Pearsona (P)
Wyniki 76
Przedstwione wyniki dotyczące acetylacji histonów H3 i H4, wskazują na
różnice w acetylacji chromatyny jąder interfazowych, w zależności od
zastosowanego przeciwciała. W przypadku acetylacji H4K5 zdecydowana
większość jąder interfazowych charakteryzowała się wysoką acetylacją
w heterochromatynie konstytutywnej, podczas gdy acetylacja H4K16 była
obserwowana z podobną częstotliwością zarówno w chromocentrach, jak
i w euchromatynie. Zupełnie odwrotne wyniki uzyskano dla trzeciej analizowanej
modyfikacji H3K18ac, gdzie w większości jąder sygnały wykryto tylko
w niewielkim stopniu w heterochromatynie konstytutywnej. Nie zaobserwowano
natomist większych różnic w acetylacji heterochromatyny w poszczególnych
fazach cyklu komórkowego. Sygnały fluorescencji przeciwciał przeciwko
acetylowanym histonom, były wykrywane w heterochromatynie z podobną
częstotliwością w fazie G1, S, czy G2 cyklu komórkowego.
4.8. PODSUMOWANIE
W celu podsumowania wyników dotyczących modyfikacji
epigenetycznych u gatunków Brassica, opisane powyżej dane przedstawiono
w tabeli 13.
Tab.13 Modyfikacje epigenetyczne w chromatynie jąder interfazowych
gatunków Brassica
Metylacja Acetylacja
Gatunek
5 mC H3K4me2 H3K9me2 H3K9me3 H4K5 H4K16 H3K18
B. rapa H E H J H+/E H/E E
B. oleracea H/E E H/E J H/E H/E/J H/E
B. napus H/E E H/E J/E H/E H/E H/E
*
H heterochromatyna konstytutywna/chromocentra, H+ - głównie w heterochromatynie, E
euchromatyna, J - jąderko
Analiza zamieszczonych wyników wskazuje na różnice w strukturze jąder
interfazowych oraz we wzorze modyfikacji chromatyny między gatunkami
diploidalnymi: B. rapa i B. oleracea. Gatunek allotetraploidalny cechuje się
Wyniki 77
wzorem tych modyfikacji podobnym do B. oleracea. U wszystkich badanych
gatunków dimetylacja H3K4 jest charakterystyczna dla euchromatyny,
a trimetylacja H3K9 dla obszarów jąderka, podczas gdy pozostałe badane
modyfikacje z różną intensywnością, występują zarówno w euchromatynie, jak
i heterochromatynie jąder interfazowych.
Rycina 3
Rycina 3
Typy jąder interfazowych obserwowanych u gatunków Brassica
�� A, B - B. rapa, forma uprawna, fluorescencja niebieska DAPI
�� C, D - B. oleracea, forma uprawna, fluorescencja niebieska DAPI
�� E - B. napus, forma uprawna, fluorescencja niebieska DAPI
Skala - 5�m
B
A
C D
E
Rycina 4
Rycina 4
Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ z sondami 25S i 5S rDNA w chromosomach
metafazowych gatunków Brassica (forma uprawna)
�� A, B - B. rapa, forma uprawna, fluorescencja zielona 25S rDNA,
czerwona 5S rDNA, niebieska DAPI
�� C, D - B. oleracea, forma uprawna, fluorescencja zielona 25S
rDNA, czerwona 5S rDNA, niebieska DAPI
�� E, F - B. napus, forma uprawna, fluorescencja zielona 25S rDNA,
czerwona 5S rDNA, niebieska DAPI
Skala - 5�m
A
B
C
D
E
F
Rycina 5
Rycina 5
Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ z sondami 25S i 5S rDNA w chromosomach
metafazowych gatunków Brassica (forma RC)
�� A, B - B. rapa, forma RC, fluorescencja zielona 25S rDNA,
czerwona 5S rDNA, niebieska DAPI
�� C, D - B. oleracea, forma RC, fluorescencja zielona 25S rDNA,
czerwona 5S rDNA, niebieska DAPI
�� E, F - B. napus, forma RC, fluorescencja zielona 25S rDNA,
czerwona 5S rDNA, niebieska DAPI
Skala - 5�m
A
B
C
D
E
F
Rycina 6
Rycina 6
Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ z sondą CentBr1 w chromosomach
metafazowych gatunków Brassica
�� A - B. rapa, forma uprawna, fluorescencja zielona CentBr1,
niebieska DAPI
�� B - B. oleracea, forma uprawna, fluorescencja zielona CentBr1,
niebieska DAPI
�� C - B. napus, forma uprawna, fluorescencja zielona CentBr1,
niebieska DAPI
Skala - 5�m
A
B
C
Rycina 7
Rycina 7
Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ z sondą CentBr1 w jądrach interfazowych
gatunków Brassica
�� A, A - B. rapa, forma uprawna, fluorescencja zielona CentBr1,
niebieska DAPI
�� B, B - B. oleracea, forma uprawna, fluorescencja zielona
CentBr1, niebieska DAPI
�� C, C - B. napus, forma uprawna, fluorescencja zielona CentBr1,
niebieska DAPI
Skala - 5�m
A
A
B
B
C
C
Rycina 8
Rycina 8
Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ z sondą CentBr2 w chromosomach
metafazowych gatunków Brassica
�� A - B. rapa, forma uprawna, fluorescencja zielona CentBr2,
niebieska DAPI
�� B - B. oleracea, forma uprawna, fluorescencja czerwona
CentBr2, niebieska DAPI
�� C - B. napus, forma uprawna, fluorescencja czerwona CentBr2,
niebieska DAPI
Skala - 5�m
A
B
C
Rycina 9
Rycina 9
Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ z sondą CentBr2 w jądrach interfazowych
gatunków Brassica
�� A, A - B. rapa, forma uprawna, fluorescencja zielona CentBr2,
niebieska DAPI
�� B, B - B. oleracea, forma uprawna, fluorescencja czerwona
CentBr2, niebieska DAPI
�� C, C - B. napus, forma uprawna, fluorescencja czerwona
CentBr2, niebieska DAPI
Skala - 5�m
A A
B
B
C C
Rycina 10
Rycina 10
Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ z sondami CentBr1 i CentBr2
w chromosomach metafazowych gatunków Brassica
�� A - B. rapa, forma uprawna, fluorescencja zielona CentBr1,
niebieska DAPI
�� B - B. rapa, forma uprawna, fluorescencja czerwona CentBr2,
niebieska DAPI
�� C - B. oleracea, forma uprawna, fluorescencja zielona CentBr2,
niebieska DAPI
�� D - B. oleracea, forma uprawna, fluorescencja czerwona
CentBr1, niebieska DAPI
Skala - 5�m
A B
C
D
Rycina 11
Rycina 11
Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ z sondami CentBr1 i CentBr2
w chromosomach metafazowych gatunków Brassica
�� A - B. napus, forma uprawna, fluorescencja zielona CentBr2,
niebieska DAPI
�� B - B. napus, forma uprawna, fluorescencja czerwona - CentBr1,
niebieska DAPI
Skala - 5�m
A
B
Rycina 12
Rycina 12
Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ z sondami CentBr1 i CentBr2 w jądrach
interfazowych gatunków Brassica
�� A - B. rapa, forma uprawna, fluorescencja zielona CentBr2,
niebieska DAPI
�� B - B. rapa, forma uprawna, fluorescencja czerwona - CentBr1,
niebieska DAPI
�� C - B. oleracea, forma uprawna, fluorescencja zielona CentBr2,
niebieska DAPI
�� D - B. oleracea, forma uprawna, fluorescencja czerwona - CentBr1,
niebieska DAPI
�� E - B. napus, forma uprawna, fluorescencja zielona CentBr2,
niebieska DAPI
�� F - B. napus, forma uprawna, fluorescencja czerwona - CentBr1,
niebieska DAPI
Skala - 5�m
A B
C
D
E F
Rycina 16
Rycina 16
Wzór metylacji DNA w chromosomach metafazowych gatunków Brassica
�� A B. rapa, forma uprawna, fluorescencja zielona 5 mC
�� B - B. rapa, forma RC, fluorescencja zielona 5 mC
�� C - B. oleracea, forma uprawna, fluorescencja zielona 5 mC
�� D - B. oleracea, forma RC, fluorescencja zielona 5 mC
�� E - B. napus, forma uprawna, fluorescencja zielona 5 mC
�� F - B. napus, forma RC, fluorescencja zielona 5 mC
Skala - 5�m
A B
C D
E F
Rycina 17
Rycina 17
Wzór metylacji DNA w jądrach interfazowych gatunków Brassica
�� A, A - B. rapa, forma uprawna, fluorescencja zielona 5 mC
�� B, B - B. oleracea, forma uprawna, fluorescencja zielona 5 mC
�� C, C - B. napus, forma uprawna, fluorescencja zielona 5 mC
Skala - 5�m
A
A
B
B
C C
Rycina 18
Rycina 18
Wzór metylacji DNA w chromosomach pachytenowych gatunków Brassica
�� A, A - B. rapa, forma RC, fluorescencja zielona 5 mC, szara -
DAPI
�� B, B - B. oleracea, forma RC, fluorescencja zielona 5 mC, szara
- DAPI
�� C, C - B. napus, forma RC, fluorescencja zielona 5 mC,
niebieska - DAPI
Skala - 5�m
A A
B
B
C
C
Rycina 19
Rycina 19
Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ z sondami 25S i 5S rDNA w chromosomach
pachytenowych gatunków Brassica
�� A, A B. rapa, forma RC, fluorescencja zielona 25S rDNA,
czerwona 5S rDNA, szara - DAPI
�� B, B - B. oleracea, forma RC, fluorescencja zielona 25S rDNA,
czerwona 5S rDNA, szara DAPI
�� C - B. rapa, forma RC, fluorescencja zielona 5S rDNA, szara
DAPI
Skala - 5�m
A A
B B
C
Rycina 20
Rycina 20
Przekroje optyczne przez jądra interfazowe B. rapa, immunobarwienie
z przeciwciałami anty H3K4me2
�� A - N - B. rapa, forma uprawna, fluorescencja zielona H3K4me2,
niebieska DAPI
Skala - 5�m
A B C
D E F
G H I
J K L
A M N
Rycina 21
Rycina 21
Przekroje optyczne przez jądra interfazowe B. oleracea, immunobarwienie
z przeciwciałami anty H3K4me2
�� A - L - B. oleracea, forma uprawna, fluorescencja zielona
H3K4me2, niebieska DAPI
Skala - 5�m
A C
B
F
D
E
G I
H
J L
K
Rycina 22
Rycina 22
Przekroje optyczne przez jądra interfazowe B. napus, immunobarwienie
z przeciwciałami anty H3K4me2
�� A - N - B. napus, forma uprawna, fluorescencja zielona
H3K4me2, niebieska DAPI
Skala - 5�m
B
A C
D E F
G H I
J K L
A M N
Rycina 23
Rycina 23
Porównanie wzoru immunobarwienia z przeciwciałami anty H3K4me2
w jądrach interfazowyh B. rapa, B. oleracea, B. napus
�� A - B. rapa, forma uprawna, fluorescencja zielona H3K4me2,
niebieska DAPI
�� B B. oleracea forma uprawna, fluorescencja zielona H3K4me2,
niebieska DAPI
�� C B. napus forma uprawna, fluorescencja zielona H3K4me2,
niebieska DAPI
Skala - 5�m
A
B
C
Rycina 24
Rycina 24
Wzór immunobarwienia z przeciwciałami anty H3K4me2 w chromosomach
B. rapa
�� A - B. rapa, forma uprawna, chromosomy metafazowe,
fluorescencja zielona H3H4me2, niebieska DAPI
�� B - B. rapa, forma uprawna, chromosomy anafazowe, fluorescencja
czerwona H3K4me2, niebieska DAPI
Skala - 5�m
A
B
Rycina 25
Rycina 25
Przekroje optyczne przez jądra interfazowe B. rapa, immunobarwienie
z przeciwciałami anty H3K9me2
�� A - L - B. rapa, forma uprawna, fluorescencja czerwona
H3K9me2, niebieska DAPI
Skala - 5�m
A
B
C D
E F
G H
I J
K L
Rycina 26
Rycina 26
Przekroje optyczne przez jądra interfazowe B. oleracea, immunobarwienie
z przeciwciałami anty H3K9me2
�� A - L - B. oleracea, forma uprawna, fluorescencja zielona
H3K9me2, niebieska DAPI
Skala - 5�m
A B
C D
F
E
G H
J
I
K L
Rycina 27
Rycina 27
Przekroje optyczne przez jądra interfazowe B. napus, immunobarwienie
z przeciwciałami anty H3K9me2
�� A - N - B. napus, forma uprawna, fluorescencja zielona
H3K9me2, niebieska DAPI
Skala - 5�m
A
B
C
D E F
G H I
J K L
A M N
Rycina 28
Rycina 28
Porównanie wzoru immunobarwienia z przeciwciałami anty H3K9me2 w
jądrach interfazowyh B. rapa, B. oleracea, B. napus
�� A, A - B. rapa, forma uprawna, fluorescencja zielona H3K9me2,
niebieska DAPI
�� B B. oleracea forma uprawna, fluorescencja zielona H3K9me2,
niebieska DAPI
�� C B. napus forma uprawna, fluorescencja zielona H3K9me2,
niebieska DAPI
Skala - 5�m
A A
B
C
Rycina 29
Rycina 29
Przekroje optyczne przez jądra interfazowe B. rapa, immunobarwienie
z przeciwciałami anty H3K9me3
�� A - M - B. rapa, forma uprawna, fluorescencja zielona
H3K9me3, niebieska DAPI
Skala - 5�m
C
A B
E F
D
G H I
J K L
A M
Rycina 30
Rycina 30
Przekroje optyczne przez jądra interfazowe B. oleracea, immunobarwienie
z przeciwciałami anty H3K9me3
�� A - L - B. oleracea, forma uprawna, fluorescencja zielona
H3K9me3, niebieska DAPI
Skala - 5�m
A B
C D
E F
G H
I J
K L
Rycina 31
Rycina 31
Przekroje optyczne przez jądra interfazowe B. napus, immunobarwienie
z przeciwciałami anty H3K9me3
�� A - J - B. napus, forma uprawna, fluorescencja zielona
H3K9me3, niebieska DAPI
Skala - 5�m
A B
C D
E F
G H
I J
Rycina 32a
Rycina 32a
Przekroje optyczne przez jądra interfazowe B. rapa, immunobarwienie
z przeciwciałami anty H4K5ac
�� A - K - B. rapa, forma uprawna, fluorescencja zielona H4K5ac,
niebieska DAPI
Skala - 5�m
A B C
D E F
G
H I
J K
Rycina 32b
Rycina 32b
Przekroje optyczne przez jądra interfazowe B. rapa, immunobarwienie
z przeciwciałami anty H4K5ac
�� A - L - B. rapa, forma uprawna, fluorescencja zielona H4K5ac,
niebieska DAPI
Skala - 5�m
B C
A
D E
F
H
G I
L
K
J
Rycina 33a
Rycina 33a
Przekroje optyczne przez jądra interfazowe B. oleracea, immunobarwienie
z przeciwciałami anty H4K5ac
�� A - N - B. oleracea, forma uprawna, fluorescencja zielona
H4K5ac, niebieska DAPI
Skala - 5�m
A
B
C
F
D E
G H I
J K
L
A M N
Rycina 33b
Rycina 33b
Przekroje optyczne przez jądra interfazowe B. oleracea, immunobarwienie
z przeciwciałami anty H4K5ac
�� A - N - B. oleracea, forma uprawna, fluorescencja zielona
H4K5ac, niebieska DAPI
Skala - 5�m
A B C
D E F
G H I
J K L
A M N
Rycina 34a
Rycina 34a
Przekroje optyczne przez jądra interfazowe B. napus, immunobarwienie
z przeciwciałami anty H4K5ac
�� A - N - B. napus, forma uprawna, fluorescencja zielona H4K5ac,
niebieska DAPI
Skala - 5�m
A B
C
D E F
I
G H
J K L
A
M N
Rycina 34b
Rycina 34b
Przekroje optyczne przez jądra interfazowe B. napus, immunobarwienie
z przeciwciałami anty H4K5ac
�� A - N - B. napus, forma uprawna, fluorescencja zielona H4K5ac,
niebieska DAPI
Skala - 5�m
C
A B
D E F
G H I
J K L
M
A N
Rycina 35
Rycina 35
Przekroje optyczne przez jądra interfazowe B. rapa, immunobarwienie
z przeciwciałami anty H4K16ac
�� A - H - B. rapa, forma uprawna, fluorescencja zielona H4K16ac,
niebieska DAPI
Skala - 5�m
B
A
C D
E F
G H
Rycina 36
Rycina 36
Przekroje optyczne przez jądra interfazowe B. oleracea, immunobarwienie
z przeciwciałami anty H4K16ac
�� A - I - B. oleracea, forma uprawna, fluorescencja zielona
H4K16ac, niebieska DAPI
Skala - 5�m
B
A
C D
F
E
H
G
I
Rycina 37
Rycina 37
Przekroje optyczne przez jądra interfazowe B. napus, immunobarwienie
z przeciwciałami anty H4K16ac
�� A - L - B. napus, forma uprawna, fluorescencja zielona H4K16ac,
niebieska DAPI
Skala - 5�m
A
B C
E F
D
G H I
J K L
Rycina 38
Rycina 38
Przekroje optyczne przez jądra interfazowe B. rapa, immunobarwienie
z przeciwciałami anty H3K18ac
�� A - N - B. rapa, forma uprawna, fluorescencja zielona H3K18ac,
niebieska DAPI
Skala - 5�m
A B C
D E F
G H I
J K L
A M N
Rycina 39
Rycina 39
Przekroje optyczne przez jądra interfazowe B. oleracea, immunobarwienie
z przeciwciałami anty H3K18ac
�� A L - B. oleracea, forma uprawna, fluorescencja zielona
H3K18ac, niebieska DAPI
Skala - 5�m
B
A C
D E F
G H
I
K L
J
Rycina 40
Rycina 40
Przekroje optyczne przez jądra interfazowe B. napus, immunobarwienie
z przeciwciałami anty H3K18ac
�� A - L - B. napus, forma uprawna, fluorescencja zielona H3K18ac,
niebieska DAPI
Skala - 5�m
B
A C
E F
D
G H I
J K L
Dyskusja 78
5. DYSKUSJA
W niniejszej pracy przeprowadzono analizę modyfikacji genetycznych
i epigenetycznych u trzech gatunków Brassica: B. oleracea, B. rapa oraz
B. napus. W badaniach wykorzystywano zarówno formy uprawne, jak i formy
krótkiego cyklu. Formy RC są bardzo często wykorzystywane w licznych
badaniach z zakresu genetyki molekularnej, ze względu na to, iż posiadają krótki
cykl życiowy, a także mają swoje odpowiedniki w formach uprawnych. Uzyskane
wyniki badań wskazują, że obie formy gatunków Brassica różnią się między sobą
pod względem zmian genetycznych, mierzonych liczbą i lokalizacją genów
rRNA. Nie obserwowano natomiast u tych form, znaczących różnic w kontekście
modyfikacji epigenetycznych. Głównym założeniem pracy było porównanie
wzoru zmian epigenetycznych między gatunkami diploidalnymi oraz gatunkiem
allotetraploidalnym. Mimo, iż spodziewano się zaobserwować różnice we wzorze
modyfikacji epigenetycznych, wynikające z poziomu ploidalności, okazało się, że
największe zróżnicowanie cechuje gatunki diploidalne, a genom allotetraploida,
pod względem większości analizowanych modyfikacji, jest bardziej podobny do
genomu B. oleracea.
5.1. GENY rRNA JAKO MARKER CHROMOSOMÓW
Liczba i położenie genów rRNA w genomie są zazwyczaj stałe dla danego
gatunku. Jednakże u niektórych gatunków, posiadających wiele loci rDNA, ich
liczba i lokalizacja mogą być zmienne. Zwiększenie liczby loci u gatunków
allotetraploidalnych może zachodzić na drodze translokacji fragmentu
chromosomu zawierającego locus rDNA do innego chromosomu, co jest
zjawiskiem dość powszechnie obserwowanym w ewolucji genomów roślinnych,
natomiast zmniejszenie liczby loci rDNA może odbywać się w wyniku delecji
Dyskusja 79
fragmentu zwierającego locus rDNA. W przypadku takich rearanżacji
chromosomowych nie dochodzi do zmiany liczby chromosomów, jednakże
zmienia się liczba i lokalizacja sekwencji rDNA w poszczególnych
chromosomach. U podstaw tego zjawiska leżą różnego rodzaju mechanizmy, takie
jak: przemiany strukturalne chromosomów, niesymetryczny crossing over,
konwersja czy transpozycja genów (LEITCH I HESLOP-HARRISON, 1993; HALL I
PARKER, 1995; SHISHIDO I IN., 2000; HASTEROK I IN., 2005).
Badania molekularne prowadzone na resyntetyzowanych gatunkach
allotetraploidalnych wskazują na występowanie intensywnych i szybkich
przemian w genomach tych mieszańców. U genomie B. napus potwierdzono
liczne rearanżacje, które najprawdopodobniej powodowane były niewzajemną
transpozycją pomiędzy chromosomami homeologicznymi (SONG I IN., 1995).
Polimorfizm liczby loci genów rRNA może być powiązany z rearanżacjami
chromosomów w trakcie ewolucji. Taki mechanizm został zaproponowany przez
LYSAKA I INNYCH (2006), w rodzaju Arabidopsis, który wskazywał na rolę
specyficznych pericentrycznych inwersji i translokacji oraz eliminacji
fragmentów chromosomów.
Po raz pierwszy liczbę loci genów rRNA u gatunków rodzaju Brassica,
określili MALUSZYNSKA I HESLOP-HARRISON (1993). Obserwowali oni pięć par
loci genów 25S rDNA u B. rapa oraz dwie większe i jedną mniejszą parę
u B. oleracea. Trzy pary loci genów 25S rRNA u B. oleracea obserwował
również ARMSTRONG I INNI (1998). Natomiast inne prace, donoszą o istnieniu
tylko dwóch par loci tych genów u B. oleracea (SNOWDON I IN., 1997A; FUKUI I
IN., 1998; HASTEROK I MALUSZYNSKA, 2000A; HASTEROK I IN., 2001; ALI I IN.,
2005; HASTEROK I IN., 2006). U B. rapa 5 par loci genów 25S rRNA wykazali
w pózniejszych badaniach HASTEROK I INNI (2006). W chromosomach
diploidalnych gatunków Brassica występują prócz genów 25S rRNA, również
geny 5S rRNA. HASTEROK I INNI (2006) u B. rapa zlokalizowali 8 loci genów 5S
rRNA i 2 loci tych genów u B. oleracea. Natomiast ALI I INNI (2005) u B.
oleracea wyróżnili 2 chromosomy niosące po dwa loci genów 5S rRNA i 6
chromosomów z locus 5S rDNA u B. rapa. Nieco inaczej wyglądają wyniki badań
przedstawione przez SNOWDOWN I INNI (2002), gdzie stwierdzono 3 pary loci 5S
rDNA u B. rapa i 1 parę u B. oleracea.
Dyskusja 80
Interesująco przedstawia się zagadnienie liczby loci genów rRNA
u allotetraploidalnego B. napus. Liczba chromosomów u gatunków
allotetraploidalnych Brassica jest równa sumie liczby chromosomów
odpowiednich ancestralnych gatunków diploidalnych (U, 1935), jednak liczba loci
rDNA nie zawsze jest równa sumie (MALUSZYNSKA I HESLOP-HARRISON, 1993).
Dotychczasowe badania u B. napus wskazują na obecność 6 (MALUSZYNSKA I
HESLOP-HARRISON, 1993; SCHRADER I IN., 2000; SNOWDON I IN., 2000; HASTEROK
I MALUSZYNSKA, 2000B), lub siedmiu (HASTEROK I IN., 2001) par loci genów 25S
rRNA oraz 5 par loci genów 5S rRNA (HASTEROK I IN., 2006). Natomiast
w niniejszej pracy u B. napus formy uprawnej zlokalizowano 5 lub 6 par loci 25S
rDNA oraz 5 par loci 5S rDNA, natomiast u formy RC 6 par loci 25S rDNA i 5
lub 6 par 5S rDNA.
Przedstwione wyniki badań potwierdzają występowanie polimorfizmu
wewnątrzgatunkowego genów rRNA u gatunków Brassica. Polimorfizm genów
rRNA wykazano również u wielu innych gatunków, między innymi u bawełny
(HANSON I IN., 1996), fasoli (GALASSO I IN., 1995), Arabidopsis (FRANSZ I IN.,
1998), czy też koniczyny (ANSARI I IN., 1999).
Zastosowanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ z sondami rDNA daje
możliwość identyfikowania wielu chromosomów, należących do genomów
ancestralnych, a przede wszystkim jest szczególnie ważna w analizie
allopoliploidalnych gatunków Brassica. Geny rRNA stanowią, nie tylko cenne
zródło markerów cytogenetycznych, pozwalających identyfikować poszczególne
chromosomy, ale także umożliwiają śledzenie przemian chromosomowych,
różnego rodzaju rearanżacji, które mają miejsce po procesie allopoliploidyzacji,
a także w trakcie ewolucji gatunków poliploidalnych.
5.2. SEKWENCJE CENTROMEROWE
Centromery badanych w pracy gatunków Brassica zbudowane są
z sekwencji tandemowo powtórzonych o długości 176 pz (LIM I IN., 2005). Na
podstawie badań filogenetycznych, wyróżniono dwie klasy sekwencji
centromerowych u Brassica: CentBr1 i CentBr2. Sekwencje centromerowe
należące do tych klas charakteryzują się około 85% homologią. LIM I INNI (2005)
Dyskusja 81
wykorzystali te sekwencje, jako sondy do FISH. U B. rapa sonda CentBr1
hybrydyzowała do 8 par chromosomów, natomiast CentBr2 do 2 par. Nieco
pózniej LIM I INNI (2007) przeprowadzili hybrydyzację in situ z sondami CentBr1
i CentBr2 u pozostałych gatunków Brassica. Sonda CentBr1 hybrydyzowała z 8
parami chromosomów u B. rapa, 9 parami u B. oleracea i 17 parami u B. napus.
Natomiast CentBr2 z 2 parami chromosomów u B. rapa, 5 parami u B. oleracea
i 7 parami u B. napus.
Zastosowanie sond centromerowych do FISH u badanych w pracy
gatunków Brassica, wykazało różną liczbę sygnałów w chromosomach i jądrach
interfazowych w zależności od stosowanej siły płukań. Największe różnice
w stosunku do wyników otrzymanych przez LIM I INNI (2005, 2006),
zabserwowano dla sondy CentBr2, gdyż u badanych gatunków hybrydyzowała
ona z wszystkimi chromosomami. W niniejszej pracy zastosowano siłę płukań
wyższą, niż ta użyta przez LIM A I INNYCH (2005), a mimo to obserwowano
większą liczbę specyficznych sygnałów.
Sekwencje CentBr są zlokalizowane zarówno w funkcjonalnych
centromerach, jak i w heterochromatynie przycentromerowej (LIM I IN., 2005),
a liczba powtórzeń sekwencji 176 pz może różnić się w poszczególnych
chromosomach. Może to wpływać na generowanie różnej wielkości sygnałów
hybrydyzacyjnych, których wielkość jest pozytywnie skorelowana z liczbą
powtórzeń sekwencji 176 pz. Powoduje to, że trudniej jest wykryć sygnały
charakteryzujące się mniejszą intensywnością fluorescencji.
HARRISON I HELSOP-HARRISON (1995) stwierdzili podobne zmiany
w liczbie loci dla sond centromerowych u diploidalnych gatunków Brassica,
w zależności od zastosowanej siły płukań. Różnice te tłumaczono, tym iż
poszczególne chromosomy mogą charakteryzować się nieco zróżnicowanymi
sekwencjami, mimo że należą one do tej samej klasy. Należy pamiętać przy tym,
iż współczesne gatunki diploidalne Brassica, są uznawane za paleopoliploidy.
Proces diploidyzacji, związany między innymi z eliminacją sekwencji
i rearanżacjami genomu, mógł także wpływać na liczbę kopii sekwencji
zlokalizowanych przycentromerowo.
Na liczbę sygnałów w jądrach interfazowych gatunków Brassica, może
mieć wpływ rozmieszczenie heterochromatyny. U gatunków Brassica obserwuje
się liczne małe domeny heterochromatyny przycentromerowej, która znajduje się
Dyskusja 82
w obszarach euchromatyny (LIM I IN., 2005), powoduje to, że struktura jąder
interfazowych wygląda nieco inaczej niż u A. thaliana, gdzie heterochromatyna
jest skupiona w obrębie chromocentrów. LIM I INNI (2005), wyróżnili cztery typy
jąder interfazowych u B. rapa: posiadające 20 wyraznych chromocentrów,
posiadających mniej niż 12 chromocentrów i między 12, a 18 chromocentrów
oraz jądra z 20, ale silnie zdekondensowanymi chromocentrami. W niniejszej
pracy obserwowano, dekondensację części chromocentrów, co mogło być
związane z replikacją DNA w póznej fazie S cyklu komórkowego. U gatunków
diploidalnych najczęściej obserwowano 12-16 sygnałów w jądrach interfazowych
i były one zlokalizowane w obrębie dużych chromocentrów. Różnice
w lokalizacji i liczbie sygnałów dla sond centromerowych u gatunków Brassica
w komórkach merystematycznych mogą zależeć od fazy cyklu komórkowego,
a w zróżnicowanych również od poziomu endopoliploidalności.
5.3. REMODELING CHROMATYNY
Zastosowanie technik immunobarwienia umożliwiło wykrycie i lokalizację
epigenetycznych modyfikacji chromatyny zarówno w chromosomach, jak
i jądrach interfazowych gatunków Brassica. Przedstawione wyniki badań
wskazują, iż gatunki Brassica mimo tego, że są ze sobą blisko spokrewnione, to
charakteryzują się zróżnicowanym wzorem metylacji DNA i modyfikacji
histonów. Największe różnice obserwowano pomiędzy gatunkami diploidalnymi,
natomiast gatunek allotetraploidalny cechował się wypadkową modyfikacji
obserwowanych u obu ancestorów. Takich różnic nie wykazano między dwiema
analizowanymi formami gatunków Brassica. Wzór modyfikacji epigenetycznych
w jądrach interfazowych przedstawiał się u nich podobnie.
Heterochromatyna konstytutywna cechuje się wysokim poziomem
metylacji DNA oraz H3K9me2, a także wykazuje niski poziom acetylacji
histonów H3 i H4. W niniejszej pracy wykazano, że typowe markery
heterochromatyny konstytutywnej zostały wykryte również poza wysoce
skondensowaną formą chromatyny. Modyfikacje te uważane są za
konserwatywne wyznaczniki heterochromatyny konstytutywnej, ale są obecne
również w wyciszonej transkrypcyjnie euchromatynie w wyniku złożonego
Dyskusja 83
procesu zwanego heterochromatynizacją (OLSZEWSKA, 2007). Typowa dla
euchromatyny dimetylacja H3K4 została zlokalizowana poza chromocentrami
w jądrach interfazowych gatunków Brassica. Natomiast ciekawie u badanych
gatunków, przedstawia się wzór acetylowanej lizyny 5. histonu H4. Niski poziom
acetylacji histonu H4 lub jej brak, związany jest z heterochromatyną
przycentromerową u wielu gatunków, podczas gdy u B. rapa zaobserwowano, że
chromocentra większości jąder interfazowych są wyraznie wzbogacone o tę
modyfikację. Nie wykazano jednak by acetylacja H4K5 była skorelowana
z cyklem komórkowym, czyli replikacją heterochromatyny konstytutywnej
w póznej fazie S. Na podstawie uzyskanych w pracy wyników można
przypuszczać, że wysoki poziom acetylacji histonu H4 w heterochromatynie
konstytutywnej związany jest z procesem innym, niż wyłącznie replikacja DNA.
5.3.1. Metylacja DNA
Wzór metylacji DNA u B. rapa wyglądał podobnie jak u A. thaliana.
TARIQ I INNI (2003), wykorzystując immunobarwienie z przeciwciałami anty
5 mC wykazali, iż w jądrach interfazowych A. thaliana metylacja DNA
ograniczona jest do chromocentrów. B. rapa posiada stosunkowo mały genom
i heterochromatynę konstytutywną zlokalizowaną głównie w obrębie
chromocentrów w jądrach interfazowych, w przeciwieństwie do drugiego gatunku
diploidalnego B. oleracea, gdzie metylację DNA wykrywano przede wszystkim
poza chromocentrami. Wzór metylacji DNA charakteryzował się bardziej
równomiernym rozmieszczeniem w jądrach interfazowych także u gatunku
allotetraploidalnego i był podobny do tego obserwowanego u B. oleracea.
Ciekawym, jest fakt, iż obserwowano dwa rodzaje jąder interfazowych
u B. napus. Większość charakteryzowała się mocniej metylowanymi
chromocentrami, jednak występowały też takie, w których nie stwierdzono
wyraznego zróżnicowania w intensywności metylacji w całym jądrze
interfazowym. Może to wynikać, z faktu, iż analizowane jądra interfazowe mogą
pochodzić z różnego rodzaju komórek, między innymi z komórek epidermy.
U A. thaliana w epidermie korzenia komórki różnicują w dwa typy: trichoblasty
i atrichoblasty, los tych komórek jest ustalany już podczas embriogenezy, ale
także utrzymywany w trakcie rozwoju korzeni, w młodych siewkach. Proces ten
Dyskusja 84
kontrolowany jest poprzez ekspresję genu GL2, a ta ściśle związana jest ze
stanem chromatyny w locus tego genu (COSTA I SHAW, 2006).
Epigenetyczne modyfikacje chromatyny odgrywają bardzo istotną rolę
w rozwoju u roślin. Ta regulacja może dotyczyć poszczególnych genów, ale także
przejawiać się w sposób bardziej globalny , na poziomie chromatyny jąder
interfazowych. Ostatnie badania TESSADORI I INNYCH (2007A), wskazują, iż
podczas przejścia w fazę generatywną, obserwuje się zmiany we wzorze metylacji
DNA w jądrach interfazowych u A. thaliana. Sygnały anty-5 mC w jądrach
interfazowych roślin zakwitających, były rozproszone, w przeciwieństwie do
intensywnie metylowanych, skondensowanych chromocentrów u roślin
niekwitnących. Podobną sytuację zaobserwowano dla loci 5S rDNA oraz
sekwencji transpozonowych, które ulegały rozproszeniu podczas zakwitania.
MATHIEU I INNI (2003) obserwowali z kolei zmiany w organizacji
heterochromatyny podczas rozwoju siewek A. thaliana. Porównywano wzór
metylacji DNA w jądrach interfazowych u roślin dwudniowych, czterodniowych
oraz trzytygodniowych. Okazało się, że u roślin najmłodszych sygnały anty-5 mC
były rozproszone w jądrach interfazowych, w przeciwieństwie do roślin starszych,
gdzie metylację DNA zlokalizowano głównie w obszarze chromocentrów.
Rozproszone sygnały metylacji DNA wykryto również w kulturach protoplastów
u A. thaliana. Wykonując pomiar intensywności fluorescencji przeciwciała anty
5 mC z całego obszaru jąder interfazowych, nie stwierdzono znacznych zmian
w poziomie metylacji DNA w protoplastach, w porównaniu do komórek mezofilu
pochodzących z liści. Wyniki tych badań sugerują, iż w protoplastach dochodzi
do znacznej redukcji zawartości heterochromatyny w chromocentrach, co jest
związane z dekondensacją sekwencji powtarzalnych, w tym także sekwencji
centromerowych. Jednak ta dekondensacja nie jest powodowana znacznymi
zmianami w ogólnym poziomie metylacji DNA (TESSADORI I IN., 2007B).
U gatunków Brassica metylację DNA analizowano również
w chromosomach mitotycznych, w stadium metafazy oraz w chromosomach
pachytenowych. Ze względu na niewielkie rozmiary chromosomów
metafazowych, nie wyodrębniono u gatunków Brassica specyficznego wzoru
prążkowego, związanego z metylacją cytozyny. U B. napus zauważono
charakterystyczny wzór immunobarwienia, gdzie część chromosomów posiadała
znacznie intensywniejsze sygnały anty 5 mC. Podobne badania przeprowadzono
Dyskusja 85
u pszenżyta (CASTILHO I IN., 1999). Nie stwierdzono by homologiczne pary
chromosomów wykazywały podobny wzór metylacji DNA u tego gatunku. Nie
wykazano także korelacji między zmetylowanymi prążkami, a sekwencjami
centromerowymi, telomerowymi, czy też rDNA. U pszenżyta przeprowadzono
GISH w celu odróżnienia chromosomów żyta i pszenicy, nie wykazano jednak
odmiennego wzoru metylacji DNA w tych chromosomach. U B. napus GISH nie
daje satysfakcjonujących wyników, ze względu na wysoką homeologię między
genomami ancestralnymi (SNOWDON I IN., 1997B). Immonobarwienie
przeprowadzone na chromosomach pachytenowych, które dają możliwość
dokładniejszej lokalizacji sygnałów, wykazało z kolei nierównomierną
dystrybucję sygnałów anty 5 mC. W tym stadium mejozy w chromosomach
widoczne są struktury, silnie barwiące się DAPI, są to tzw. chromomery
(ARMSTRONG I JONES, 2003; ALI I IN., 2004; SHI I DAWE, 2006). Silne sygnały
metylacji DNA zlokalizowano w chromomerach, podczas gdy pomiędzy tymi
strukturami były one nie obecne.
Mimo, że stwierdzono różnice we wzorze metylacji DNA między
gatunkami Brassica, okazało się, że poziom metylacji DNA jest u nich podobny.
Gatunek allotetraploidalny charakteryzował się zbliżonym poziomem metylacji,
do gatunków diploidalnych, przy czym u formy uprawnej ilość metylowanych
cytozyn u B. napus mieściła się w podobnym przedziale jak u B. oleracea,
a u formy RC jak u B. rapa. Zaobserwowano także nieznaczne różnice
w poziomie metylacji DNA między dwiema analizowanymi formami danego
gatunku.
Technika MSAP z powodzeniem jest stosowana do analizy poziomu
metylacji DNA u różnych gatunków roślin. Umożliwia ona przeprowadzenie
analizy na stosunkowo dużych populacjach i mimo tego, iż jest czasochłonna, to
daje powtarzalne wyniki. CERVERA I INNI (2002) wykorzystali tę metodę do
porównania poziomu metylacji DNA u różnych ekotypów Arabidopsis. Poziom
metylacji DNA wynosił od 34,7% u ekotypu Copenhagen do 43,3% u Cape
Verde Islands . Podobny poziom metylacji DNA stwierdzono u badanych
w pracy gatunków Brassica, które należą do tej samej rodziny, co Arabidopsis.
Technika ta posłużyła do określenia poziomu metylacji DNA u wielu gatunków
roślin, między innymi u banana (BAURENS I IN., 2003), jabłoni (XU I IN., 2000; LI I
IN., 2002A), czy też palmy oleistej (JALIGOT I IN., 2004). Technikę MSAP
Dyskusja 86
wykorzystano w badaniach poziomu metylacji DNA u resyntetyzowanych
B. napus. Badania te wskazują na istnienie zmian w poziomie metylacji DNA
u gatunków allopoliploidalnych, w porównaniu z gatunkami rodzicielskimi.
U resyntetyzowanych B. napus reakcje MSAP przeprowadzono na cDNA,
wykorzystując między innymi startery RFLP i SSR. W pracy tej pokazano, że
metylacja de novo była charakterystyczna dla fragmentów pochodzących
z genomu B. rapa, natomiast wśród homeologów B. oleracea wykryto zarówno
de novo metylację, jak i demetylację (LUKENS I IN., 2006). Podobne badania
przeprowadził GAETA I INNI (2007), analizie MSAP poddano ponad 50 linii
resytetyzowanych B. napus, a zmiany w poziomie metylacji porównywano
w przeciągu pięciu kolejnych pokoleń. Stwierdzono, iż wzór metylacji DNA
w pokoleniu S0 jest, z wyjątkiem niewielkich zmian, utrwalony w pokoleniu S5.
W pracy dokonano zbiorczej analizy metylacji występującej w obu
cytozynach w sekwencji CCGG. Wynikało to z faktu, iż w większości
przypadków obserwowano metylację wewnętrznej cytozyny, natomiast
stosunkowo rzadko hemimetylację zewnętrznej cytozyny. Wyniki te są zgodne
z wcześniejszymi doniesieniami XU I INNYCH (2000) I LI I INNYCH (2002A), którzy
wskazują, iż większość obserwowanych fragmentów EcoRI/HpaII może być
wynikiem metylacji w wewnętrznej cytozynie. Fragmenty te generowane są na
skutek niedocięcia sekwencji przez enzym MspI, a dopiero pózniej, cięcia
enzymem HpaII. Najwięcej takich fragmentów obserwowano w górnych partiach
żelu, gdzie znajdowały się fragmenty największe, stąd można wnioskować, iż
wzór prążków odnosił się do fragmentów powstałych po cięciu trzema enzymami:
EcoRI/MspI/HpaII i jest w rezultacie efektem metylacji cytozyny wewnętrznej,
a nie hemimetylacji cytozyny zewnętrznej.
5.3.2. Modyfikacje histonów
Stosunkowo dobrze poznaną modyfikacją epigenetyczną u roślin, jest
metylacja histonów. W pracy badano metylację lizyny 4. i 9. histonu H3.
Podobnie, jak w przypadku metylacji DNA, zaobserwowano pewne tendencje we
wzorze metylacji histonu H3, u trzech analizowanych gatunków Brassica.
Dimetylację H3K4 w jądrach interfazowych tych gatunków zlokalizowano
w obszarze euchromatyny, natomiast nie wykryto sygnałów anty H3K4
Dyskusja 87
w heterochromatynie konstytutywnej. Wzór metylacji H3K4 jest konserwatywny
pomiędzy różnymi gatunkami roślin. U Arabidopsis, jęczmienia, bobu
i kukurydzy ta modyfikacja jest ewidentnym markerem euchromatyny (SOPPE I
IN., 2002; JASENCAKOVA I IN., 2003; TARIQ I IN., 2003; FUCHS I IN., 2006; SHI I
DAWE, 2006). Podobnie jest z resztą u innych eukariontów: drożdży (NOMA I IN.,
2001) myszy (TERRANOVA I IN., 2006), czy Drosophila (BEISEL I IN., 2002;
TENNEY I IN., 2006).
Wzór dimetylacji lizyny 9. histonu H3 różnił się pomiędzy gatunkami
Brassica. U B. rapa modyfikacja ta była wykrywana w heterochromatynie,
zlokalizowanej w chromocentrach, natomiast u dwóch pozostałych gatunków,
również poza chromocentrami. Różnice te mogą wynikać ze sposobu
rozmieszczenia heterochromatyny w genomach o różnej wielkości. HOUBEN I INNI
(2003), opisali lokalizację metylacji H3K9 w jądrach interfazowych, w zależności
od wielkości genomu, czyli zawartości jądrowego DNA. Według założeń
Houbena, gatunki, które posiadają genom wielkości do około 500 Mpz na 1C,
charakteryzują się metylacją H3K9 w obrębie chromocentrów, natomiast
u gatunków o genomach większych, tę modyfikację wykrywa się również
w euchromatynie. U B. rapa wielkość genomu wynosi około 529 Mpz (na 1C
DNA), podczas gdy u pozostałych dwóch gatunków, ponad 696 Mpz dla
B. oleracea i 1132 dla B. napus (JOHNSTON I IN., 2005). Koncepcja Houbena,
wydaje się więc słuszna także w przypadku analizowanych gatunków Brassica.
U A. thaliana (160 Mpz/1C) dimetylacja H3K9 jest wykrywana
w chromocentrach, natomiast u V. faba (740 Mpz/1C) przeciwciała anty
H3K9me2 zlokalizowane są równomiernie w całej chromatynie jąder
interfazowych (FUCHS I IN., 2006). Dimetylacja H3K9 jest uważna u wielu
gatunków za klasyczny marker heterochromatyny konstytutywnej. Z kolei
u kukurydzy H3K9me2 zlokalizowano głównie pomiędzy chromomerami
w chromosomach pachytenowych, co wskazywałoby, że ta modyfikacja jest
u tego gatunku związana z obszarami euchromatynowymi. Natomiast markerem
heterochromatyny u kukurydzy jest dimetylacja H3K27 (SHI I DAWE, 2006).
Interesująco przedstawia się wzór trimetylacji H3K9 w jądrach
interfazowych gatunków Brassica. Uzyskane wyniki wskazują na brak
kolokalizacji przeciwciał anty H3K9me3 z heterochromatyną konstytutywną
u wszystkich badanych gatunków Brassica. Większość sygnałów wykrywano
Dyskusja 88
w jąderku, natomiast nie obserwowano ich w chromocentrach. JACKSON I INNI
(2004), stosując różne przeciwciała anty H3K9me3, nie wykazali, by
heterochromatyna chromocentrów u A. thaliana była wzbogacona w trimetylację
lizyny 9. Stwierdzono natomiast, iż wykorzystywane w badaniach przeciwciała
charakteryzują się reaktywnością z innymi białkami niehistonowymi. Specyficzna
lokalizacja H3K9me3 w jąderku może być powiązana z regulacją aktywności
genów rRNA. Z badań prowadzonych u bobu, jęczmienia i A. thaliana wiadomo,
iż trimetylacjia H3K9 jest związana z euchromatyną u tych gatunków (FUCHS I
IN., 2006).
Wyniki badań przeprowadzone w ostatnich latach u różnych gatunków
roślin wskazują, że na strukturę chromatyny istotny wpływ ma proces acetylacji
histonów korowych. W niniejszej pracy analizowano wzór acetylacji histonów H3
i H4 w jądrach interfazowych gatunków Brassica. Wyniki badań wskazywały, iż
wzór acetylacji poszczególnych lizyn danego histonu, różni się w jądrach
interfazowych danego gatunku, a modyfikacja ta jest wykrywana w eu- lub/i
heterochromatynie. W przypadku acetylacji H4K5 zdecydowana większość jąder
interfazowych charakteryzowała się wysoką acetylacją w chromocentrach,
podczas gdy acetylacja H4K16 była obserwowana z podobną częstotliwością
zarówno w chromocentrach, jak i w euchromatynie. Zupełnie odwrotne wyniki
uzyskano dla trzeciej analizowanej modyfikacji H3K18ac, gdzie w większości
jąder sygnały wykryto tylko w niewielkim stopniu w heterochromatynie
konstytutywnej.
JASENCKOVA I INNI (2000) badali wzór acetylacji histonu H4 w jądrach
interfazowych bobu, w zależności od fazy cyklu komórkowego. Wydzielono kilka
typów wzoru acetylacji, które były charakterystyczne dla jąderka,
chromocentrów, lub euchromatyny. Badania prowadzono na posortowanych
jądrach interfazowych, w fazach: G1, S i G2. Wyniki tej analizy wskazują, iż
wzór acetylacji H4 w eu-, lub heterochromatynie jest skorelowany z replikacją
DNA. Acetylacja H4K5 w chromocentrach była wykrywana w póznej fazie S
i w G2, natomiast w euchromatynie głównie w środkowej fazie S.
U analizowanych gatunków Brassica acetylację H4K5 zlokalizowano w obrębie
chromocentrów, a w części jąder również w euchromatynie. Sygnały anty
H4K5ac wykrywano w heterochromatynie konstytutywnej we wszystkich fazach
interfazy u gatunków Brassica. Podobną zależność wzoru acetylacji od
Dyskusja 89
poszczególnych faz w interfazie, dla lizyny 16. histonu H4 obserwowali
JASENCKOVA I INNI (2000). Należy jednak zaznaczyć, że acetylacja H4K16
w chromocentrach była wykrywana w przeważającej części jąder w fazie G2
50%, jak również w G1 15%. U B. rapa w fazach S i G2 liczba jąder, gdzie
stwierdzono wysoką kolokalizację sygnałów anty H4K16 z heterochromatyną
konstytutywną była podobna do tych o niskiej kolokalizacji. Nieco mniej
natomiast obserwowano jąder o wysokiej kolokalizacji w fazie G1. Różnica
w acetylacji H4K16 w chromocentrach pomiędzy poszczególnymi fazami nie była
tak wyrazna u B. rapa jak w przypadku Vicia faba. U A. thaliana acetylację
H4K16 i H3K18 w chromocentrach, zlokalizowano w jądrach interfazowych
w póznej fazie S oraz G i znacznie rzadziej w fazie G1 (JASENCAKOVA I IN.,
2003).
Odmienne wyniki uzyskano dla acetylacji H3K18 u bobu, gdzie jądra
interfazowe charakteryzowały się równomiernym rozmieszczeniem sygnałów
anty H3K18 w całej chromatynie oraz dla acetylacji H4K5 u A. thaliana, gdzie
sygnały zlokalizowane były głównie w euchromatynie w trakcie całej interfazy
(JASENCAKOVA I IN., 2003).
Mimo dużego podobieństwa w organizacji chromatyny w jądrze
interfazowym u B. rapa i A. thalina, wyniki przedstawione w niniejszej pracy nie
potwierdzają jednoznacznie, by acetylacja histonów H3 i H4 u Brassica była
powiązana bezpośrednio z replikacją DNA. Mimo, że obserwowano
zróżnicowany wzór acetylacji w poszczególnych jądrach u B. rapa nie powiązano
określonych wzorów z poszczególnymi fazami interfazy.
Modyfikacje histonów są konserwatywne u różnych grup organizmów.
Jednakże wpływ tych modyfikacji na strukturę chromatyny może być
zróżnicowany. Wiadomo, że przyłączenie różnej liczby grup metylowych do
lizyny 9. ma zupełnie inny efekt u poszczególnych gatunków, czyli prowadzi do
powstania hetero- bądz euchromatyny. Liczne badania przeprowadzone
w ostatnich latach jednoznacznie wskazują, że poszczególne modyfikacje
epigenetyczne są od siebie ściśle uzależnione. W świetle tych badań powstaje
model, który wskazuje na powiązanie metylacji DNA, metylacji i acetylacji
histonów, wiązania białka LHP1 oraz wpływu siRNA na regulację struktury
chromatyny. Te liczne powiązania modyfikacji epigenetycznych określane są
mianem remodelingu chromatyny . Termin ten przez wielu autorów używany
Dyskusja 90
jest do opisania procesów biochemicznych, które umożliwiają modyfikację
struktury chromatyny, zmieniając tym samym jej podatność na działanie różnych
czynników enzymatycznych (HSIEH I FISCHER, 2005). W proces remodelingu
zaangażowana jest duża liczba białek, wpływających na aktywność
transkrypcyjną, bez wprowadzania zmian w sekwencji DNA.
Wnioski 91
6. WNIOSKI
Uzyskane w pracy wyniki pozwalają na wyciągnięcie następujących wniosków:
1. Jądra interfazowe badanych gatunków różnią się strukturą chromatyny.
B. rapa i B. napus charakteryzują się wyraznie zaznaczonymi
chromocentrami, natomiast w jądrach interfazowych B. oleracea nie
zawsze występują typowe chromocentra.
2. Modyfikacje genetyczne, mierzone liczbą i lokalizacją loci genów rRNA,
wykazały istnienie polimorfizmu wewnątrzgatunkowego.
3. Zastosowane w pracy sondy centromerowe nie są gatunkowo
specyficzne i w zależności od warunków in situ hybrydyzują z różną
liczbą chromosomów u wszystkich badanych gatunków.
4. Zastosowanie specyficznych przeciwciał przeciwko zmodyfikowanym
histonom i DNA pozwala wykryć i lokalizować modyfikacje
epigenetyczne w chromosomach i jądrach interfazowych gatunków
Brassica.
5. Gatunki diploidalne Brassica różnią się między sobą wzorem modyfikacji
epigenetycznych, natomiast gatunek allotetraploidalny charakteryzuje się
wzorem modyfikacji, podobnym do tego obserwowanego u B. oleracea.
6. Formy uprawne i RC badanych gatunków Brassica nie różnią się wzorem
modyfikacji epigenetycznych w jądrach interfazowych.
7. Badane gatunki różnią się między sobą wzorem metylacji DNA, przy
czym poziom metylacji DNA jest podobny u wszystkich analizowanych
gatunków.
8. Dimetylacja H3K4 jest charakterystyczna dla euchromatyny u gatunków
Brassica, natomiast dimetylacja H3K9 występuje zarówno
w euchromatynie, jak i w heterochromatynie.
Wnioski 92
9. Acetylacja H4K5, H4K16 i H3K18 jest charakterystyczna dla eu-
i heterochromatyny u gatunków Brassica.
10. Poziom acetylacji H4K5, H4K16 i H3K18 w heterochromatynie
konstytutywnej nie zmienia się w cyklu komórkowym u B. rapa.
Streszczenie 93
7. STRESZCZENIE
W niniejszej pracy przedstawiono analizę zmian genetycznych
i epigenetycznych w genomach trzech gatunków z rodzaju Brassica. Badaniami
objęto formę uprawną i RC dwóch diploidalnych gatunków: B. oleracea i B. rapa
oraz gatunku allotetraploidalnego B. napus.
Większość badań prowadzono na jądrach interfazowych, dla których
wykazano różnice w rozmieszczeniu heterochromatyny u poszczególnych
gatunków Brassica. Jądra interfazowe B. rapa i B. napus charakteryzowały się
wyraznie zaznaczonymi chromocentrami, przeważnie o zróżnicowanej wielkości,
natomiast u B. oleracea w części jąder nie występowały typowe chromocentra.
Zastosowanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ z sondami rDNA
potwierdziło występowanie polimorfizmu wewnątrzgatunkowego genów rRNA.
Analiza rozmieszczenia sekwencji centromerowych w chromosomach i jądrach
interfazowych gatunków Brassica, wykazała, że sondy CentBr nie są gatunkowo-
specyficzne i w zależności od warunków in situ hybrydyzują z różną liczbą
chromosomów.
Głównym założeniem pracy było porównanie zmian epigenetycznych
w genomach gatunków Brassica. Uzyskane wyniki wskazywały, iż największe
różnice we wzorze metylacji DNA i histonu H3 cechują gatunki diploidalne,
natomiast B. napus posiada wzór tych modyfikacji bardziej podobny do
występującego u B. oleracea. Nie wykazano natomiast istotnych różnic we
wzorze metylacji w jądrach interfazowych, pomiędzy formami uprawnymi i RC
gatunków Brassica. Analiza poziomu metylacji DNA z wykorzystaniem techniki
MSAP wykazała, że badane gatunki nieznacznie różnią się poziomem metylacji
DNA, który oscyluje w granicach 30-40% procent u poszczególnych gatunków.
Interesujące wyniki otrzymano w wyniku analizy wzoru acetylacji
histonów H3 i H4 w jądrach interfazowych. U wszystkich badanych gatunków
obserwowano zróżnicowny wzór acetylacji. W części jąder interfazowych sygnały
Streszczenie 94
były wykrywane w heterochromatynie konstytutywnej, natomiast w pozostałych
jądrach w euchromatynie, lub zarówno w eu- jak i w heterochromatynie.
Modyfikację tę badano również z wykorzystaniem, pionierskiej u roślin, analizy
w cystometrii obrazowej. Okazało się, że poziom acetylacji H4K5, H4K16
i H3K18 w heterochromatynie konstytutywnej nie zmienia się w cyklu
komórkowym. Zaobserwowano jednak pewne różnice we wzorze acetylacji
histonów H3 i H4. W przypadku acetylacji H4K5 większość jąder interfazowych
charakteryzowała się wysoką acetylacją w chromocentrach, podczas gdy
acetylacja H4K16 była obserwowana z podobną częstotliwością zarówno
w chromocentrach, jak i w euchromatynie. Zupełnie inaczej wyglądała acetylacja
H3K18, gdzie w większości jąder sygnały wykryto tylko w euchromatynie.
Przedstawione wyniki badań wskazują, iż gatunki Brassica mimo tego, że
są ze sobą blisko spokrewnione, to charakteryzują się zróżnicowanym wzorem
metylacji DNA i modyfikacji histonów. Największe różnice obserwowano
pomiędzy gatunkami diploidalnymi, natomiast gatunek allotetraploidalny
cechował się wypadkową modyfikacji obserwowanych u obu ancestorów.
Literatura 95
8. LITERATURA
Abbott R, Lowe A. 2004. Origins, establishment and evolution of new polyploid
species: Senecio cambrensis and S. eboracensis in the British Isles. Biol J
Linn Soc 82: 467-474
Adams KL, Cronn R, Percifield R, Wendel F. 2003. Genes duplicated by
polyploidy show unequal contributions to the transcriptome and organ-
specific reciprocal silencing. PNAS 100: 4649-4654
Adams KL, Percifield R, Wendel JF. 2004. Organ-specific silencing of
duplicated genes in a newly synthesized cotton allotetraploid. Genetics
168: 2217-26
Ainouche ML, Baumel A, Salmon A. 2004. Spartina anglica C. E. Hubbard: a
natural model system for analysing early evolutionary changes that affect
allopolyploid genomes. Biol J Linn Soc 82: 475-484
Ali BM, Lysak M, Schubert I. 2004. Genomic in situ hybridization in plants
with small genomes is feasible and elucidates the chromosomal parentage
in interspecific Arabidopsis hybrids. Genome 47: 954-960
Ali BM, Lysak MA, Schubert I. 2005. Chromosomal localization of rDNA in
the Brassicaceae. Genome 48: 341-346
Ansari HA, Ellison NW, Reader SM, Badaeva ED, Friebe B, Miller TE,
Williams WM. 1999. Molecular cytogenetic organization of 5S and 18S-
26S rDNA loci in white clover (Trifolium repens L.) and related species.
Ann Bot 83: 199-206
Armstrong S, Fransz P, Marshall D, Jones G. 1998. Physical mapping of DNA
repetitive sequences to mitotic and meiotic chromosomes of Brassica
oleracea var. alboglabra by fluorescence in situ hybridization. Heredity
81: 666-673
Armstrong SJ, Jones G. 2003. Meiotic cytology and chromosome behaviour in
wild-type Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany 54: 1-10
Literatura 96
Aufsatz W, Mette F, Van der Winden J, Matzke A, Matzke M. 2002. RNA-
directed DNA methylation in Arabidopsis. PNAS 99: 16499-16506
Bastow R, Mylne JS, Lister C, Lippman Z, Martienssen RA, Dean C. 2004.
Vernalization requires epigenetic silencing of FLC by histone methylation.
Nature 427: 164-167
Baumel A, Ainouche ML, Levasseur J. 2001. Molecular investigations in
populations of Spartina anglica C.E. Hubbard (Poaceae) invading coastal
Brittany (France). Molecular Ecology 10: 1689-1701
Baurens F, Bonnot F, Bienvenu D, Causse S, Legavre T. 2003. Using SD-
AFLP and MSAP to Assess CCGG Methylation in the Banana Genome.
Plant Mol Biol Rep 21: 339-348
Beisel C, Imhof A, Greene J, Kremmer E, Sauer F. 2002. Histone methylation
by the Drosophila epigenetic transcriptional regulator Ash1. Nature 419:
857-862
Belyaev ND, Houben A, Baranczewski P, Schubert I. 1998. The acetylation
patterns of histones H3 and H4 along Vicia faba chromosomes are
different. Chromosome Res. 6: 59-63
Belyayev A, Raskina O, Korol A, Nevo E. 2000. Coevolution of A and B
genomes in allotetraploid Triticum dicoccoides. Genome 43: 1021-6
Bender J. 2004. DNA methylation and epigenetics. Annu Rev Plant Biol 55: 41-
68
Berg A, Meza TJ, Mahic M, Thorstensen T, Kristiansen K, Aalen RB. 2003.
Ten members of the Arabidopsis gene family encoding methyl-CpG-
binding domain proteins are transcriptionally active and at least one,
AtMBD11, is crucial for normal development. Nucleic Acids Res 31:
5291 5304
Bharti K, Von Koskull-Doring P, Bharti S, Kumar P, Tintschl-Korbitzer A,
Treuter E, Nover L. 2004. Tomato heat stress transcription factor HsfB1
represents a novel type of general transcription coactivator with a histone-
like motif interacting with the plant CREB binding protein ortholog
HAC1. Plant Cell 16: 1521-35
Brysting A, Holst-Jensen A, Leitch IJ. 2000. Genomic origin and organization
of the hybrid Poa jemtlandica (Poaceae) verified by genomic in situ
hybridization and chloroplast DNA sequences. Ann Bot 85: 439-445
Literatura 97
Cao X, Jacobsen SE. 2002. Role of the Arabidopsis DRM methyltransferases in
de novo DNA methylation and gene silencing. Curr Biol 13: 1138-44
Caro E, Castellano M, Gutierrez C. 2007. A chromatin link that couples cell
division to root epidermis patterning in Arabidopsis. Nature 447: 213-217
Castilho A, Neves N, Rufini-Castaglione M, Viegas W, Heslop-Harrison JS.
1999. 5-methylcytosine distribution and genome organization in Triticale
before and after treatment with 5-azacytidine. Cell Sci 112: 4397-4404
Cervera MT, Ruiz-Garcia L, Martinez-Zapater JM. 2002. Analysis of DNA
methylation in Arabidopsis thaliana based on methylation-sensitive AFLP
markers. Mol Genet Genomics 286: 543-552
Chen BY, Heneen WK. 1991. The basic number of Brassica genomes: x=3?
Cruciferae Newsletter 14/15: 20-21
Chen ZJ, Pikaard CS. 1997A. Epigenetic silencing of RNA polymerase I
transcription: a role for DNA methylation and histone modification in
nucleolar dominance. Genes Dev 11: 2124-36
Chen Z, Pikaard CS. 1997B. Transcriptional analysis of nucleolar dominance in
polyploid plants: Biased expressionysilencing of progenitor rRNA genes is
developmentally regulated in Brassica. PNAS 94: 3442-3447
Chen J, Comai L, Pikaard CS. 1998. Gene dosage and stochastic effects
determine the severity and direction of uniparental ribosomal RNA gene
silencing (nucleolar dominance) in Arabidopsis allopolyploids. PNAS 95:
14891-14896
Chen ZJ, Tian L. 2007. Roles of dynamic and reversible histone acetylation in
plant development and polyploidy. Biochim Biophys Acta 1769: 295-307
Cheng BF, Heneen WK, Chen BY. 1994. Meiotic studies on a Brassica
campestris - alboglabra monosomic addition line and derived B.
campestris primary trisomics. Genome 37: 584-589
Choi S, Creelman RA, Mullet JE, Wing RA. 2000. Construction and
characterization of bacterial artificial chromosome library of Arabidopsis
thaliana. Plant Mol Biol Rep 13: 124-128
Comai L, Tyagi AP, Winter K, Holmes-Davis R, Reynolds SH, Stevens Y,
Byers B. 2000. Phenotypic instability and rapid gene silencing in newly
formed Arabidopsis allotetraploids. Plant Cell 12: 1551-68
Literatura 98
Costa S, Shaw P. 2006. Chromatin organization and cell fate switch respond to
positional information in Arabidopsis. Nature 439: 493-496
Cuadrado A, Ceoloni C, Jouve N. 1995. Variation in highly repetitive DNA
composition of heterochromatin in rye studied by fluorescence in situ
hybridization. Genome 38: 1061-1069
Cuadrado A, Jouve N. 1997. Distribution of highly repeated DNA sequences in
species of the genus Secale. Genome 40: 309-317
Doyle JJ, Doyle JL. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities
of fresh leaftissue. Phytochem Bull 19: 11-15
Feldman M, Liu B, Segal G, Abbo S, Levy AA, Vega JM. 1997. Rapid
elimination of low-copy DNA sequences in polyploid wheat: a possible
mechanism for differentiation of homoeologous chromosomes. Genetics
147: 1381-7
Finnegan EJ, Kovac KA. 2000. Plant DNA methyltransferases. Plant Mol Biol
43: 189-201
Finnegan EJ. 2002. Epialleles - a source of random variation in times of stress.
Curr Opin Plant Biol 5: 101-6
Finnegan E, Kovac K, Jaligot E, Sheldon C, Peacock J, Dennis E. 2005. The
downregulation of Flowering Locus C (FLC) expression in plants with low
levels of DNA methylation and by vernalization occurs by distinct
mechanisms. Plant J 44: 420-432
Fransz P, Armstrong S, Alonso-Blanco C, Fischer TC, Torres-Ruiz RA,
Jones G. 1998. Cytogenetics for the model system of Arabidopsis
thaliana. Plant J 13: 867-876
Fransz P, Armstrong S, DeJong H, Parnell L, Van Drunen C, Dean C, Zabel
P, Bisseling T, Jones G. 2000. Integrated cytogenetic map of chromosome
arm 4S of Arabidopsis thaliana: structural oraganization of
heterochromatic knob and centromere region. Cell 100: 367-376
Fransz P, Soppe W, Schubert I. 2003. Heterochromatin in interphase nuclei of
Arabidopsis thaliana. Chromosome Res 11: 227-240
Frieman M, Chen Z, Saez-Vasquez J, Shen A, Pikaard CS. 1999. RNA
polymerase I transcription in a Brassica interspecific hybrid and its
progenitors: tests of transcription factor involvement in nucleolar
dominance. Genetics 152: 451-460
Literatura 99
Fuchs J, Demidov D, Houben A, Schubert I. 2006. Chromosomal histone
modification patterns - from conservation to diversity. Trends in Plant
Science 11: 199-208
Fukui K, Nakayama S, Ohmido N, Yoshiaki H, Yamabe M. 1998. Quantitative
karyotyping of three diploid Brassica species by imaging methods and
localization of 45s rDNA loci on the identified chromosomes. Theor Appl
Genet 96: 325-330
Gaeta R, Pires JC, Iniguez-Luy F, Leon E, Osborn TC. 2007. Genomic
changes in resynthesized Brassica napus and their effect on gene
expression and phenotype. Plant Cell 19: 3403-3417
Galasso I, Schmidt T, Pignone D, Heslop-Harrison JS. 1995. The molecular
cytogenetics of Vigna unguiculata (L.) Walp: the physical organization
and characterization of 18S-5.8S-25S rRNA genes, 5S rRNA genes,
telomere-like sequences, and a family of centromeric repetitive DNA
sequences. Theor Appl Genet 91: 928-935
Gaudin V, Libault M, Pouteau S, Juul T, Zhao G, Lefebvre D, Grandjean O.
2001. Mutations in Like Heterochromatin Protein 1 affect flowering time
and plant architecture in Arabidopsis. Development 128: 4847-58
Gaut B, Doebley J. 1997. DNA sequence evidence for the segmental
allotetraploid origin of maize. PNAS 94: 6809-6814
Gendall A, Levy Y, Wilson A, Dean C. 2001. The Vernalization 2 gene mediates
the epigenetic regulation of vernalization in Arabidopsis. Cell 107: 525-
535
Gerlach WL, Dyer TA. 1980. Sequence organization of the repeating units in the
nucleus of wheat which contain 5S rRNA genes. Nucleic Acids Res 8:
4851-65
Gernand D, Demidov D, Houben A. 2003. The temporal and spatial pattern of
histone H3 phosphorylation at serine 28 and serine 10 is similar in plants
but differs between mono- and polycentric chromosomes. Cytogenet
Genome Res 101: 172-6
Grant D, Cregan P, Shoemaker RC. 2000. Genome organization in dicots:
genome duplication in Arabidopsis and synteny between soybean and
Arabidopsis. PNAS 97: 4168-4173
Literatura 100
Grossniklaus U, Spillane C, Page D, K�hler C. 2001. Genomic imprinting and
seed development: endosperm formation with and without sex. Curr Opin
Plant Biol 4: 21-27
Hajdera I, Siwinska D, Hasterok R, Maluszynska J. 2003. Molecular
cytogenetic analysis of genome structure in Lupinus angustifolius and
Lupinus cosentinii. Theor Appl Genet 107: 988-96
Hall KJ, Parker JS. 1995. Stable chromosome fission associated with rDNA
mobility. Chromosome Res 3: 417-422
Han F, Fedak G, Guo W, Liu B. 2005. Rapid and repeatable elimination of a
parental genome-specific DNA repeat (pGc1R-1a) in newly synthesized
wheat allopolyploids. Genetics 170: 1239-45
Hanson RE, Islam-Faridi MN, Percival EA, Crane CF, Ji Y, McKnight TD,
Stelly DM, Price HJ. 1996. Distributions of 5S and 18S-28S rDNA loci in
a tetraploid cotton (Gossypium hirsutum L.) and its putative diploid
ancestors. Chromosoma 105: 55-61
Harrison GE, Heslop-Harrison JS. 1995. Centromeric repetitive DNA
sequences in the genus Brassica. Theor Appl Genet 90: 157-165
Hasterok R, Małuszyńska J. 1997. Analiza cytogenetyczna wybranych
gatunków Brassica. Hodowla Roślin, materiały z I Krajowej konferencji,
Poznań
Hasterok R, Maluszynska J. 1998. Sequential silver staining and FISH their
use to distinguish active and inactive rRNA genome loci. In: Plant
Cytogenetics, Maluszynska J (Ed). Wyd. Uniwersytetu Śląskiego,
Katowice, pp. 168-172
Hasterok R, Maluszynska J. 2000. Nucleolar dominance does not occur in root
tip cells of allotetraploid Brassica species. Genome 43: 574-9
Hasterok R, Maluszynska J. 2000A. Cytogenetic analysis of diploid Brassica
species. Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica 42: 145-163
Hasterok R, Maluszynska J. 2000B. Cytogenetic markers of Brassica napus
chromosomes. Journal of Applied Genetics 41: 1-9
Hasterok R, Jenkins G, Langdon T, Jones RN, Maluszynska J. 2001.
Ribosomal DNA is an effective marker of Brassica chromosomes. Theor
App Genet 103: 486 - 490
Literatura 101
Hasterok R, Wolny E, Kulak S, Zdziechiewicz A, Maluszynska J, Heneen
WK. 2005. Molecular cytogenetic analysis of Brassica rapa - Brassica
oleracea var. alboglabra monosomatic addition lines. Theor Appl Genet
111: 196-205
Hasterok R, Wolny E, Hosiawa M, Kowalczyk M, Kulak-Ksiazczyk S,
Ksiazczyk T, Heneen WK, Maluszynska J. 2006. Comperative analysis
of rDNA distribution in chromosomes of various species of Brassicaceae.
Ann Bot 97: 205-216
Hasterok R, Marasek A, Donnison IS, Armstead I, Thomas A, King IP,
Wolny E, Idziak D, Draper J, Jenkins G. 2006A. Alignment of the
genomes of Brachypodium distachyon and temperate cereals and grasses
using bacterial artificial chromosome landing with fluorescence in situ
hybridization. Genetics 173: 349-362
Himelblau E, Lauffer D, Teutonico R, Pires JC, Osborn TC. 2004. Rapid -
Cycling Brassica in research and education. [In]: Biotechnology in
agriculture and forestry [Ed.] Nagata T, Lorz H, Windholm JM. Springer-
Verlag, Berlin, 54: 13-28
Houben A, Demidov D, Gernand D, Meister A, Leach C, Schubert I. 2003.
Methylation of histone H3 in euchromatin of plant chromosomes depends
on basic nuclear DNA content. Plant J 33: 967-973
Houben A, Demidov D, Caperta A, Karimi R, Agueci F, Vlasenko L. 2007.
Phosphorylation of histone H3 in plants - A dynamic affair. Biochim
Biophys Acta 1769: 308-315
Hsieh T, Fischer R. 2005. Biology of chromatin dynamics. Annu Rev Plant Biol
56: 327-351
Irigoyen ML, Linares C, Ferrer E, Fominaya A. 2002. Fluorescence in situ
hybridization mapping of Avena sativa L. cv. SunII and its monosomic
lines using cloned repetitive DNA sequences. Genome 45: 1230-1237
Jackson J, Johnson L, Jasencakova Z, Zhang X, Perez-Burgos L, Singh P,
Cheng X, Schubert I, Jenuwein T, Jacobsen S. 2004. Dimethylation of
histone H3 lysine 9 is a critical mark for DNA methylation and gene
silencing in Arabidopsis thaliana. Chromosoma 112: 308-315
Jaligot E, Beul� T, Baurens F, Billotte N, Rival A. 2004. Search for
methylation-sensitive amplification polymorphisms associated with the
Literatura 102
mantled variant phenotype in oil palm (Elaeis guineensis Jacq.).
Genome 47: 224-228
Jasencakova Z. 2003. Dynamics and functional aspects of histone modifications
in plants. http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn=nbn%3Ade%3Agbv
%3A3-000005488
Jasencakova Z, Meister A, Walter J, Turner B, Schubert I. 2000. Histone H4
acetylation of euchromatin and heterochromatin is cell cycle dependent
and correlated with replication rather than with transcription. Plant Cell
12: 2087-2100
Jasencakova Z, Meister A, Schubert I. 2001. Chromatin organization and its
relation to replication and histone acetylation during the cell cycle in
barley. Chromosoma 110: 83-92
Jasencakova Z, Soppe W, Meister A, Gernand D, Turner B, Schubert I. 2003.
Histone modifications in Arabidopsis high methylation of H3 lysine 9 is
dispensable for constitutive heterochromatin. Plant J 33: 471-480
Jeddeloh JA, Stokes TL, Richards EJ. 1999. Maintenance of genomic
methylation requires a SWI2/SNF2-like protein. Nat Genet 22: 94-7
Jenczewski E, Eber F, Grimaud A, Huet S, Lucas M, Monod H, Chevre M.
2003. PrBn, a major gene controlling homeologous pairing in oilseed rape
(Brassica napus) haploids. Genetics 164: 645-653
Johnston JS, Pepper AE, Hall AE, Chen ZJ, Hodnett G, Drabek J, Lopez R,
Price HJ. 2005. Evolution of genome size in Brassicaceae. Ann Bot 95:
229-235
Kashkush K, Feldman M, Levy AA. 2002. Gene loss, silencing and activation in
a newly synthesized wheat allotetraploid. Genetics 160: 1651-9
Kato M, Miura A, Bender J, Jacobsen S, Kakutani T. 2003. Role of CG and
non-CG methylation in immobilization of transposons in Arabidopsis.
Curr Biol 13: 421-426
Kiysue T, Ohad O, Yadegari R, Hannon M, Dinney J, Wells D, Katz A,
Margossian L, Harada J, Goldberg R, Fischer R. 1999. Control of
fertilization-independent endosperm development by the MEDEA
polycomb gene in Arabidopsis. PNAS 96: 4186-4191
Literatura 103
Kolano B, Pando LG, Maluszynska J. 2001. Molecular cytogenetic studies in
Chenopodium quinoa and Amaranthus causatus. Acta Societatis
Botanicorum Poloniae 70: 85-90
Lagercrantz U. 1998. Comparative mapping between Arabidopsis thaliana and
Brassica nigra indicates that Brassica genome have evolved through
extensive genome replication accompanied by chromosome fusions and
frequent rearrangements. Genetics 150: 1217-1228
Lagercrantz U, Lydiate DJ. 1996. Comparative genome mapping in Brassica.
Genetics 144: 1903-10
Lee HS, Chen ZJ. 2001. Protein-coding genes are epigenetically regulated in
Arabidopsis polyploids. PNAS 98: 6753-8
Leitch A, Lim K, Skalicka K, Kovarik A. 2006. Nuclear cytoplasmic interaction
hypothesis and the role of translocations in Nicotiana allopolyploids. [In]:
Radiation Risk Estimates in Normal and Emergency Situations. Springer
Link Netherlands p. 319-326
Leitch IJ, Heslop-Harrison JS. 1993. Physical mapping for four sites of 5S
rDNA sequences and one site of the alfa-amylase gene in barley (Hordeum
vulgare). Genome 36: 517-523
Leitch IJ, Bennett MD. 1997. Polyploidy in angiosperms. Trends Plant Sci 2:
470-476
Li G, Hall TC, Holmes-Davis R. 2002. Plant chromatin: development and gene
control. BioEssays 24: 234-243
Li X, Xu M, Korban S. 2002a. DNA methylation profiles differ between field-
and in vitro-grown leaves of apple. J Plant Physiol 159: 1229-1234
Li Y, Butenko Y, Grafi G. 2005. Histone deacetylation is required for
progression through mitosis in tabacco cells. Plant J 41: 346-352
Lim K, Matysek R, Kovarik A, Leitch A. 2004. Genome evolution in
allotetraploid Nicotiana. Biol J Linn Soc 82: 599-606
Lim KB, H. J, Yang TJ, Park JY, Kwon SJ, Kim JS, Lim MH, Kim JA, Jin
M, Jin YM, Kim SH, Lim YP, Bang JW, Kim HI, Park BS. 2005.
Characterization of rDNAs and tandem repeats in the heterochromatin of
Brassica rapa. Mol Cells 19: 436-444
Lim KB, Yang TJ, Hwang YJ, Kim JS, Park JY, Kwon SJ, Kim J, Choi BS,
Lim MH, Jin M, Kim HI, de Jong H, Bancroft I, Lim Y, Park BS.
Literatura 104
2007. Characterization of the centromere and peri-centromere
retrotransposons in Brassica rapa and their distribution in related Brassica
species. Plant J 49: 173-83
Lippman Z, May B, Yordan C, Singer T, Martienssen R. 2003. Distinct
mechanisms determine transposon inheritance and methylation via small
interfering RNA and histone modification. PLoS Biol 1: 420-428
Liu B, Vega JM, Feldman M. 1998A. Rapid genomic changes in newly
synthesized amphiploids of Triticum and Aegilops. II. Changes in low-
copy coding DNA sequences. Genome 41: 535-542
Liu B, Brubaker CL, Mergeai G, Cronn RC, Wendel JF. 2001. Polyploid
formation in cotton is not accompanied by rapid genomic changes.
Genome 44: 321-30
Liu B, Wendel JF. 2003. Epigenetic phenomena and the evolution of plant
allopolyploids. Mol Phylogenet Evol 29: 365-79
Lombard V, Delourme R. 2001. A consensus linkage map for rapeseed
(Brassica napus L.): construction and integration of three individual maps
from DH populations. Theor Appl Genet 103: 491-507
Luger K. 2003. Structure and dynamic behavior of nucleosomes. Curr Opin
Genet Dev 13: 127-35
Lukens L, Pires JC, Leon E, Vogelzang R, Oslach L, Osborn TC. 2006.
Patterns of sequence loss and cytosine methylation within a population of
newly resynthesized Brassica napus allopolyploids. Plant Physiol 140:
336-348
Luo M, Bilodeau P, Koltunow A, Dennis E, Peacock W, Chaudhury A. 1999.
Genes controlling fertilization-independent seed development in
Arabidopsis thaliana. PNAS 96: 296-301
Lysak MA, Fransz PF, Ali HB, Schubert I. 2001. Chromosome painting in
Arabidopsis thaliana. Plant J 28: 689-697
Lysak MA, Pecinka A, Schubert I. 2003. Recent progress in chromosome
painting of Arabidopsis and related species. Chromosome Res 11: 195-204
Lysak MA, Berr A, Pecinka A, Schmidt R, McBreen K, Schubert I. 2006.
Mechanisms of chromosome number reduction in Arabidopsis thaliana
and related Brassicaceae species. PNAS 103: 5224-9
Literatura 105
Lysak MA, Cheung K, Kitschke M, Bures P. 2007. Ancestral chromosomal
bloks are triplicated in Brassiceae species with varying chromosome
number and genome size. Plant Physiology 145: 402-410
Ma X, Gustafson J. 2005. Genome evolution of allopolyploids: a process of
cytological and genetic diploidization. Cytogenet Genome Res 109: 236-
249
Ma X, Gustafson J. 2006. Timing and rate of genome variation in triticale
following allopolyploidization. Genome 49: 950-958
Madlung A, Masuelli R, Watson B, Reynolds S, Davison J, Comai L. 2002.
Remodeling of DNA methylation and phenotypic and transcriptional
changes in synthetic Arabidopsis allotetraploids. Plant Physiol 129: 733-
746
Madlung A, Comai L. 2004. The effect of stress on genome regulation and
structure. Ann Bot 94: 481-495
Małuszyńska J. 1995. Hybrydyzacja kwasów nukleinowych in situ: od ISH do
DIRVISH. Biotechnologia 2: 92-101
Małuszyńska J. 1999. Porównawcze badania organizacji genomu roślinnego.
Postępy biologii komórki 26: 507-522
Małuszyńska J. 2001. Cytogenetyczne badania struktury genomów
poliploidalnych. Biotechnologia 52: 35-41
Maluszynska J, Heslop-Harrison JS. 1991. Localization of tandemly repeated
DNA sequences in Arabidopsis thaliana. Plant J 1: 159-166
Maluszynska J, Heslop-Harrison JS. 1993. Physical mapping of rDNA loci in
Brassica species. Genome 36: 774-781
Maluszynska J, Hasterok R, Weiss H. 1998. rRNA genes - their distribution and
activity in plants. Prace Naukowe Uniwersytetu Śląskiego 1696: 76-95
Mathieu O, Jasencakova Z, Vaillant I, Gendrel A, Colot V, Schubert I,
Tourmente S. 2003. Changes in 5S rDNA chromatin organization and
transcription during heterochromatin establishment in Arabidopsis. Plant
Cell 15: 2929-2939
McClintock B. 1984. The significance of responses of the genome to challenge.
Science 256: 792-801
Literatura 106
McKittric E, Gafken PR, Ahmad K, Henikoff S. 2004. Histone H3.3 is
enriched in covalent modifications associated with active chromatin. PNAS
101: 1525-1530
Murata M, Heslop - Harrison JS, Motoyoshi F. 1997. Physical mapping of the
5S ribosomal RNA genes in Arabidopsis thaliana by multicolor
fluorescence in situ hybridization with cosmid clones. Plant J 12: 31-37
Nakano Y, Steward N, Sekine M, Kusano T, Sano H. 2000. A tobacco
NtMET1 cDNA encoding a DNA methyltransferase: molecular
characterization and abnormal phenotypes of transgenic tobacco plants.
Plant Cell Physiol 41: 448-57
Negi MS, Devic M, Delseny M, Lakshmikumaran M. 2000. Identification of
AFLP fragments linked to seed coat colour in Brassica juncea and
conversion to a SCAR marker for rapid selection. Theor Appl Genet 101:
146-152
Noma K, Allis CD, Grewal SI. 2001. Transitions in distinct histone H3
methylation patterns at the heterochromatin domain boundaries. Science
293: 1150-1155
Ohad N, Yadegari R, Margossian L, Hannon M, Michaeli D, Harada J,
Goldberg R, Fischer R. 1999. Mutations in FIE, a WD polycomb group
gene, allow endosperm development without fertilization. Plant Cell 11:
407-415
Olszewska M. 1981. Metody badania chromosomów. Wyd. Nauk. PWN,
Warszawa
Olszewska M. 2003. DNA i białka centromerowe. Postępy biologii komórki 30:
167-185
Olszewska M. 2007. Heterochromatyna i heterochromatynizacja. Postępy biologii
komórki 34: 391-407
Osborn T, Pires C, Birchler J, Auger D, Chen Z, Lee H, Comai L, Madlung
A, Doerge R, Colot V, Martienssen R. 2003. Understanding mechanisms
of novel gene expression in polyploids. Trends Genet 19: 141-147
Ozkan H, Levy A, Feldman M. 2001. Allopolyploidy-Induced Rapid Genome
Evolution in the Wheat (Aegilops Triticum) Group. Plant Cell 13: 1735-
1747
Literatura 107
Pandey R, Muller A, Napoli CA, Selinger DA, Pikaard CS, Richards EJ,
Bender J, Mount DW, Jorgensen RA. 2002. Analysis of histone
acetyltransferase and histone deacetylase families of Arabidopsis thaliana
suggests functional diversification of chromatin modification among
multicellular eukaryotes. Nucleic Acids Res 30: 5036 5055
Park JY, Koo DH, Hong CP, Lee SJ, Jeon JW, Lee SH, Yun PY, Park BS,
Kim HR, Bang JW, Plaha P, Bancroft I, Lim YP. 2005. Physical
mapping and microsynteny of Brassica rapa ssp. pekinensis genome
corresponding to a 222 kbp gene-rich region of Arabidopsis chromosome 4
and partially duplicated on chromosome 5. Mol Gen Genomics 274: 579-
588
Parkin AP, Sharpe AG, Keith DJ, Lydiate DJ. 1995. Identification of the A and
C genomes of amphidiploid Brassica napus (oilseed rape). Genome 38:
1122-1131
Parra I, Windle B. 1993. High resolution visual mapping of stretched DNA by
fluorescent hybridization. Nat Genet 5: 17-21
Pfluger J, Wagner D. 2007. Histone modifications and dynamic regulation of
genome. Curr Opin Plant Biol 10: 645-652
Podesta A, Ruffni Castiglione M, Avanzi S, Montagnoli G. 1993. Molecular
geometry of antigen binding by a monoclonal antibody against 5-
methylcytidine. Int J Biochem 25: 929-933
Polakowski B. 1995. Botanika. Wyd. Nauk. PWN, Warszawa
Pontes O, Li CF, Nunes PC, Haag J, Ream T, Vitins A, Jacobsen S, Pikaard
CS. 2006. The Arabidopsis chromatin-modifying nuclear siRNA pathway
involves a nucleolar RNA process. Cell 126: 79-92
Pradhan A, Gupta V, Mukhopadhyay A, Arumugam N, Sodhi Y, Pental D.
2004. A high-density linkage map in Brassica juncea (Indian mustard)
using AFLP and RFLP markers. Theor Appl Genet 106: 607-614
Prymakowska-Bosak M, Przewłoka M, Ślusarczyk J, Kuraś M, Lichota J,
Kiliańczyk B, Jerzmanowski A. 1999. Linker histones play a role in male
meiosis and the development of pollen grains in tobacco. Plant Cell 11:
2317-2329
Ramsey J, Schemske DW. 1998. Pathways, mechanisms, and rates of polyploid
formation in flowering plants. Annu Rev Ecol Syst 29: 467-501
Literatura 108
Reyes JC, Hennig L, Gruissem W. 2002. Chromatin-remodeling and memory
factors. New regulators of plant development. Plant Physiol 130: 1090-
1101
Salina EA, Lim KY, Badaeva ED, Shcherban AB, Adonina IG, Amosova AV,
Samatadze TE, Vatolina TY, Zoshchuk SA, Leitch AR. 2006.
Phylogenetic reconstruction of Aegilops section Sitopsis and the evolution
of tandem repeats in the diploids and derived wheat polyploids. Genome
49: 1023-1035
Sarnowski T, Rios G, Jasik J, Swierzewski S, Kaczanowski S, Li Y,
Kwiatkowska A, Pawlikowska K, Kozbial M, Kozbial P, Koncz C,
Jerzmanowski A. 2005. SWI3 Subunits of putative SWI/SNF chromatin-
remodeling complexes play distinct roles during Arabidopsis development.
Plant Cell 17: 2454-2472
Schmidt T, Schwarzacher T, Heslop-Harrison JS. 1994. Physical mapping of
rRNA genes by fluorescent in situ hybridization and structural analysis of
5S rRNA genes and intergenic spacer sequences in sugar beet (Beta
vulgaris). Theor Appl Genet 88: 629-636
Schmitz R, Amasino R. 2007. Vernalization: A model for investigating
epigenetics and eukaryotic gene regulation in plants. Biochim Biophys
Acta 1769: 269-275
Schrader O, Budahn H, Ahne R. 2000. Detection of 5S and 25S rRNA genes in
Sinapis alba, Raphanus sativus and Brassica napus by double fluorescence
in situ hybridization. Theor Appl Genet 100: 665-669
Schranz ME, Lysak MA, Mitchell-Olds T. 2006. The ABC s of comparative
genomics in the Brassicaceae: building blocks of crucifer genomes.
Trends in Plant Science 11: 536-541
Schubert I. 1984. Mobile Nucleolus Organizing Regions (NORs) in Allium
(Liliaceae) - Inferences from the specifity of silver staining. Pl Syst Evol
144: 291-305
Schubert I. 1992. Telomeric polymorphism in Vicia faba. Zentralblatt fur
biologische Aerosolforschung 111: 164-168
Schwarzacher T, Heslop-Harrison JS. 1991. In situ hybridisation to plant
telomeres using synthetic oligomers. Genome 34: 317-323
Literatura 109
Schwarzacher T, Heslop-Harrison JS. 2000. Practical in situ hybridization.
Oxford: BIOS Scientific Limited
Sears ER. 1976. Genetic control of chromosome pairing in wheat. Can J Genet
Cytol 19: 585-593
Shaked H, Kashkush K, Ozkan H, Feldman M, Levy AA. 2001. Sequence
elimination and cytosine methylation are rapid and reproducible responses
of the genome to wide hybridization and allopolyploidy in wheat. Plant
Cell 13: 1749-59
Sherman JD, Talbert LE. 2002. Vernalization-induced changes of the DNA
methylation pattern in winter wheat. Genome 45: 253-260
Shi J, Dawe RK. 2006. Partioning of the maize epigenome by the number of
methyl groups on histone H3 lysines 9 and 27. Genetics 173: 1571-1583
Shishido R, Sano Y, Fukui K. 2000. Ribosomal DNAs: an exception to the
conservation of gene order in rice genomes. Mol Gen Genet 263: 586-591
Shoemaker R, Polzin K, Labate J, Specht J, Brummer E, Olson T, Young N,
Concibido V, Wilcox J, Tamulonis J, Kochert G, H. B. 1996. Genome
Duplication in Soybean (Glycine subgenus soja). Genetics 144: 329-338
Snowdon RJ, K�hler W, K�hler A. 1997A. Chromosomal localization and
characterization of rDNA loci in the Brassica A and C genomes. Genome
40: 582-587
Snowdon RJ, K�hler W, Friedt W, K�hler A. 1997B. Genomic in situ
hybridization in Brassica amphidiploids and interspecific hybrids. Theor
Appl Genet 95: 1320-1324
Snowdon RJ, Friedt W, K�hler A, K�hler W. 2000. Molecular cytogenetic
localization and characterization of 5S and 25S rDNA loci for
chromosome identification in oilseed rape (Brassica napus L.). Ann Bot
86: 201-204
Snowdon RJ, Friedrich T, Friedt W, K�hler W. 2002. Identifying the
chromosomes of the A- and C-genome diploid Brassica species B. rapa
(syn. campestris) and B. oleracea in their amphidiploid B. napus. Theor
Appl Genet 104: 533-538
Sokol A, Kwiatkowska A, Jerzmanowski A, Prymakowska-Bosak M. 2007.
Up-regulation of stress-inducible genes in tabacco and Arabidopsis cells in
Literatura 110
response to abiotic stresses and ABA treatment corrleates with dynamic
changes in histone H3 and H4 modifications. Planta 227: 245-254
Soltis DE, Soltis PS. 1999. Polyploidy: recurrent formation and gene evolution.
Trends Ecol Evol 14: 348-352
Soltis DE, Soltis PS, Tate JA. 2003. Advances in the study of polyploidy since
plant speciation. New Phytol. 161: 173-191
Song KM, Suzuki JY, Slocum MK, Williams PH, Osborn TC. 1991. A linkage
map of Brassica rapa (syn. campestris) based on restriction fragment
length polymorphism loci. Theor Appl Genet 82: 296-304
Song K, Lu P, Tang K, Osborn TC. 1995. Rapid genome change in synthetic
polyploids of Brassica and its implications for polyploid evolution. PNAS
92: 7719-23
Soltis DE, Soltis PS, Pires C, Kovaric A, Tate JA, Mavrodiev E. 2004. Recent
and recurrent polyploidy in Tragopogon (Asteraceae): cytogenetic,
genomic and genetic comparisons. Biol J Linn Soc 82: 485-501
Soppe W, Jasencakova Z, Houben A, Kakutani T, Meister A, Huang M,
Jacobsen S, Schubert I, Fransz P. 2002. DNA methylation controls
histone H3 lysine 9 methylation and heterochromatin assembly in
Arabidopsis. EMBO Journal 21: 6549-6559
Sridha S, Wu K. 2006. Identification of AtHD2C as a novel regulator of abscisic
acid responses in Arabidopsis. Plant J 46: 124-133
Stawski K, Dąbrowska G, Goc A. 2005. Współzależność pomiędzy metylacją
cytozyny i modyfikacjami chromatyny. Postępy biologii komórki 32: 679-
696
Sunkar R, Zhu J. 2004. Novel and Stress-Regulated MicroRNAs and Other
Small RNAs from Arabidopsis. Plant Cell 16: 2001-2019
Szittya G, Silhavy D, Molnar A. 2003. Low temperature inhibits RNA silencing-
mediated defence by the control of siRNA generation. EMBO Journal 22:
633-640
Tacik T. 1985. Kapusta Brassica L. [W]: Flora Polski. Rośliny naczyniowe.
Jasiewicz A [Wyd]. Wyd. Nauk. PWN, Warszawa, Kraków, tom IV, wyd
II, pp. 268-280
Literatura 111
Tariq M, Saze H, Probst A, Lichota J, Habu Y, Paszkowski J. 2003. Erasure
of CpG methylation in Arabidopsis alters patterns of histone H3
methylation in heterochromatin. PNAS 100: 8823-8827
Tate JA, Ni Z, Scheen AC, Koh J, Gilbert CA, Lefkowitz D, Chen ZJ, Soltis
PS, Soltis DE. 2006. Evolution and expression of homeologous loci in
Tragopogon miscellus (Asteraceae), a recent and reciprocally formed
allopolyploid. Genetics 173: 1599-611
Taverna S, Coyne R, Allis C. 2002. Methylation of histone H3 at lysine 9 targets
orogrammed DNA elimination in Tetrahymena. Cell 110: 701-711
Teerawanichpan P, Chandrasekharan MB, Jiang Y, Narangajavana J, Hall
TC. 2004. Characterization of two rice DNA methyltransferase genes and
RNAi-mediated reactivation of a silenced transgene in rice callus. Planta
218: 337-49
Tenney K, Gerber M, Ilvarsonn A, Schneider J, Gause M, Dorsett D,
Eissenberg J, Shilatifard A. 2006. Drosophila Rtf1 functions in histone
methylation, gene expression, and Notch signaling. PNAS 103: 11970-
11974
Terranova R, Agherbi H, Boned A, Meresse S, Djabali M. 2006. Histone and
DNA methylation defects at Hox genes in mice expressing a SET domain-
truncated form of Mll. PNAS 103: 6629-6634
Tessadori F, Schulkes R, Driel R, Fransz P. 2007A. Light-regulated large-scale
reorganization of chromatin during floral transition i Arabidopsis. Plant J
50: 848-857
Tessadori F, Chupeau M, Knip M, Germann S, Driel R, Fransz P, Gaudin V.
2007B. Large-scale dissociation and sequential reasembly of pericentric
heterochromatin in dedifferentiated Arabidopsis cells. Journal of Cell
Science 120: 1200-1208
Tian L, Chen ZJ. 2001. Blocking histone deacetylation in Arabidopsis induces
pleiotropic effects on plant gene regulation and development. PNAS 98:
200-205
Truco MJ, Hu J, Sadowski J, Quiros CF. 1996. Inter- and intragenomic
homology of the Brassica genomes: implications for their origin and
evolution. Theor Appl Genet 93: 1225-1233
Literatura 112
Turck F, Roudier F, Farrona S, Martin-Magniette ML, Guillaume E, Buisine
N, Gagnot S, Martienssen RA, Coupland G, Colot V. 2007. Arabidopsis
TFL2/LHP1 specifically associates with genes marked by trimethylation of
histone H3 lysine 27. PLoS Genet 3: e86
U N. 1935. Genome analysis in Brassica with special reference to the
experimental formation of B. napus and peculiar mode of fertilization. Jpn
J Genet 7: 784-794
Unfried I, Gruendler P. 1990. Nucleotide sequence of the 5.8S and 25S rRNA
genes and of the internal transcribed spacers from Arabidopsis thaliana.
Nucleic Acids Res 18: 4011
Vinkenoog R, Spielman M, Adams S, Fischer R, Dickinson HG, Scott R.
2000. Hypomethylation promotes autonomous endosperm development
and rescues postfertilization lethality in fie mutants. Plant Cell 12: 2271-
2282
Volkov R, Komarova N, Zentgraf U, Hemleben V. 2006. Epigenetic gene
silencing in plants. Progress in Botany 67: 101-133
Vos P, Hogers R, Bleeker M, Reijans M, Van de Lee T, Hornes M, Frijters A,
Pot J, Peleman J, Kuiper M, Zabeau M. 1995. AFLP: a new technique
for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Res 23: 4407-4414
Wood C, Robertson M, Tanner G, Peacock W, Dennis E, Helliwell C. 2006.
The Arabidopsis thaliana vernalization response requires a polycomb-like
protein complex that also includes Vernalization Insensitive 3. PNAS 103:
14641-14636
Xiong LZ, Xu CG, Saghai Maroof MA, Zhang Q. 1999. Patterns of cytosine
methylation in an elite rice hybrid and its parental lines, detected by a
methylation-sensitive amplification polymorphism technique. Mol Gen
Genet 261: 439-446
Xu M, Li X, Korban S. 2000. AFLP-based detection of DNA methylation. Plant
Mol Biol Rep 18: 361-368
Yang Q, Hanson L, Bennett MD, Leitch I. 1999. Genome structure and
evolution in the allohexaploid weed Avena fatua L. (Poaceae). Genome
42: 512-518
Literatura 113
Yang YW, Tai PY, Chen Y, Li WH. 2002. A study of the phylogeny of Brassica
rapa, B. nigra, Raphanus sativus, and their related genera using noncoding
regions of chloroplast DNA. Mol Phylogenet Evol 23: 268-275
Yang TJ, Kim JS, Kwon SJ, Lim KB, Choi BS, Kim JA, Jin M, Park JY, Lim
MH, Kim HI, Lim YP, Kang JJ, Hong JH, Kim CB, Bhak J, Bancroft
I, Park BS. 2006. Sequence-level analysis of the diploidization process in
the triplicated Flowering Locus C region of Brassica rapa. Plant Cell 18:
1339-47
Yang TJ, Kwon SJ, Choi BS, Kim JS, Jin M, Lim KB, Park JY, Kim JA, Lim
MH, Kim HI, Lee HJ, Lim YP, Paterson AH, Park BS. 2007.
Characterization of terminal-repeat retrotransposon in miniature (TRIM) in
Brassica relatives. Theor Appl Genet 114: 627-36
Yu Y, Tomkins JP, Waugh R, Frisch DA, Kudrna D, Kleinhofs A,
Brueggeman RS, Muehlbauer GJ, Wise RP, Wing RA. 2000. A
bacterial artificial chromosome library for barley (Hordeum vulgare L.)
and the identification of clones containing putative resistance genes. Theor
Appl Genet 101: 1093-1099
Zemach A, Li Y, Wayburn B, Ben-Meir H, Kiss V, Avivi Y, Kalchenko V,
Jacobsen S, Grafi G. 2005. DDM1 binds Arabidopsis metyl-CpG binding
domein proteins and affects their subnuclear localization. Plant Cell 17:
1549-1558
Zhang X, Clarenz O, Cokus S, Bernatavichute YV, Pellegrini M, Goodrich J,
Jacobsen SE. 2007. Whole-genome analysis of histone H3 lysine 27
trimethylation in Arabidopsis. PLoS Biol 5: e129
Zhao X, Si Y, Hanson R, Crane C, Price J, Stelly D, Wendel J, Paterson AH.
1998. Dispersed repetitive DNA has spread to new genomes since
polyploid formation in cotton. Genome Res 8: 479-492
Zhou C, Zhang L, Duan J, Miki B, Wua K. 2005. Histone deacetylase19 is
involved in jasmonic acid and ethylene signaling of pathogen response in
Arabidopsis. Plant Cell 17: 1196-1204
Zhu J, Jeong J, Zhu Y, Sokolchik I, Miyazaki S, Zhu JK, Hasegawa P,
Bohnert H, Shi H, Yun D, Bressan R. 2008. Involvement of Arabidopsis
HOS15 in histone deacetylation and cold tolerance. PNAS 105: 4945-4950
Literatura 114
Ziolkowski PA, Kaczmarek M, Babula D, Sadowski J. 2006. Genome
evolution in Arabidopsis/Brassica: conservation and divergence of ancient
rearranged segments and their breakpoints. Plant J 47: 63-74

Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
genetyka, geografia i zmiany na kościach
Genetyczne i epigenetyczne podstawy funkcjonowania organizmów
Genetyka niemendlowska (Epigenetyka i epigenom)
ZMIANY NOWOTWOROWE IMPLIKACJE W GENETYCZNEJ IDENTYFIKACJI OSÓB
zmiany w sprawozdaniach fin
zmiany plastyczne
Efekt substytucyjny i dochodowy zmiany?ny
zmiana genetyczna
Algorytmy genetyczne a logika rozmyta
C 1 Zmiany grawitacji wywołane bryłami
prasa zmiany w Wytycznych Resuscytacji 2010 w stosunku do Wytycznych 2005
moje genetyczny alg
zmiany?finicyjne

więcej podobnych podstron