Laboratorium z Inżynierii bioreaktorów
Zajęcia komputerowe-
 Wyznaczanie parametrów kinetycznych równania
Michaelis a-Menten metodą regresji liniowej i nieliniowej
Grupa 15, śr 8:15
Magdalena Ciesielska Nr 193237
Hubert Kasprowski Nr 193329
I. Wstęp teoretyczny:
Jeżeli w mieszaninie reakcyjnej stężenie enzymu jest stałe, a stężenie początkowe substratu jest w
szerokich granicach zmienne oraz wykonując pomiary dla warunków początkowych reakcji, gdzie nie
występuje akumulacja produktu, to zmiany początkowej szybkości reakcji, wyrażone jako ilośd
substratu przetworzonego w jednostce czasu można przedstawid w postaci krzywej. Pokazuje to
hiperboliczną zależnośd szybkości reakcji w funkcji stężenia substratu. Krzywa w pewnym punkcie
zagina się i osiąga stałą wartośd maksymalną *1+. Zakładając dodatkowo istnienie kompleksu enzym-
substrat oraz występowanie stanu stacjonarnego (kiedy szybkośd tworzenia i rozpadu kompleksu
enzym-substrat są sobie równe) można przedstawid ową zależnośd w postaci równania kinetycznego
Michaelis a-Menten, które wygląda następująco:
(I)
W owym równaniu bardzo ważne role spełniają parametry i . Wartośd ujawnia liczbę
obrotów enzymów, czyli liczbę cząsteczek substratu przekształconych w produkt w jednostce czasu i
jest ona zależna od całkowitego stężenia enzymu w roztworze, a także od stałej szybkości reakcji
tworzenia produktu z kompleksu enzym-substrat. Stała jest interesująca z następujących
powodów: jest miarą powinowacwa substratu do enzymu, odpowiada wartości stężenia substratu
potrzebnego do uzyskania połowy prędkości maksymalnej reakcji enzymatycznej, ustala w przybliżeniu
wewnątrzkomórkowe stężenie substratu *2+.
W analizie biochemicznej jak i przemysłowej (w celu zastosowania enzymu do procesu
przemysłowego) w oznaczaniu aktywności enzymu jedną z ważniejszych procedur jest określenie
wartości jego parametrów kinetycznych. Można to zrobid metodami regresji liniowej i regresji
nieliniowej. W skrócie, regresja liniowa polega na dopasowaniu funkcji liniowej do zbioru
punktów stanowiących dane pomiarowe poprzez minimalizację sumy kwadratów reszt. Nazywa się to
krótko liniową metodą najmniejszych kwadratów *3+. Inaczej mówiąc, poszukuje się takiej linii prostej,
aby suma kwadratów odchyleo pomiarów od tej prostej była jak najmniejsza *4+. Aby wykorzystad tę
metodę należy wykonad przekształcenie równania Michaelis a-Menten (I) aby posiadało ono liniową
zaleznośd. Są różne metody linearyzacji, z czego najczęściej stosuje się trzy: Lineweaver a-Burke a,
Hanes a-Woolf a i Woolf a-Augustinsson-Hofstee *1+. Metoda Lineweaver a-Burke a jest jedną z
najlepszych metod, która dodatkowo w widoczny sposób ukazuje różne typy inhibicji. Po
przekształceniu równania Michaelis a-Menten daje następujące równanie:
(II)
które jest de facto funkcją liniową gdzie na osi rzędnych znajdują się wartości , a na osi odciętych .
W pewnych wypadkach lepszym jest stosowanie linearyzacji Hanes a-Woolf a, która daje
dokładniejsze wyniki *4+. Stosowanie każdej z linearyzacji ma inne uzasadnienie. Posiadając pewną
wiedzę oraz przydatne oprogramowanie, można wykonad wyznaczenie owych parametrów
kinetycznych metodą regresji nieliniowej, polegająca na minimalizacji sumy kwadratów reszt do
dopasowania funkcji, która nie wykazuje liniowej kombinacji parametrów dopasowania [3]. Funkcja
taka w przestrzeni parametrów może mied więcej minimów, które mogą mied równą lub różną
głębokośd. W metodzie tej zależy na wyznaczeniu minimum globalnego co odbywa się metodami
numerycznymi. Zwykle należy podad pewien wyjściowy zestaw parametrów, która są nieodległe od
rzeczywistych aby takie minimum zostało odnalezione przez algorytm. Realizacja takiego algorytmu
wymaga zastosowania komputera [3].
1
Nieliniową metodą najmniejszych kwadratów można oznaczyd parametry kinetyczne nie wykonując
przekształceo równania Michaelis a-Menten. Powyższe metody znajdują szerokie zastosowanie w
analizie biochemicznej, której celem jest bardzo dokładne oznaczenie parametrów enzymów. Dla tego
typu analiz dobiera się inne założenia, inne warunki reakcji niż w analityce przemysłowej. Dodatkowo
metody analityczne są bardziej subtelne.
Kolejnym sposobem wyznaczania parametrów kinetycznych enzymu jest zastosowanie całkowej
postaci równania Michaelis a-Menten, które prezentuje się w następujący sposób:
( ( ) ) (III)
Stosowanie tego równania pozwala na obliczenie parametrów równania kinetycznego metodą regresji
nieliniowej *5+. Wyniki wyliczone tym sposobem nie są tak dokładne jak te pochodzące z analizy
biochemicznej, aczkolwiek ma to swoje uzasadnienie w przemyśle. Przede wszystkim stosowanie
wyników uzyskanych na drodze biochemicznych analiz nie znajdują zastosowania w większej skali
produkcyjnej podczas prowadzenia procesów w reaktorach, głównie ze względu na mniej subtelne
warunki występujące w tego typu aparatach (zamiast buforów stosowanych w biochemii, w reaktorze
występują np. NaOH, HCl w celu wyrównania pH procesu, znajduje się tam dużo inhibitorów, a
substancje takie różnie oddziałują na enzym). W przemyśle pobiera się jedynie próbki korygujące,
analityka nie jest tak złożona jak dla wcześniejszego przypadku. Również założenia dla przemysłu nie są
takie same jak dla analiz biochemicznych. Między innymi nie zakłada się początkowych warunków
reakcji, przed znaczną akumulacją produktu *6+. Parametry wyznaczane metodą przemysłową są
również po to, aby policzyd model reaktora. Liczy się czas przebywania danego substratu w reaktorze,
który nie jest obojętny i de facto to od niego zależy stopieo przereagowania i dalszy los produktu na
rynku. Za pomocą równania (III) można wyznaczyd taki czas modelowy, który następnie porównuje się
z czasem eksperymentalnym. Pokrywanie się wykresów pokazuje, że obliczenia dla reaktora są trafne i
dobrze odwzorowują procesy mające miejsce w aparacie. Brak pokrycia owych wykresów wskazuje na
opory reakcji (np. inhibicję enzymów).
Weryfikację taką prowadzi się zwykle w reaktorach okresowych. Aparaty takie, zwłaszcza z
wyposażeniem w mieszanie są najdogodniejsze do prowadzenia procesów katalizowanych przez
enzymy w fazie ciekłej. Mieszanie pomaga w rozpuszczaniu enzymów na początku procesu *7+. Jest on
również bardzo często stosowany w praktyce laboratoryjnej jak również w wielu technologiach
przemysłowych *5+. Pracuje on w cyklach, które polegają na początkowym napełnieniu bioreaktora
substratem, właściwej pracy reaktora, następnie usunięciu zawartości bioreaktora po czym produkt
poddaje się dalszej obróbce a bioreaktor jest przywracany do stanu początkowego (co nazywane jest
czasem jałowym). Reaktor okresowy jest układem zamkniętym, ponieważ w czasie jego pracy nie
dopływa do niego ani nie odpływa z niego żaden strumieo substratu czy produktu *5+. Szybkośd reakcji
w bioreaktorze okresowym jest zależna od stężenia substratu, a zatem maleje ona wraz upływem
czasu reakcji. Na początku jest ona wysoka, po czym jej wartośd obniża się wraz z obniżeniem ilości
substratu w objętości reaktora.
II. Rozpatrzenie przypadków reakcji enzymatycznej metodą biochemiczną oraz przemysłową:
Przed przystąpieniem do analizy podanych metod, warto słowem wstępu zaznaczyd, iż stężenie
początkowe dla każdego rozpatrywanego przypadku wynosi
2
1. PODSTAWOWA REAKCJA ENZYMATYCZNA
A. Obliczenie wartości Km i Vmax metodą regresji liniowej:
Posiadając eksperymentalne dane z pomiarów zależności szybkości reakcji od stężenia substratu
prowadzonej w warunkach początkowych reakcji (zanim nastąpi akumulacja produktu reakcji) można
wykonad wykres przedstawiający tę zależnośd.
Tabela 1. Funkcja szybkości reakcji
w zależności od stężenia substratu
Cs r 1/Cs 1/r
0,10 0,021 10,0 46,7
0,20 0,038 5,0 26,7
0,30 0,050 3,3 20,0
0,50 0,068 2,0 14,7
0,75 0,083 1,3 12,0
1,00 0,094 1,0 10,7
1,50 0,107 0,7 9,3
2,00 0,115 0,5 8,7
2,50 0,121 0,4 8,3
3,00 0,125 0,3 8,0
4,00 0,130 0,3 7,7
5,00 0,134 0,2 7,5
7,50 0,139 0,1 7,2
10,00 0,142 0,1 7,1
15,00 0,144 0,1 6,9
20,00 0,146 0,1 6,9
25,00 0,146 0,0 6,8
0,160
0,140
0,120
0,100
0,080
0,060
0,040
0,020
0,000
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00
Cs
Wykres 1. Wykres zależności szybkości reakcji w funkcji stężenia substratu.
3
r
Wykres nr 1 przedstawia nam hiperboliczną zależnośd szybkości reakcji w funkcji stężenia substratu.
Szybkośd reakcji zwiększa się wraz z wyższym stężeniem do pewnego momentu, w którym osiąga ona
maksimum. Aby wyznaczyd parametry równania kinetycznego, należy wykonad linearyzację np.
Lineweaver a-Burke a. W tym celu należy przekształcid równanie Michaelis a-Menten i zastosowad jego
odwrotnośd.
50,0
y = 4x + 6,6667
45,0
40,0
35,0
30,0
25,0
20,0
15,0
10,0
5,0
0,0
0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0
1/Cs
Wykres 2. Wykres Lineweaver a-Burke a.
Równanie przedstawione na wykresie ma postad:
Mając odpowiednie dane z wykresu, można wyznaczyd parametry równania:
B. Wyznaczenie parametrów kinetycznych metodą regresji nieliniowej:
Aby wyznaczyd parametry równania kinetycznego, nie trzeba wykonywad linearyzacji zależności
hiperbolicznej przedstawionej wcześniej. Mając pewną wiedzę o metodzie oraz odpowiednie
oprogramowanie można owe elementy kinetyki Michaelis a-Menten wyznaczyd sposobem regresji
nieliniowej:
a) Z wykorzystaniem równania Michaelis a  Menten (metoda  biochemiczna )
4
1/r
b) Z wykorzystaniem całkowej postaci równania Michaelis a- Menten (metoda  przemysłowa )
( ( ) )
Tabela 2. Zależności czasu t oraz obliczonego czasu
modelowego t model w funkcji stężenia substratu.
Cs t model t
30 0,0 0
29,85 1,0 1
29,7 2,0 2
29,55 3,1 3
29,25 5,1 5
28,5 10,2 10
27,75 15,3 15
27,1 19,7 20
26,3 25,2 25
25,5 30,7 30
24,1 40,2 40
22,7 49,8 50
21,3 59,4 60
18,4 79,3 79
15,4 100,0 100
12,5 120,2 120
8 152,0 150
4,3 179,1 180
2 197,5 196
0,7 210,4 210
0,2 218,7 219
0,1 222,1 222
0,05 225,3 225
5
250,0
200,0
150,0
t modelowy
100,0
t
50,0
0,0
0 10 20 30 40
Cs
Wykres 3. Wykres zależności czasu w funkcji stężenia substratu. Niebieska linia
ciągła oznacza wyliczony czas modelowy dla procesu w reaktorze okresowym.
Czerwone kwadraty oznaczają pomiary eksperymentalne.
Jak widad, w tym przypadku mamy do czynienia z typową reakcją enzymatyczną dającą opisad się
podstawowym równaniem Michaelis a-Menten, gdzie nie występuje żaden typ inhibicji. Linia ciągła
czasu modelowego pokrywa się z wartościami wyznaczonymi eksperymentalnie. Zatem całkowa postad
równania Michaelis a-Menten pozwala nam na wymodelowanie przebiegu zachodzącego procesu np.
w reaktorze okresowym.
2. INHIBICJA PRODUKTEM
A. Obliczenie wartości Km i Vmax metodą regresji liniowej:
Tabela 3. Dane dla zależności szybkości reakcji
od stężenia substratu oraz ich odwrotności.
Cs r 1/cs 1/r
0,1 0,021 10,0 46,7
0,2 0,038 5,0 26,7
0,3 0,050 3,3 20,0
0,5 0,068 2,0 14,7
0,8 0,083 1,3 12,0
1,0 0,094 1,0 10,7
1,5 0,107 0,7 9,3
2,0 0,115 0,5 8,7
2,5 0,121 0,4 8,3
3,0 0,125 0,3 8,0
4,0 0,130 0,3 7,7
5,0 0,134 0,2 7,5
7,5 0,139 0,1 7,2
10,0 0,142 0,1 7,1
15,0 0,144 0,1 6,9
20,0 0,146 0,1 6,9
30,0 0,147 0,0 6,8
40,0 0,148 0,0 6,8
6
t
0,160
0,140
0,120
0,100
0,080
0,060
0,040
0,020
0,000
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0
Cs
Wykres 4. Wykres zależności szybkości reakcji w funkcji stężenia substratu.
Powyższy wykres jest analogiczny do wykresu dla podstawowej reakcji enzymatycznej dającej opisad
się podstawowym równaniem Michaelis a-Menten. Nic nie wskazuje tutaj na występowanie inhibicji.
50,0
y = 4x + 6,6667
45,0
40,0
35,0
30,0
25,0
20,0
15,0
10,0
5,0
0,0
0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0
1/Cs
Wykres 5. Wykres Lineweaver a Burke a.
Linearyzacja Wykresu 4. również nie wskazuje na występowanie inhibicji. Wyznaczone dzięki niemu
parametry nie różnią się względem tych z przypadku, gdy hamowanie enzymu faktycznie nie
występowało (przypadek 1). Zatem stosując metodę analogiczną do poprzednich wyznaczamy:
7
r
1/r
B. Wyznaczenie parametrów kinetycznych metodą regresji nieliniowej:
a) Z wykorzystaniem równania Michaelis a  Menten (metoda  biochemiczna )
Również w tym wypadku obliczenie parametrów kinetycznych daje takie same wartości jak dla
przypadku podstawowej reakcji enzymatycznej.
b) Z wykorzystaniem całkowej postaci równania Michaelis a- Menten (metoda  przemysłowa )
Jako pierwszy przypadek weryfikacji w reaktorze okresowym zostanie przedstawione wyliczenie czasu
modelowego z zastosowaniem całkowej postaci podstawowego równania Michaelis a-Menten:
( ( ) )
.
Tabela 4. Zależności czasu t oraz obliczonego
czasu modelowego t model w funkcji stężenia substratu.
Cs t model t
30,00 0,0 0,0
29,85 1,0 1,0
29,70 2,0 2,0
29,55 3,1 3,1
29,25 5,1 5,1
28,50 10,2 10,4
27,75 15,3 15,8
27,10 19,7 20,5
26,30 25,2 26,4
25,50 30,7 32,5
24,10 40,2 43,6
22,70 49,8 55,1
21,30 59,4 67,2
18,40 79,3 94,6
15,40 100,0 127,0
12,50 120,2 164,0
8,00 152,0 240,2
4,30 179,1 342,0
2,00 197,5 463,7
0,70 210,4 627,5
0,20 218,7 821,3
0,10 222,1 928,2
0,05 225,3 1035,0
8
1200,0
1000,0
800,0
600,0
t modelowe
400,0 t
200,0
0,0
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00
Cs
Wykres 6. Wykres zależności czasu w funkcji stężenia substratu. Niebieska
linia ciągła oznacza wyliczony czas modelowy dla procesu w reaktorze
okresowym (wyliczone za pomocą całkowego równania Michaelis a-Menten).
Czerwone kwadraty oznaczają pomiary eksperymentalne.
Powyższy wykres udowadnia istnienie inhibicji w reaktorze okresowym. Jest to hamowanie enzymu
przez produkt reakcji i o ile w mikroskali, w której prowadzona była analiza biochemiczna, gdzie
przereagowanie substratu nie przekraczało 3% celem wyznaczenia szybkości reakcji (nie było zatem
akumulacji produktu), to w reaktorze okresowym gdzie stężenie produktu rośnie w całej objętości
reaktora ma ona kluczowe znaczenie. Konieczne jest zatem uwzględnienie członu, który będzie
odpowiadał inhibicji produktem w równaniu kinetycznym.
( )
( ( ) ( ) ( ( )) )
W równaniu występuje 3 razy wartośd . W takim przypadku koniecznym jest zastosowanie wartości
i jako stałych wartości znanych z niezależnych eksperymentów. W przeciwnym wypadku
równanie takie może się okazad  za trudne dla programu liczącego i może on nam wyświetlid różne
wartości a nawet nie podad nam odchyleo standardowych, zależnie od wprowadzonych parametrów
inicjacyjnych. W ten sposób otrzymujemy następujące parametry równania kinetycznego:
9
t
Podstawienie tych wartości do całkowej postaci równania kinetycznego skutkuje w uzyskaniu takich
wyników:
Tabela 5. Zależności czasu t oraz obliczonego
czasu modelowego t model w funkcji stężenia substratu.
Cs t model t
30,00 0,0 0,0
29,85 0,3 1,0
29,70 0,6 2,0
29,55 0,9 3,1
29,25 1,6 5,1
28,50 3,3 10,4
27,75 5,2 15,8
27,10 6,9 20,5
26,30 9,2 26,4
25,50 11,7 32,5
24,10 16,5 43,6
22,70 22,1 55,1
21,30 28,4 67,2
18,40 44,4 94,6
15,40 66,4 127,0
12,50 95,2 164,0
8,00 164,7 240,2
4,30 273,7 342,0
2,00 418,9 463,7
0,70 626,9 627,5
0,20 880,1 821,3
0,10 1021,0 928,2
0,05 1162,2 1035,0
1400
1200
1000
800
t modelowe
600
t
400
200
0
0 10 20 30 40
Cs
Wykres 7. Wykres zależności czasu w funkcji stężenia substratu. Niebieska linia
ciągła oznacza wyliczony czas modelowy dla procesu w reaktorze okresowym
( za pomocą całkowej postaci równania Michaelis a-Menten z uwzględnieniem
członu traktującego o inhibicji poprzez produkt). Czerwone kwadraty oznaczają
pomiary eksperymentalne.
10
t
Tak wyliczony czas modelowy pokrywa się w pewnym stopniu z czasem wyznaczonym
eksperymentalnie a zatem założenie inhibicji poprzez produkt spotkało się z dużą trafnością.
Można wyciągnąd następującą konkluzję z tego przypadku: całkowa postad równania o wiele bardziej
nadaje się do modelowania procesów przemysłowych zachodzących w reaktorach pomimo tego, że
dają one o wiele wyższe odchylenia standardowe. Metoda ta jest szczególnie przydatna, jeśli nie
znamy wpływu produktu na enzym.
3. INHIBICJA SUBSTRATEM
A. Obliczenie wartości Km i Vmax metodą regresji liniowej:
Tabela 6. Dane dla zależności szybkości reakcji
od stężenia substratu oraz ich odwrotności.
Cs r 1/Cs 1/r
0,1 0,021 10,00 46,68
0,2 0,037 5,00 26,69
0,3 0,050 3,33 20,04
0,5 0,068 2,00 14,73
0,8 0,083 1,33 12,10
1,0 0,093 1,00 10,80
1,5 0,105 0,67 9,53
2,0 0,112 0,50 8,93
2,5 0,116 0,40 8,60
3,0 0,119 0,33 8,40
4,0 0,122 0,25 8,20
5,0 0,123 0,20 8,13
7,5 0,122 0,13 8,20
10,0 0,119 0,10 8,40
15,0 0,112 0,07 8,93
20,0 0,105 0,05 9,53
25,0 0,098 0,04 10,16
30,0 0,093 0,03 10,80
35,0 0,087 0,03 11,45
40,0 0,083 0,03 12,10
11
0,140
0,120
0,100
0,080
0,060
0,040
0,020
0,000
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0
Cs
Wykres 8. Wykres zależności szybkości reakcji w funkcji stężenia substratu.
50,00
45,00
40,00
35,00
30,00
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00
Cs
Wykres 9. Wykres Lineweaver a-Burke a.
Jak widad na wykresie powyższym, wykonanie linearyzacji dla danych zawartych w Tabeli 6. skutkuje
uzyskaniem nieliniowej zależności na Wykresie 9. Taka zależnośd wskazuje na obecnośd inhibicji
substratowej, a więc sytuacji, w której duże stężenie substratu w objętości mieszaniny reakcyjnej
wpływa hamująco na działanie enzymu. Aby wyznaczyd parametry równania kinetycznego metodą
regresji liniowej należy odrzucid punkty, które zniekształcają zależnośd liniową.
12
r
r
Tabela 7. Dane po odrzuceniu argumentów i wartości,
przez które nie otrzymuje się zależności liniowej.
1/Cs 1/r
10,00 46,68
5,00 26,69
3,33 20,04
2,00 14,73
1,33 12,10
1,00 10,80
0,67 9,53
0,50 8,93
0,40 8,60
0,33 8,40
0,25 8,20
0,20 8,13
0,13 8,20
50,00
y = 3,9415x + 7,0707
45,00
40,00
35,00
30,00
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00
Cs
Wykres 10. Wykres zależności szybkości reakcji od stężenia substratu
po odrzuceniu punktów nie dających liniowej zależności.
Stosując metodę analogiczną, jak poprzednio:
13
r
B. Wyznaczenie parametrów kinetycznych metodą regresji nieliniowej:
a) Z wykorzystaniem równania Michaelis a  Menten (metoda  biochemiczna )
Podstawowe równanie Michaelis a-Menten prezentuje się w sposób następujący:
W tym przypadku jednak występuje podejrzenie inhibicji substratowej, a zatem podstawowe równanie
należy uzupełnid o człon uwzględniający taki typ inhibicji a mianowicie .
Po uwzględnieniu owego elementu w podstawowym równaniu, otrzymujemy :
Poniżej zostały przedstawione wyliczone metodą regresji nieliniowej parametry równania
kinetycznego uwzględniającego inhibicję substratową:
b) Z wykorzystaniem całkowej postaci równania:
Jako pierwszy przypadek zostanie przedstawione wyliczenie czasu modelowego z zastosowaniem
całkowej postaci podstawowego równania Michaelis a-Menten:
( ( ) )
14
Tabela 8. Zależności czasu t oraz obliczonego czasu
modelowego t model w funkcji stężenia substratu.
Cs t model t
30 0,0 0
29,85 1,1 2,2
29,7 2,2 4
29,55 3,3 6
29,25 5,4 11
28,5 10,8 19
27,75 16,3 26
27,1 21,0 34
26,3 26,8 42
25,5 32,6 52
24,1 42,7 66
22,7 52,9 80
21,3 63,1 97
18,4 84,2 123
15,4 106,2 150
12,5 127,6 176
8 161,2 211
4,3 189,9 239
3,5 196,4 245
2,2 207,5 256
1,7 212,0 260
1 219,1 267
0,5 225,4 273
0,2 231,1 278
300,0
250,0
200,0
150,0
t modelowy
100,0 t
50,0
0,0
0 10 20 30 40
Cs
Wykres 11. Wykres zależności czasu w funkcji stężenia substratu. Niebieska
linia ciągła oznacza wyliczony czas modelowy dla procesu w reaktorze
okresowym (wyliczone za pomocą całkowego równania Michaelis a-Menten).
Czerwone kwadraty oznaczają pomiary eksperymentalne.
15
t
Jak widad na wykresie nr 11 czas modelowy odbiega od czasu eksperymentalnego. Z otrzymanego
wykresu można odczytad, że w miarę wyczerpywania się substratu znika efekt hamowania działania
enzymu. Taka zależnośd jest tu widoczna dośd wyraz
nie i nie jest zatarta przez inny typ inhibicji, np.
hamowanie produktem. Zatem koniecznym jest tu zastosowanie całkowej postaci równania
Michaelis a-Menten z uwzględnieniem występowania inhibicji.
( )
( ( ) )
Tabela 9. Zależności czasu t oraz obliczonego czasu
modelowego t model w funkcji stężenia substratu.
Cs t model t
30 0 0
29,85 1,61855 2,2
29,7 3,234201 4
29,55 4,846955 6
29,25 8,063771 11
28,5 16,05517 19
27,75 23,97435 26
27,1 30,77932 34
26,3 39,08051 42
25,5 47,30008 52
24,1 61,48861 66
22,7 75,42933 80
21,3 89,12396 97
18,4 116,7181 123
15,4 144,19 150
12,5 169,7519 176
8 207,687 211
4,3 237,871 239
3,5 244,4437 245
2,2 255,4616 256
1,7 259,9563 260
1 266,8715 267
0,5 273,0274 273
0,2 278,7065 278
16
300
250
200
150
t modelowy
100 t
50
0
0 10 20 30 40
Cs
Wykres 12. Wykres zależności czasu w funkcji stężenia substratu. Niebieska
linia ciągła oznacza wyliczony czas modelowy dla procesu w reaktorze
okresowym ( za pomocą całkowej postaci równania Michaelis a-Menten
z uwzględnieniem członu traktującego o inhibicji substratowej).
Czerwone kwadraty oznaczają pomiary eksperymentalne.
Jak widad, po uwzględnieniu w równaniu występowania inhibicji substratowej, czas modelowy jest o
wiele bardziej zbieżny z czasem wyznaczonym eksperymentalnie. Zatem zastosowanie tej metody
dobrze opisuje koocówkę procesu, w której występuje inhibicja substratem.
III. Podsumowanie:
Celem dwiczenia było porównanie kilku metod wyznaczania parametrów kinetycznych równania
Michaelis a-Menten. Każda z nich ma pewne zalety, wady oraz trochę inne zastosowanie. Regresja liniowa
jest bardzo pomocna, gdy funkcję można poddad linearyzacji, jak to jest dla hiperbolicznej zależności
kinetyki Michaelis a-Menten, z czego występuje kilka różnych metod przekształceo, z których każda ma
swoje uzasadnienie. Linearyzacja Lineweaver a-Burke a na przykład jest sukcesywnie stosowana w celu
uwidocznienia jakiś typów inhibicji, aczkolwiek aby wykazad istnienie różnych izoenzymów należałoby użyd
innego typu linearyzacji.
Regresja nieliniowa może zostad zastosowana, kiedy funkcja opisująca jakąś zależnośd nie ma
przebiegu liniowego, a także, gdy nie można takiej funkcji poddad przekształceniu, aby przybrała ona
liniową postad. Posiadanie pewnej wiedzy, a także oprogramowania z odpowiednim algorytmem może
ułatwid wyznaczanie parametrów kinetycznych w ten sposób.
Regresja nieliniowa może byd zastosowana równie dobrze dla analiz biochemicznych jak i dla analiz
przemysłowych, zależnie od typu równania kinetycznego, które się zastosuje. Jeśli stosuje się równanie
Michaelis a-Menten, można z bardzo dużą dokładnością wyznaczyd parametry kinetyczne. Stosując
całkową postad równania, wyniki nie są nazbyt dokładne, aczkolwiek są one bardziej przydatne przy
projektowaniu procesów przemysłowych, ze względu na zastosowanie zupełnie odmiennych warunków i
założeo, niż jak miało to miejsce dla analiz biochemicznych. Ważnym jest, aby enzym potrafił wydajnie
katalizowad reakcję w reaktorze, mniej ważna natomiast jest dokładnośd oznaczeo. Dzięki całkowej postaci
równania, można również wyliczyd model reaktora, w którym będzie biegł proces. Bardzo ważnym jest
obliczenie czasu przebywania substratu w reaktorze, ponieważ wpływa to na stopieo przereagowania
substratu, a tym samym na ilośd otrzymanego produktu. Porównując obliczony czas modelowy z czasem
uzyskanym w serii eksperymentów można ustalid słusznośd założeo dla procesu.
17
t
Zastosowanie całkowej postaci równania oraz weryfikacja procesu w reaktorze okresowym ma
przewagę nad analizą biochemiczną. Mianowicie potrafi ona wykazad inhibicję produktem, czego dla
hiperbolicznej zależności czy też jej linearyzacji nie można uwidocznid ze względu na wykonywanie
pomiarów na początku reakcji, gdzie nie występuje jeszcze akumulacja produktu. W reaktorze stężenie
produktu jest w danym momencie stałe w całej objętości reaktora okresowego (jeśli jest to oczywiście
reaktor mieszalnikowy) a zatem wpływa on na działanie enzymu. Hamowanie enzymu produktem reakcji
jest inherentnym elementem procesu. Rzadko zdarza się reakcja, w której nie występuje hamowanie
produktem, chyba że mamy do czynienia z syntetycznym substratem, z którego produkt nie będzie
rozpoznawany przez enzym.
Warto wspomnied, iż inhibicja substratowa została również odkryta przez przemysł. Jest ona
związana z występowaniem przeszkód sterycznych, oporów dyfuzyjnych (wraz ze wzrostem stężenia
substratu rośnie lepkośd roztworu), a także w pewnym stopniu z dehydratacją białek. Jest ona z definicji
inhibicją słabą ponieważ w miarę ubywania substratu inhibicja znika.
Ważnym aspektem w wyznaczaniu parametrów kinetycznych jest dokładnośd pomiarów, ponieważ
jeśli błędy pomiarów są duże, równie duże będą odchylenia standardowe i wtedy nie pomoże żadna z
powyżej wymienionych metod.
Literatura:
*1+ Kłyszejko-Stefanowicz L., Ćwiczenia z biochemii, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2005, s. 483-
519.
[2] Zgirski A., Obliczenia biochemiczne, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1998, s. 289-352.
*3+ Zięba A., Analiza danych w naukach scisłych i technice, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2013,
s.135, 148.
*4+ A
omnicki A., Wprowadzenie do statystyki dla przyrodników,Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa
2007, s. 201-222.
[5] Ledakowicz S., Inżynieria biochemiczna, Wydawnictwo Naukowo-Techniczne, Warszawa 2011, s. 323-
344.
[6] Bednarski W., Podstawy biotechnologii przemysłowej, Wydawnictwa Naukowo-Techniczne, Warszawa
2007, s. 162-173, 318-330.
[7] Viesturs Uldis E., Bioreaktory. Zasady obliczeo i doboru., Wydawnictwo Naukowo-Techniczne, Warszawa
1990, s. 30-32.
18