Roztwory - obliczenia, przygotowanie. Doświadczenia jakościowe i ilościowe. Oznaczenia spektrofotometryczne
1
==========================================================================================
1. Sporządzanie roztworów
1. Sporządzanie roztworów
1. Sporządzanie roztworów
1. Sporządzanie roztworów
Roztwory mające służyć do oznaczeń jakościowych wystarczy zwykle przygotować z dokładnością do 1%.
Do oznaczeń ilościowych konieczne jest przygotowywanie roztworów z dokładnością 0.1% lub lepszą -
w zależności od żądanej dokładności pomiarów. W szczególności dotyczy to roztworów wzorcowych,
używanych do skalowania metod, np. do sporządzania krzywych kalibracyjnych przy oznaczeniach
spektrofotometrycznych.
1a. Przygotowanie roztworów do oznaczeń jakościowych
Przygotować po 100 ml roztworów wodnych, używając do ważenia wagi technicznej
i cylindrów miarowych do odmierzania objętości:
" 0.25 M sacharozy
" 0.9 % NaCl (w/v) - tzw. "roztwór fizjologiczny"
" 200 mM CuSO4
" 5 % octanu sodu (w/v)
" 80% etanol w H2O (v/v)
1b. Przygotowanie roztworów wzorcowych do oznaczeń ilościowych
Przygotować 25 ml 4.8 mM roztworu glukozy w H2O i 25 ml 400 mM roztworu CuCl2
w 0.9% roztworze NaCl (roztworze fizjologicznym). Ponieważ przygotowanie
bezpośrednio takiego roztworu wymaga ważenia małych ilości odczynnika, najpierw
należy przygotować roztwór o stężeniu wyższym ok. 2 rzędy wielkości, np. 1 M lub
480 mM. Użyć wagi (pół)analitycznej i kolb miarowych.
2. Oznaczenie stężenia CuCl2 - bezpośredni spektrofotometryczny pomiar stężenia
2. Oznaczenie stężenia CuCl2 - bezpośredni spektrofotometryczny pomiar stężenia
2. Oznaczenie stężenia CuCl2 - bezpośredni spektrofotometryczny pomiar stężenia
2. Oznaczenie stężenia CuCl2 - bezpośredni spektrofotometryczny pomiar stężenia
chromoforu z użyciem krzywej kalibracyjnej.
chromoforu z użyciem krzywej kalibracyjnej.
chromoforu z użyciem krzywej kalibracyjnej.
chromoforu z użyciem krzywej kalibracyjnej.
Ponieważ jon Cu2+ jest barwny (jest chromoforem), można oznaczać jego stężenie w próbce na podstawie
absorpcji światła o określonej długości fali - najlepiej w maksimum absorpcji. W celu wyznaczenia
zależności absorbancji od stężenia należy wykonać krzywą kalibracyjną, tj. serię pomiarów roztworów tej
samej substancji w tym samym środowisku o znanym stężeniu.
" Przygotować serię rozcieńczeń wzorcowego roztworu CuCl2 (z p. 1b) roztworem
fizjologicznym: 6.25, 12.5, 25, 50, 100 i 200 mM.
" Dla próbki 100 mM wyznaczyć maksimum absorpcji (max) na spektrofotometrze
Metertek metodą kolejnych przybliżeń, z dokładnością 5 nm.
" Zmierzyć absorbancje próbek serii rozcieńczeń wzorcowych i próbki badanej
(otrzymanej od prowadzącego ćwiczenia) przy maksimum absorpcji.
UWAGA: wszystkie pomiary wykonać względem próbki odniesienia - roztworu
fizjologicznego.
Roztwory - obliczenia, przygotowanie. Doświadczenia jakościowe i ilościowe. Oznaczenia spektrofotometryczne
2
==========================================================================================
" Odręcznie wykreślić krzywą kalibracyjną i określić stężenie badanej próbki. Wyliczyć
molowy współczynnik absorbancji jonów Cu2+ w roztworze fizjologicznym.
3. Oznaczanie stężenia jonów Cu2+ w roztworze o nieznanym składzie (alkalicznym
3. Oznaczanie stężenia jonów Cu2+ w roztworze o nieznanym składzie (alkalicznym
3. Oznaczanie stężenia jonów Cu2+ w roztworze o nieznanym składzie (alkalicznym
3. Oznaczanie stężenia jonów Cu2+ w roztworze o nieznanym składzie (alkalicznym
roztworze albuminy) - przykład zastosowania metody dodatku wzorca
roztworze albuminy) - przykład zastosowania metody dodatku wzorca
roztworze albuminy) - przykład zastosowania metody dodatku wzorca
roztworze albuminy) - przykład zastosowania metody dodatku wzorca
Składniki roztworu mogą bardzo silnie wpływać na własności spektroskopowe chromoforów, zmieniając
zarówno położenie maksimum absorpcji jak i molowy współczynnik absorbancji. W warunkach, gdy skład
próbki nie jest znany, do przybliżonego oznaczenia stężenia chromoforu można użyć metody dodatku
wzorca.
" 2 ml otrzymanej od prowadzącego próbki, zawierającej jony Cu2+ w alkalicznym
roztworze albuminy surowicy bydlęcej umieścić w kuwecie spektrofotometrycznej.
" Wyznaczyć max próbki (w zakresie 500-650 nm); zmierzyć absorbancje przy maksimum
i przy długości fali tła - 900 nm. Pomiary wykonywać względem powietrza.
" Dodać 25 �l 400 mM roztworu CuCl2 (z p. 1b), odczekać 2 min i powtórzyć pomiary.
" Do tej samej próbki dodać powtórnie 25 �l 400 mM roztworu CuCl2 i wykonać pomiary
jeszcze raz.
" Obliczyć stężenie jonów Cu2+ w próbce badanej zakładając addytywność absorbancji w
badanym roztworze i przyjmując zmierzone wartości A800nm za tło. Obliczyć molowy
wspólczynnik absorbancji Cu2+ w tych warunkach i porównać z otrzymanym w
ćwiczeniu 2.
4. Oznaczanie stężenia glukozy metodą Somogyi-Nelsona - oznaczanie chromoforu
4. Oznaczanie stężenia glukozy metodą Somogyi-Nelsona - oznaczanie chromoforu
4. Oznaczanie stężenia glukozy metodą Somogyi-Nelsona - oznaczanie chromoforu
4. Oznaczanie stężenia glukozy metodą Somogyi-Nelsona - oznaczanie chromoforu
wytworzonego w ilościowej reakcji chemicznej z badaną substancją.
wytworzonego w ilościowej reakcji chemicznej z badaną substancją.
wytworzonego w ilościowej reakcji chemicznej z badaną substancją.
wytworzonego w ilościowej reakcji chemicznej z badaną substancją.
W celu oznaczenia związków nie zawierających grup chromoforowych wykorzystać można reakcje
chemiczne badanej substancji, prowadzące do ilościowego wytworzenia substancji absorbującej światło.
Do oznaczania stężenia cukrów redukujących wykorzystuje się ich zdolność redukowania jonów Cu2+ do
Cu+, które następnie redukują odczynnik arsenomolibdenowy do błękitu molibdenowego, silnie
absorbującego światło przy max=520 nm. W celu uzyskania wysokiej dokładności do wzorcowania tego typu
metod używa się zazwyczaj serii roztworów wzorcowych poddawanych obróbce chemicznej jednocześnie z
próbką badaną.
" Przygotować "odczynnik miedziowy" Somogyi-Nelsona: zmieszać roztwór
węglanu/winianu z roztworem CuSO4 w stosunku 25:1 (obliczyć ilość gotowego roztworu
potrzebną do wykonania oznaczeń!).
" Z wykonanego wcześniej 4.8 mM roztworu wzorcowego glukozy przygotować po 1 ml
roztworów szeregu rozcieńczeń: 75, 150, 300 600 �M, 1.2, 2.4, 4.8 mM.
" Oznaczenia wykonać dla powyższego szeregu rozcieńczeń (krzywa kalibracyjna), próby
ślepej (roztwór fizjologiczny) i (3 powtórzenia) dla próbki otrzymanej od prowadzącego.
Czynności dla wszystkich próbek przeprowadzać jednocześnie!
Roztwory - obliczenia, przygotowanie. Doświadczenia jakościowe i ilościowe. Oznaczenia spektrofotometryczne
3
==========================================================================================
Procedurę oznaczenia dla pojedynczej próbki przeprowadzać jak następuje:
UWAGA! Wszystkie odczynniki wkraplać NA DNO probówki, tak aby nie zostawały na
UWAGA! Wszystkie odczynniki wkraplać NA DNO probówki, tak aby nie zostawały na
UWAGA! Wszystkie odczynniki wkraplać NA DNO probówki, tak aby nie zostawały na
UWAGA! Wszystkie odczynniki wkraplać NA DNO probówki, tak aby nie zostawały na
ściankach !!!
ściankach !!!
ściankach !!!
ściankach !!!
" W standardowej szklanej probówce umieścić 200 �l "odczynnika miedziowego"
" Energicznie dodać 200 �l badanej próbki
" W wylocie probówki umieścić chłodniczkę zwrotną i ogrzewać na wrzącej łaz
ni wodnej
przez co najmniej 15 min.
" Ostudzić i dodać 200 �l odczynnika arsenowo-molibdenowego. Silnie mieszać do zaniku
pienienia, następnie dodać 5 ml H2O.
" Mierzyć absorbancję przy =520 nm względem wody.
Na podstawie uzyskanych wyników (odejmując absorbancję ślepej próby od wszystkich
pozostałych absorbancji) wykreślić odręcznie krzywą kalibracyjną i określić stężenie
badanej próbki oraz błąd (rozrzut) przeprowadzonego oznaczenia.
Odczynniki i materiały:
sacharoza, glukoza, NaCl, CuSO4�"5H2O, octan sodu bezwodny i trójwodny, CuCl2: w oryginalnych
opakowaniach; etanol 96% (skażony acetonem), roztwory do oznaczania glukozy met. Somogyi-Nelsona, 1%
roztwór BSA w 1.5M KOH (lub białko jajka kurzego rozcieńczone 10-krotnie 1.5M KOH); próbki glukozy w
wodzie, CuCl2 w roztworze fizjologicznym i w alkalicznym roztworze białka jako zadania
Sprzęt:
waga techniczna, waga (pół)analityczna, naczynka do ważenia, komplet pipet automatycznych, końcówki
do pipet, cylindry miarowe, kolby miarowe 25 ml, zlewki 200 ml, probówki szklane standardowe,
chłodniczki zwrotne, spektrofotometry Metertek, kuwety plastikowe, wrząca łażnia wodna