4. Limfocyty B
4.1. Rozwój limfocytów B
Limfocyty B, podobnie jak wszystkie komórki układu immunologicznego, powstają z sa-
moodnawiającej się krwiotwórczej komórki macierzystej HSC. Pierwszą komórką ukierunko-
waną na linię limfocytów B jest komórka pre-pro B lub CLP-2 (ryc. 4.1), która powstaje z ko-
mórki macierzystej limfoidalnej (CLP) w szpiku kostnym i charakteryzuje się ekspresją izo-
formy cząsteczki CD45  B220 będącej charakterystycznym markerem limfocytów B.
Ryc. 4.1. Wczesne etapy rozwoju limfocytów B i czynniki transkrypcyjne biorące udział
w tym procesie (z
ródło: Nutt S Immunity 2007)
Pierwsze progenitory limfocytów B są komórkami, które charakteryzują się ekspresją
cząsteczki powierzchniowej CD19, będącej bezpośrednim celem czynnika transkrypcyjnego
PAX5, który odgrywa najistotniejszą rolę w różnicowaniu limfocytów B.
W tabeli 4.1 przedstawiono krótką charakterystykę czynników transkrypcyjnych istot-
nych w różnicowaniu limfocytów B.
Tab. 4.1. Czynniki transkrypcyjne odpowiedzialne za różnicowanie limfocytów B
Czynnik tran- Motyw wiążący się z DNA Charakterystyka
skrypcyjny (sekwencja konsensusowa)
(symbol genu)
PU.1 (Sfpi1) Ets (AGGAAGT) reguluje ekspresje szeregu genów niezbęd-
nych w różnicowaniu populacji limfocytów B
(geny dla Ig, FcR, CD20, CD72)
Ikaros (Ikzf) palec cynkowy (TGGGAA) niezbędny w początkowych etapach różnico-
wania limfocytów B (myszy z delecją genu Ikzf
nie wytwarzają limfocytów B) może też mieć
znaczenie w sygnalizacji przez receptor BCR
E2A (Tcfe2a) bHLH (ACACCTGC) w limfocytach pro-B wymagany do indukcji
EBF1
EBF1 (Ebf1) Zinc knuckle indukuje różnicowanie limfocytów B, umożli-
(ATTCCCNNG GGAAT) wia limfopoezÄ™ w progenitorach PU.1-/-, E2A-/-
lub IL-7R-/-
Pax5 (Pax5) sparowana domena prekursory komórek B, którym brak czynnika
(A/GNCNANTC/GAT/A transkrypcjnego Pax5, nie mogą osiągnąć
174
Rozdział 4. Lmfocyty B
GCGG/TA/GT/AA/C) stadium dojrzałych produkujących przeciwcia-
ła limfocytów B, i zatrzymują się na etapie
komórek pro/pre-B; usunięcie genu Pax5
może prowadzić do różnicowania tych komó-
rek w limfocyty T, NK, granulocyty, makrofagi
i komórki dendrytyczne
Aiolos (Ikzf3) palec cynkowy (TGGGAA) indukowany po sygnalizacji pre-BCR, wpływa
na obniżenie ekspresji genu kodującego łań-
cuch zastępczy 5
Sox4 (Sox4) domena HMG (CCTTTGAA) odpowiedzialny za sygnalizacjÄ™
Lef1 (Lef1) domena HMG aktywator/represor transkrypcji; myszy z de-
(CCTTTGA/T A/T) lecjÄ… Lef1 majÄ… dwukrotnie mniejsze liczby
limfocytów pro-B, które proliferują znacznie
słabiej niż komórki typu dzikiego
Bcl11a (Evi9) palec cynkowy (GGCCGG) mutacje tego genu widoczne są w białaczkach
wywodzących się z limfocytów B; myszy z
delecją Evi9 nie wytwarzają limfocytów B
GABP (gabpa) Ets (AGGAAGT) niezbędny do ekspresji receptora dla IL7
(IL7R)
Wczesne stadia dojrzewania limfocytów B zależą od kontaktu tych komórek z komórka-
mi zrębu szpiku, które produkują czynniki wzrostowe niezbędne do różnicowania limfocytów
B. Należy do nich czynnik komórek macierzystych  SCF, który jest białkiem błonowym reagu-
jącym z receptorem kinazy tyrozynowej cKit (CD117). Niezbędna w różnicowaniu limfocytów
B jest również IL7. Komórki pro-B, które prawidłowo zrearanżują geny dla łańcucha ciężkiego
immunoglobuliny (Igh) przechodzą do stadium pre-B. Komórki pre-B mają na swojej po-
wierzchni receptor pre-BCR, który zbudowany jest z prawidłowo zrearanżowanego łańcucha
ciężkiego immunoglobuliny i zastępczych łańcuchów lekkich  5 i VpreB. Sygnalizacja przez
receptor pre-B skutkuje proliferacją i inicjuje rekombinację genów dla łańcucha lekkiego 8

(Ig8
) i wyłączenie alleliczne w locus Igh (ryc. 4.5). Produktywna rearanżacja genów dla łańcu-
cha lekkiego immunoglobuliny prowadzi do ekspresji receptora BCR (immunoglobulina wbu-
dowana w błonę limfocytu B)  na tym etapie limfocyt B określa się jako niedojrzały. Zawsze
jako pierwsze są syntetyzowane immunoglobuliny klasy M, dlatego niedojrzały limfocyt B ma
na swojej powierzchni receptor BCR w postaci IgM. Niedojrzałe limfocyty B, zanim opuszczą
szpik kostny, przechodzą selekcję negatywną. Te, które zbyt silnie wiążą się z własnymi anty-
genami ulegajÄ… apoptozie bÄ…dz
są inaktywowane. Te, które przeżyją opuszczają szpik kostny,
dostajÄ… siÄ™ do krwiobiegu i dojrzewajÄ… nabywajÄ…c ekspresji drugiego receptora tej samej
swostości  IgD, kierują się do węzłów chłonnych i mogą rozpoznawać antygeny. Limfocyt B z
ekspresją receptorów IgM i IgD nosi nazwę dojrzałego (naiwnego) limfocytu B.
4.1.1. Kontrola ekspresji genów odpowiedzialnych za różnicowanie limfocytów B
Gen Ebf1 jest kontrolowany przez dwa promotory: dystalny (Ä…) i proksymalny (²), które
produkują dwie formy białka EBF1 różniące się regionem 11 aminokwasów na końcu N.
Obecność promotora Ebf1ą wykazano w limfocytarnej linii komórek pro-B (PD31). Za jego
aktywację odpowiedzialne są E2A i pośrednio STAT5 (ryc. 4.2A). Ponieważ białko STAT5 jest
aktywowane w wyniku sygnalizacji przez receptor dla IL7, odkrycie to wyjaśnia zależność
175
Monika Ryba
ekspresji Ebf1 od E2A i IL7R. W promotorze Ebf1ą występują miejsca wiązania samego czyn-
nika EBF1, co Å›wiadczy o autoregulacyjnej funkcji tego biaÅ‚ka. Promotor Ebf1² wykazuje ak-
tywność głównie w linii dojrzałych limfocytów B (Raji) i jest regulowany przez Ets1, PU.1 i
Pax5. Ponieważ ekspresja Pax5 zależy od EBF1, EBF1 reguluje swoją własną ekspresję bezpo-
średnio poprzez indukcję promotora Ebf1ą i pośrednio poprzez zwiększenie ekspresji białka
Pax5. Indukcja genu Ebf1 przechodzi więc przez trzy następujące po sobie fazy: (1) aktywacja
Ebf1ą zależna od E2A i STAT5; zaraz potem następuje (2) zwiększona ekspresja EBF1
w wyniku wiązania EBF1 w promotorze Ebf1ą. To z kolei indukuje Pax5 i w końcu (3) Pax5,
Ets1 i PU.1 aktywujÄ… promotor Ebf1². Pax5, podobnie jak Ebf1 ma dwa niezależne promoto-
ry, jednak poza kontrolÄ… ze strony EBF1 niewiele wiadomo na temat regulacji tego genu (ryc.
4.2B).
Ryc. 4.2. Kontrola ekspresji genów B-specyficznych
(z
ródło: Nutt S Immunity 2007)
Geny Cd79a i IgII1 stały się użytecznymi modelami do analizy mechanizmów cis- / trans-
kontrolujących ekspresję genów charakterystycznych dla limfocytów B (ryc. 4.2C i 4.2D).
Cd79a koduje transbłonowe białko zawierające motywy ITAM, niezbędne w przekazywaniu
sygnału z receptora pre-BCR jak również dojrzałego BCR. Aktywacja sekwencji wzmacniającej
w promotorze genu Cd79a jest możliwa dzięki wspólnemu udziałowi czynników: E2A, EBF1,
Pax5, Ets1, i Runx1. W promotorze genu Cd79a wykazano obecność nieklasycznego miejsca
wiążącego czynnik Ets1, ale tylko w kompleksie z białkiem Pax5. Jednakże, mimo obecności
176
Rozdział 4. Lmfocyty B
Pax5, związanie Ets1 do enhancera Cd79a wymaga demetylacji DNA, która możliwa jest do-
piero po związaniu czynników E2A, EBF1 i Runx1 do sekwencji leżących powyżej miejsca wią-
zania kompleksu Pax5-Ets1.
Mechanizm kontrolujący ekspresję genu IgII1 kodującego zastępczy łańcuch lekki 5 był
badany dość intensywnie, jako że gen ten jest genem typowym dla limfocytów B, a po uda-
nej rearanżacji w locus łańcucha ciężkiego, podczas przejścia do stanu pre-B, IgII1 jest wyci-
szany. Typowa dla limfocytów B ekspresja IgII1 jest możliwa dzięki odłączeniu się od tego
genu kompleksu represorowego zawierającego Ikaros. Wykazano, że Ikaros współzawodni-
czy z białkiem EBF1 o miejsce wiązania do sekwencji promotorowej genu IgII1. Podczas in-
dukcji różnicowania limfocytów B, w stadium pro-B, ilość EBF1 wzrasta i uniemożliwia wiąza-
nie represora, jednocześnie włączając transkrypcję genu. Obniżenie ekspresji IgII1, obser-
wowane w komórkach pre-B, wymaga obecności czynnika Aiolos, który pojawia się po sygna-
lizacji z receptora pre-BCR.
4.1.2. Pax5
Pax5 (Paired Box Gene 5) jest wielofunkcyjnym regulatorem transkrypcji, którego eks-
presja utrzymuje się na stałym poziomie począwszy od komórek pro-B aż do stadium komó-
rek plazmatycznych, w których dochodzi do obniżenia jego ekspresji. Pax5 wiąże się z DNA
dzięki swojej sparowanej domenie na końcu N. Badania strukturalne wykazały, że domena ta
składa się z dwóch subdomen, z których każda niezależnie może wiązać się z połową nukle-
otydów odpowiedniej sekwencji w DNA. To  dwuczęściowe wiązanie pozwala na dużą de-
generację sekwencji DNA wiążącej Pax5. Zmiany nukleotydów w obrębie tej sekwencji mogą
prowadzić do wzmocnienia wiązania jednej subdomeny, a osłabienia drugiej.
Wykazano, że Pax5 ma właściwości zarówno aktywatora, jak i represora transkrypcji. Za
regulację ekspresji genów jest odpowiedzialna część białka leżąca na jego końcu karboksylo-
wym, która zawiera domenę aktywującą i hamującą. Poza tym centralnie zlokalizowany kon-
serwowany oktapeptyd jest wymagany do represji genów poprzez wiązanie korepresorów
Groucho (Grg 1  4). Na aktywność Pax5 mogą też wpływać interakcje z innymi czynnikami
transkrypcyjnymi takimi jak: białka z domeną Ets, Runx1, czy c-Myb. Pax5 przyczynia się do
regulacji specyficznego dla limfocytów B promotora Cd79a właśnie poprzez wiązanie białek z
domenÄ… Ets.
177
Monika Ryba
Ryc. 4.3. Główne domeny białka Pax5 i reagujące z nimi czynniki
(z
ródło: Holmes LM Immunology and Cell Biology 2008)
4.1.2.1. Regulacja ekspresji genów przez Pax5
Zidentyfikowano ponad 100 genów, które ulegają represji pod wpływem Pax5. Więk-
szość z tych genów ulega normalnej ekspresji w innych populacjach komórek układu immu-
nologicznego. Na przykład do takich genów zaliczyć można Csf1r kodujący receptor dla ma-
krofagalnego czynnika wzrostu (MCSFR) czy też gen kodujący białko Notch1, które pozwalają
komórkom pro-B Pax5-/- na różnicowanie odpowiednio w makrofagi i limfocyty T. wprowa-
dzenie genu Pax5 spowrotem do komórek Pax5-/- prowadzi do represji Csf1r i Notch1. Innym
hamowanym przez Pax5 genem jest Flt3. Flt3 ulega ekspresji na wczesnych progeniturach
komórek krwi i jest istotne w powstawaniu progenitorów limfocytów B. Pax5 bezpośrednio
hamuje ekspresję Flt3 wiążąc dwa miejsca w regionie promotorowym kodującego go genu.
Zwiększona ekspresja Flt3 skutkuje obniżoną produkcją limfocytów B, podczas gdy różnico-
wanie tymocytów i komórek mieloidalnych jest prawidłowe. Delecja genu Pax5 w dojrzałych
limfocytach B prowadzi do przedwczesnej ekspresji genów, kodujących białka zaangażowane
w różnicowanie i funkcję komórek plazmatycznych. Jednym z takich genów jest Blimp1 (B
lymphocyte-induced maturation protein 1), który jest niezbędny w regulacji rozwoju komó-
rek plazmatycznych. Od czasu gdy stwierdzono, że Blimp1 bezpośrednio hamuje ekspresję
Pax5 zaproponowano antagonistyczne działanie tych białek. Jednak ostatnie eksperymenty
pokazujące, że ekspresja genów Flt3, Cd79a i Blnk zmniejsza się zanim dojdzie do ekspresji
Blimp1, sugerują, że interakcja Blimp1 i Pax5 jest bardziej skomplikowana niż przypuszczano.
Brak aktywności Pax5 w póz
nych etapach rozwoju limfocytów B nie jest wynikiem ani obni-
żonej ilości białka, ani (przynajmniej w przypadku Flt3 ) przez inny sposób wiązania do se-
kwencji regulatorowych w tych genach. Prawdopodobnie istnieje inny mechanizm modyfiku-
jący Pax5, który prowadzi do jego supresji. Pax5 aktywuje ekspresję białek kompleksu recep-
tora pre-BCR (ryc. 4.4). Można do nich zaliczyć geny kodujące: cząsteczkę powierzchniową
CD19, kinazę tyrozynową Blnk, białko Igą, jak również geny kodujące zastępczy łańcuch lekki:
5 i VpreB. Aktywuje poza tym rekombinację genów VDJ w locus Igh. Pax5 wpływa pozytyw-
nie na ekspresjÄ™ genu Ig8
, poprzez aktywację ekspresji czynników Irf4 i Irf8 (Interferon Regu-
178
Rozdział 4. Lmfocyty B
latory Factor) niezbędnych w rekombinacji Ig8
. Z drugiej strony Pax5 może hamować ekspre-
sjÄ™ Ig8
w wyniku represji sekwencji wzmacniającej na końcu 3 genu Ig8
. Poza tym Pax5 rów-
nież aktywuje ekspresję czynnika Aiolos, który następnie hamuje ekspresję genu kodującego
łańcuch zastępczy receptora pre-BCR - 5, powodując, że limfocyt B kończy stadium pre-B.
Ryc. 4.4. Regulacja ekspresji składowych kompleksu pre-BCR przez Pax5 /Kolorem czerwonym
zaznaczono białka, będące pod kontrolą Pax5./
(z
ródło: : Holmes LM Immunology and Cell Biology 2008)
4.1.3. Rearanżacja genów immunoglobulinowych kieruje rozwojem limfocytów B
Na ryc. 4.5 przedstawiono etapy rozwoju limfocytów B, podczas których dochodzi do re-
aranżacji genów immunoglubulinowych.
179
Monika Ryba
Ryc. 4.5. Etapy rozwoju limfocytów B
(z
ródło: Janeway CA Immunobiology 2005)
Podczas rozwoju w szpiku kostnym przeżywają tylko te limfocyty B, które prawidłowo
zrearanżują geny dla łańcuchów ciężkich i lekkich immunoglobulin. Ponieważ każdy gen ko-
dujący immunoglobulinę występuje w postaci dwóch alleli, z których każdy może ulec re-
aranżacji, komórka nie może dopuścić do przegrupowań DNA obu genów, gdyż wtedy do-
szłoby do ekspresji dwóch różnych antygenowo specyficznych receptorów. Jest to realizo-
wane przez sprawdzanie czy allel danego genu uległ prawidłowej rearanżacji. Gdy dojdzie do
wytworzenia produktywnego złącza, geny na chromosomie homologicznym zostają zablo-
kowane, a komórka wchodzi w następny etap rozwoju. Zjawisko to nazywamy wyłączeniem
allelicznym (allelic exclusion). Geny łańcuchów immunoglobulinowych chromosomu homolo-
gicznego ulegają rearanżacji tylko wtedy, jeśli rekombinacja w pierwszym chromosomie z
jakiś powodów nie powiodła się. Zestaw segmentów genowych, na podstawie którego zo-
stanie wyprodukowany kompletny receptor, wymaga trzech rekombinacji, które występują
na różnych etapach rozwoju limfocytów B. Są to (w kolejności, w której występują):
(1)rekombinacyjne łączenie genów D z JH, (2) a następnie VH z DJH (produkcja funkcjonalnego
łańcucha ciężkiego) i (3) rekombinacyjne łączenie genów VL z JL (produkcja funkcjonalnego
łańcucha lekkiego). Rekombinacyjne łączenie segmentów genowych zachodzi z udziałem
białek RAG.
JeÅ›li chodzi o Å‚aÅ„cuch lekki (kodujÄ… go dwa geny º i ), to zawsze jako pierwsze rearanża-
cji ulegajÄ… geny w locus º. Geny w locus  bÄ™dÄ… zrearanżowane dopiero wtedy, gdy rearanża-
cja genów º na obu chromosomach nie powiedzie siÄ™. Ponieważ tylko jeden na trzy zÅ‚Ä…cza
ulega prawidłowej rearanżacji, a do ekspresji kompletnej immunoglobuliny potrzebne są trzy
funkcjonalne złącza, bardzo duża liczba rozwijających się limfocytów B jest tracona, ponie-
waż nie są one w stanie przeprowadzić prawidłowej rearanżacji na którymś z tych trzech
etapów. Na ryc. 4.6 przedstawiono kolejność rearanżacji genów immunoglobulinowych i
etapy, podczas których utworzenie niefunkcjonalnego złącza prowadzi do śmierci komórki.
180
Rozdział 4. Lmfocyty B
Ryc. 4.6. Etapy rearanżacji genów Ig podczas których limfocyty B mogą ulegać delecji
(z
ródło: Janeway CA Immunobiology 2005)
Rearanżacja genów dla łańcucha ciężkiego rozpoczyna się w we wczesnej komórce pro-B
i polega na rekombinacyjnym łączeniu genów D z genami JH. Przeważnie dotyczy to dwóch
alleli w locus Igh. Wtedy komórka staje się póz
ną pro-B i kontynuuje dalszą rearanżację ge-
nów dla łańcucha ciężkiego, polegającą na rekombinacyjnym łączeniu genu VH z powstałą już
sekwencją DJH. Większość połączeń D z JH tworzy funkcjonalne złącza , gdyż zmiana ramki
odczytu (każda sekwencja nukleotydów może być odczytana w jednej z trzech ramek odczy-
tu), podczas translacji każdego z genów D nie powoduje wcześniejszego pojawienia się ko-
donu nonsensownego. Na tym etapie mechanizm sprawdzający funkcjonalność złącza DJH nie
jest potrzebny. Dodatkowo rearanżacja obejmuje allele na obydwu chromosomach homolo-
gicznych. W przypadku ewentualnych pomyłek w rearanżacji na póz
niejszych etapach, ko-
mórka ma dwa funkcjonalne złącza DJH. A
ączenie genów VH z segmentem DJH następuje naj-
pierw na jednym z dwóch homologicznych chromosomów. Jeśli rearanżacja się powiedzie
dochodzi do natychmiastowej produkcji Å‚aÅ„cucha µ, po której dalszy proces rearanżacji ge-
nów VH z DJH zatrzymuje się i limfocyt staje się komórką pre-B. Jednak, przeważnie w dwóch
na trzy przypadki pierwsza rearanżacja daje nieprawidłowe złącze i wtedy łączenie genów VH
z DJH jest kontynuowane na drugim chromosomie homologicznym. Komórki pro-B, w których
dojdzie do utworzenia niefunkcjonalnych genów VDJ są eliminowane. Na tym etapie znaczna
część, bo aż 45% komórek pro-B, jest tracona. Duża komórka pre-B, w której doszło do pra-
widłowej rearanżacji genów dla łańcucha ciężkiego zaczyna się dzielić. Jednak zaraz przed
wejściem w cykl podziałowy na powierzchni komórki pre-B przejściowej ekspresji ulega
pierwotny receptor pre-B, który zapewnia komórce pierwszy sygnał do rozpoczęcia prolifera-
cji. Komórki z nieprawidłowo zrearanżowanym genem dla łańcucha ciężkiego nie tworzą re-
ceptora pre-B, a więc nie otrzymują sygnału do proliferacji i są eliminowane.
Receptor pre-B, jak już wiemy, skÅ‚ada siÄ™ z Å‚aÅ„cucha ciężkiego µ i dwóch biaÅ‚ek, które
tworzą zastępczy łańcuch lekki. Pierwsze białko to 5, przypomina część stałą (C) łańcucha
lekkiego , a drugie VpreB przypomina część zmienną (V) łańcucha lekkiego ale ma dodatko-
wy region aminokwasowy. Sygnalizacja z receptora pre-BCR jest możliwa dzięki związanymi z
181
Monika Ryba
nim biaÅ‚kami IgÄ… i Ig². Razem tworzÄ… one kompleks receptora pre-BCR, który strukturalnie
przypomina dojrzały receptor limfocytu B (ryc. 4.7).
Ryc. 4.7. Rearanżacja genów i ekspresja immunoglobulin w rozwijającym się limfocycie B
(z
ródło: Janeway CA Immunobiology 2005)
Po prawidłowej rearanżacji genów w locus Igh, rozpoczyna się rearanżacja genów dla
łańcucha lekkiego (najpierw przeważnie w locus 8
). W przeciwieństwie do genów w locus h,
geny VL i JL w przypadku pierwszej nieproduktywnej rearanżacji mają możliwość podjęcia
kilku kolejnych prób rekombinacyjnego łączenia segmentów genowych na tym samym chro-
mosomie, zanim proces ten przeniesie się na drugi chromosom homologiczny. Np. jeśli
pierwsza rearanżacja genów w locus 8
jest nieprawidłowa, wtedy koniec 5 genu V8
może
rekombinować z końcem 3 genu J8
prowadząc do usunięcia nieprawidłowej sekwencji (ryc.
4.8). U ludzi występuje 5 funkcjonalnych genów J8
, więc mechanizm ten może powtarzać się
do pięciu razy na każdym z chromosomów homologicznych. Jeśli wszystkie rearanżacje ge-
182
Rozdział 4. Lmfocyty B
nów w obrębie locus 8
nie wyprodukują funkcjonalnego złącza dla łańcucha lekkiego wtedy
rozpocznie się rearanżacja genów w locus .
Ryc. 4.8. Powtórna rearanżacja genów dla łańcucha lekkiego immunoglobuliny
(z
ródło: Janeway CA Immunobiology 2005)
Zarówno rearanżacja genów immunoglobulinowych jak i genów receptorów TCR jest za-
leżna od białek RAG1 i RAG2. Heterodimer RAG1:RAG2 jest składową rekombinazy V(D)J,
która jest aktywna we wczesnych etapach rozwoju limfocytów. Zarówno w limfocytach B i T,
po udanej rearanżacji genów w locus Igh (limfocyt B) i w locus ² (limfocyt T), dochodzi do
tymczasowego hamowania ekspresji genów RAG, tak, że białka te nie są aktywne podczas
proliferacji komórek. Potem podczas rearanżacji genów w locus Igl (limfocyt B) i ą (limfocyt
T) białka RAG ulegają ponownej syntezie.
Inny enzym, transferaza nukleotydów terminalnych (TdT), również przyczynia się do
różnorodności w obrębie receptorów BCR i TCR. Funkcją tego enzymu jest dodawanie poje-
dynczych nukleotydów do powstałych podczas rekombinacji złącz. Enzym ten nie jest jednak
niezbędny w procesie rearanżacji. W życiu płodowym, gdy powstają pierwsze limfocyty T i B,
TdT, jeśli w ogóle, ulega ekspresji na bardzo niskim poziomie. W życiu dorosłym, ekspresję
tego enzymu stwierdza się w komórkach pro-B, po czym w komórkach pre-B ekspresja TdT
spada. Dzieje się to na etapie gdy rearanżacja genów w locus Igh już się kończy, natomiast
rozpoczyna się rearanżacja w locus Igl.
Cząsteczki biorące udział w przekazywaniu sygnału z receptora BCR ulegają ekspresji w
limfocytach B począwszy od komórki pro-B. Ich ekspresja kończy się albo gdy komórka umie-
ra, albo gdy ulega terminalnemu różnicowaniu w komórki plazmatyczne.
Jak już wspomniano rekombinaza V(D)J jest kompleksem działającym zarówno w limfo-
cytach B jak i limfocytach T i używa tych samych enzymów. Rearanżacje genów TCR nie wy-
183
Monika Ryba
stępują w limfocytach B i odwrotnie, rearanżacje genów Ig nie mają miejsca w limfocytach T.
Jest to związane ze zbyt niską aktywnością transkrypcyjną genów, które mają być połączone.
Ryc. 4.9. Regulacja ekspresji genów immunoglobulinowych
(z
ródło: Janeway CA Immunobiology 2005)
Dzieje się tak prawdopodobnie dlatego, że kluczowe dla rozwoju limfocytów T i B, czyn-
niki transkrypcyjne wiążą się z DNA umożliwiając białkom rekombinazy dostęp do chromaty-
ny. Przedstawia to ryc. 4.9. W DNA linii zarodkowej, komórek macierzystych i nielimfoidal-
nych komórek organizmu chromatyna zawierająca geny kodujące immunoglobuliny jest w
formie nieaktywnej. We wczesnym stadium pro-B, specyficzne dla tych komórek białka wiążą
się z elementami enhancera (e). W locus Igh elementy enhancera występują w intronie J-C i
184
Rozdział 4. Lmfocyty B
na końcu 3 od egzonów kodujących część stałą  C (ryc. 4.9a). Chromatyna jest teraz w
otwartej konformacji i może dojść do inicjacji transkrypcji z promotorów leżących powyżej
segmentów genowych D i J. Transkrypcja tych genów początkowo odbywa się na niskim po-
ziomie (ryc. 4.9b). A
ączenie genów D z J, które dalej następuje wzmaga transkrypcję z promo-
torów powyżej segmentów genowych D. Zaraz potem dochodzi do inicjacji transkrypcji z
promotora genu V (ryc. 4.9c). Rearanżacja genu V prowadzi do przejścia jego promotora pod
kontrolę enhancerów dla łańcucha ciężkiego IgM (ryc. 4.9d), co dalej wzmaga produkcję
mRNA dla Å‚aÅ„cucha ciężkiego µ.
4.1.4. Kontrola rozwoju limfocytów B na obwodzie
Wykazano, że wiele czynników transkrypcyjnych (ryc. 4.11) odgrywa ważną rolę bądz
to
w różnicowaniu, bądz
w funkcjonowaniu specyficznych subpopulacji limfocytów B na obwo-
dzie: przejściowych limfocytów B w śledzionie (trasitional B cells), limfocytów B strefy brzeż-
nej śledziony i limfocytów B tworzących ośrodki rozmnażania w grudkach chłonnych (ryc.
4.10).
Ryc. 4.10. Kontrola rozwoju i funkcji limfocytów B na obwodzie
(z
ródło: Matthias P Nature Reviews Immunology 2005)
Białka OCT i ich koaktywator OBF1
Konserwowany motyw oktamerowy ATGCAAAT jest związany z transkrypcją genów im-
munoglobulinowych specyficzną dla limfocytów B. Czynniki transkrypcyjne OCT1 i OCT2
(Octamer binding transcription factor) są białkami zawierającymi domenę POU, które wiążą
konserwowanÄ… sekwencjÄ™ oktamerowÄ…. TworzÄ… one kompleks z koaktywatorem OBF1. OCT2
i OBF1 są białkami specyficznie występującymi w limfocytach B, chociaż przejściową ekspre-
sję OBF1 stwierdza się również w limfocytach T, po ich aktywacji. W limfocytach B największy
poziom OBF1 wykryto w limfocytach B ośrodka rozmnażania grudki chłonnej. OCT2 i OBF1
185
Monika Ryba
nie są ściśle związane z transkrypcją genów dla immunoglobulin, ale odgrywają inne ważne
funkcje w limfocytach B. Myszy z deficytem OBF1 charakteryzuje normalny przebieg wcze-
snych etapów dojrzewania limfocytów B, ale liczba obwodowych i krążących limfocytów B
jest obniżona. Najbardziej charakterystyczną cechą fenotypową takich myszy jest zaburzona
odpowiedz
zależna od limfocytów T, której towarzyszy brak ośrodków rozmnażania w grud-
kach chłonnych. Niezbędną rolę OBF1 w tworzeniu ośrodków rozmnażania wykazano rów-
nież u myszy z jednoczesnym niedoborem OBF1 i Aiolos. Podczas gdy myszy z niedoborem
tylko czynnika Aiolos tworzą ośrodki rozmnażania, myszy z podwójnym deficytem nie są do
tego zdolne. OBF1 odgrywa również ważną rolę w przechodzeniu limfocytów B ze szpiku
kostnego do śledziony.
OCT2 jest wymagane do proliferacji limfocytów B po stymulacji antygenami grasiczonie-
zależnymi w warunkach in vitro, jak również w utrzymaniu populacji limfocytów B w jamie
otrzewnej. Limfocyty B od myszy Oct1-/- charakteryzujÄ… siÄ™ normalnym rozwojem, co wskazu-
je, że białko to nie jest niezbędne w tym procesie.
NFºB i zwiÄ…zane z nim biaÅ‚ka
Limfocyty B z delecjÄ… genu kodujÄ…cego podjednostkÄ™ NFºB - p50 (NFºB1) nie proliferujÄ…
w odpowiedzi na LPS w warunkach in vitro. Poza tym myszy z niedoborem tego genu nie
produkują limfocytów B strefy brzeżnej śledziony (marginalne limfocyty B). Wykazano, że
takie geny jak Bcl-xi Bfl1 sÄ… bezpoÅ›rednim celem czynnika NFºB w marginalnych limfocytach
B. Myszy z delecją genu kodującego białko REL-A mają zredukowaną liczbę marginalnych
limfocytów B, a myszy z delecją genu kodującego REL-B nie tworzą ośrodków rozmnażania i
folikularnych komórek dendrytycznych w strefie brzeżnej śledziony. REL-B jest również wy-
magane do zasiedlania strefy brzeżnej śledziony przez makrofagi i limfocyty B. Poza tym u
myszy z delecjÄ… genu kodujÄ…cego zarówno p50 jak i p52 (NFºB2) rozwój limfocytów B zostaje
zablokowany na etapie przejÅ›cia ze szpiku do Å›ledziony. Tak wiÄ™c aktywacja przez NFºB ma
istotne znaczenie w przejściu limfocytów B ze stanu niedojrzałego w dojrzały (ryc. 4.10).
Ryc. 4.11. Czynniki transkrypcyjne odgrywające rolę w póz
nym rozwoju limfocytów B
(z
ródło: Matthias P Nature Reviews Immunology 2005)
186
Rozdział 4. Lmfocyty B
Inne czynniki transkrypcyjne: Aiolos, RBP-Jº i Notch
Jak już wspomniano, ekspresja Aiolos pojawia się już we wczesnych stadiach dojrzewa-
nia limfocytów B. Póz
niej, na etapie dojrzałych i krążących limfocytów B, ekspresja tego biał-
ka zwiększa się. U myszy Aiolos-/- wczesny rozwój limfocytów B przebiega prawidłowo, jednak
dojrzałe komórki mają obniżony próg aktywacji w odpowiedzi na stymulację BCR. Obserwuje
się również spontaniczne tworzenie ośrodków rozmnażania. W dodatku starzejące się myszy
Aiolos-/- produkują autoprzeciwciała i mają objawy tocznia układowego. Brak białka Aiolos
hamuje również rozwój marginalnych limfocytów B, co pokrywa się z założeniem, że siła sy-
gnału z receptora BCR reguluje wejście limfocytów B do strefy brzeżnej.
Notch1 jak wiadomo jest czynnikiem transkrypcyjnym niezbędnym do różnicowania w
linię limfocytów T (Rozdział 3). Delecja Notch1 prowadzi do indukcji rozwoju limfocytów B w
grasicy. Przeciwnie, w śledzionie białko Notch2 jest niezbędne do wejścia limfocytów B do
strefy brzeżnej lub zasiedlenia grudek chłonnych. Myszy, których limfocyty B, nie mają białka
potrzebnego do transkrypcji Notch - RBP-Jº, nie produkujÄ… marginalnych limfocytów B. Od-
wrotnie, myszy, których limfocyty B nie mają supresora białka Notch  MINT (MSH home-
obox homologue 2 (MSX2)-interacting nuclear target) produkują trzykrotnie większe ilości
marginalnych limfocytów B.
4.2. Rozpoznanie antygenu i aktywacja komórki
4.2.1. Receptor BCR
Receptor limfocytów B (BCR), w przeciwieństwie do TCR, wiąże się bezpośrednio z anty-
genami w formie natywnej (białka, lipidy, węglowodany). Receptorami BCR nazywamy im-
munoglobuliny (przeciwciała) wbudowane w błonę limfocytu B, które mają identyczne z
wolnymi immunoglobulinami części zmienne, a więc tą samą swoistość. Forma wydzielnicza i
śródbłonowa przeciwciała różnią się zakończeniem części stałej łańcucha ciężkiego. W przy-
padku receptora, część tą stanowi hydrofobowa sekwencja wbudowana w błonę komórki,
natomiast forma wydzielnicza posiada w tym miejscu sekwencję hydrofilową, która pozwala
na wydzielenie cząsteczki na zewnątrz. Immunoglobuliny są zbudowane z czterech łańcu-
chów polipeptydowych: dwóch łańcuchów ciężkich (H-heavy) i dwóch łańcuchów lekkich (L-
light), połączonych wiązaniami dwusiarczkowymi (ryc. 4.12a).
Ryc. 4.12. Budowa immunoglobuliny
(z
ródło: Janeway CA Immunobiology 2005)
187
Monika Ryba
W zależności od różnic w budowie łańcuchów ciężkich immunoglobuliny można podzie-
lić na 5 klas: IgA (Å‚aÅ„cuch ciężki Ä…), IgG (Å‚), IgE (µ), IgD (´) i IgM (µ). Dana czÄ…steczka Ig zawie-
ra zawsze dwa tego samego rodzaju łańcuchy ciężkie. A
ańcuchy lekkie mogą występować w 2
odmianach: kappa (º) i lambda (). W czÄ…steczce immunoglobuliny oba Å‚aÅ„cuchy lekkie sÄ…
zawsze tej samej odmiany, a dana odmiana może wiązać się z każdym z rodzajów łańcuchów
ciężkich. W łańcuchach lekkich i ciężkich przeciwciała można wyróżnić części zmienne (V)
leżące w odcinku N-końcowym i części stałe (C) obejmujące koniec karboksylowy (ryc.
4.12b). W wyniku trawienia papainÄ… czÄ…steczka Ig rozpada siÄ™ na dwa identyczne fragmenty
Fab i jeden fragment Fc (ryc. 4.12c). Fragment Fab obejmuje całą część zmienną i fragment
części stałej (cały łańcuch L i część łańcucha H)  zawiera miejsca wiążące antygen. Fragment
Fc tworzony jest jedynie przez część stałą (część łańcucha H) i zawiera domeny wiążące Ig z
receptorami na komórkach, a także domeny odpowiedzialne za aktywowanie układu dopeł-
niacza. W obrębie części zmiennych obu łańcuchów występują po 3 regiony hiperzmienne
CDR (complementarity-determining region), które są zaangażowane w wiązanie antygenu
(ryc. 4.13).
Ryc. 4.13. Regiony hiperzmienne przeciwciała
(z
ródło: Alberts B Molecular Biology of the Cell 2002)
Regiony hiperzmienne tworzą miejsce wiązania antygenu zwane paratopem. Po każdej
stronie regionu hiperzmiennego znajdują się regiony zrębowe. W sumie każdy łańcuch w
obrębie części zmiennej ma 4 regiony zrębowe.
Immunoglobuliny tylko na limfocytach B są wbudowane w błonę i występują jako recep-
tory wiążące antygen. Receptor BCR odgrywa dwie powiązane ze sobą funkcje. Po pierwsze,
przekazuje sygnał aktywujący do wnętrza komórki, który inicjuje kaskadę sygnalizacyjną
prowadzącą do transkrypcji genów związanych z aktywacją limfocytów B. Bardzo często sa-
ma sygnalizacja przez receptor BCR nie wystarcza do pełnej aktywacji, dlatego odpowiedz

limfocytów B na większość antygenów wymaga pomocy ze strony limfocytu Th. Drugą ważną
funkcją receptora BCR jest pochłonięcie antygenu, który następnie ulega przetworzeniu i w
formie peptydów jest prezentowany w kontekście MHC klasy II. Sygnalizacja BCR jest nie-
zbędna do szybkiego i prawidłowego transportu antygenu do przedziału komórkowego za-
wierającego cząsteczki MHC klasy II. W przypadku defektów w transdukcji sygnału z recepto-
ra BCR, albo nie dochodzi do przetworzenia antygenu, albo tempo jego transportu jest
znacznie obniżone. Z kolei internalizacja receptora BCR może odgrywać ważną rolę w regula-
188
Rozdział 4. Lmfocyty B
cji ścieżki sygnalizacyjnej właśnie poprzez usunięcie z powierzchni komórki już raz zaktywo-
wanego receptora.
4.2.1.1. Sygnalizacja
Sygnalizacja przez receptor BCR jest możliwa dziÄ™ki zwiÄ…zanym z nim biaÅ‚kom  IgÄ… i Ig²,
które w domenie cytoplazmatycznej zawierają motyw ITAM. Na jeden BCR przypada jedna
czÄ…steczka immunoglobuliny oraz jeden kompleks biaÅ‚ek IgÄ…/Ig². BCR w bÅ‚onie komórkowej
może występować jako dimer lub multimer. Po związaniu antygenu, tyrozyny w obrębie mo-
tywów ITAM zostają ufosforylowane przez kinazę z rodziny Src  Lyn. Fosforylacja tyrozyn
przez Lyn zapewnia miejsce wiÄ…zania dla kolejnych kinaz  Syk i Btk. Btk razem z Syk fosfory-
lują kinazę białkową C ł2 (PLCł2). Dochodzi również do aktywacji kinazy 3-
fosfatydyloinozytolu (PI-3K). PLCł2 i PI-3K są enzymami niezbędnymi do produkcji przekaz
ni-
ków drugiego rzędu. PI3K fosforyluje dwufosforan fosfatydyloinozytolu (PIP2) do trójfosfora-
nu (PIP3), który następnie przyciąga do błony komórkowej inne cząsteczki sygnalizacyjne.
PLCł2 używając tego samego substratu co PI3K powadzi do wytworzenia trójfosforanu inozy-
tolu, (IP3), który dostaje się do cytoplazmy i otwiera wewnątrzkomórkowe kanały wapniowe
uwalniając jony Ca2+, oraz diacyloglicerolu (DAG), który aktywuje białkową kinazę C (PKC).
Następnie wyrzut jonów Ca2+ i PKC aktywują kinazy z rodziny MAP  Erk, Jnk i p38 MAPK
oraz czynniki transkrypcyjne NF8
B (poprzez aktywacjÄ™ kinazy Ikk) oraz NFAT (ryc. 4.14).
189
Monika Ryba
Ryc. 4.14. Sygnalizacja przez receptor BCR
(z
ródło: Niiro H Nature Reviews Immunology 2002)
W sygnalizacji bardzo istotne są również nieenzymatyczne białka adaptorowe. Wśród
nich, białko BLNK (B cell Linker) pośredniczy w wiązaniu kinazy Syk i Blk z PLCł2. Uszkodzenie
genu BLNK prowadzi do zaburzeń w aktywacji PLCł2. BLNK również wiąże się z białkami Vav,
które regulują organizację cytoszkieletu w limfocytach B. Innym białkiem adaptorowym regu-
lującym aktywność PLCł2 jest białko BAM32 (B-lymphocyte adapter molekule of 32 kDa).
Wysoką ekspresję BAM32 stwierdza się w limfocytach B ośrodków rozmnażania, podczas gdy
inne białka adaptorowe takie jak np. GRPL nie ulegają ekspresji w tych komórkach sugerując,
że selektywna ekspresja białek adaptorowych na różnych etapach różnicowania limfocytów
B może wpływać na proces sygnalizacji, a przez to też na przyszły los komórki. Uszkodzenie
genu BCAP (koduje białko adaptorowe dla PI3K) prowadzi do zaburzeń w aktywacji PI3K, jak
również kinazy serynowo-treoninowej Akt. Cząsteczka CD19, która jest specyficznym marke-
rem i koreceptorem limfocytów B może też pełnić funkcje adaptorowe dla PI3K.
Do negatywnych regulatorów sygnalizacji przez receptor BCR należą koreceptory takie
jak PIRB (paired immunoglobulin-like receptor B) oraz receptor FcłRIIB (ryc. 4.14). W części
cytoplazmatycznej zawierają one motywy ITIM, które po związaniu i ufosforylowaniu przez
fosfatazy SHP1 i SHIP przewodzą sygnał prowadzący do hamowania sygnalizacji. Cząsteczka
CD22 będąca również koreceptorem może przekazywać albo sygnał aktywujący albo hamu-
190
Rozdział 4. Lmfocyty B
jący limfocyt B. Związanie białka adaptorowego Grb2 z CD22 prowadzi do aktywacji kinaz
MAP, natomiast zwiÄ…zanie SHP1 z cytoplazmatycznym motywem ITIM czÄ…steczki CD22 pro-
wadzi do hamowania sygnalizacji.
W wyniku połączenia z antygenem receptor BCR ulega translokacji do przedziałów ko-
mórkowych znanych jako tratwy lipidowe. W limfocytach B kinazy z rodziny Src np. Lyn gro-
madzą się w tratwach. Zaproponowano, że tratwy lipidowe są przedziałem niezbędnym do
przewodzenia sygnału z receptora BCR. Wiele cząsteczek sygnalizacyjnych włączając PI3K czy
PLCł2 ulega translokacji do tratw lipidowych po stymulacji BCR. W komórkach pre-B te czą-
steczki przebywają w tratwach przez cały czas co może prowadzić do podstawowej, niezależ-
nej od antygenu sygnalizacji przez receptor pre-BCR, która wystarcza do proliferacji i różni-
cowania z komórek pre-B w niedojrzałe limfocyty B. Tak więc cząsteczki biorące udział w sy-
gnalizacji z receptora BCR mogą w tratwach lipidowych tworzyć kompleksy, które można
odnieść do  sygnałosomów . Otwartym pozostaje pytanie w jaki sposób dochodzi do interna-
lizacji receptora BCR po aktywacji. Nie wiadomo, czy jest to proces zależny od klatryny czy
może od ścieżki, w którą zaangażowana jest ubikwityna. Wiadomo, że w proces internalizacji
BCR zaangażowane są białkowe kinazy tyrozynowe (PTK), o czym świadczą zaburzenia proce-
su internalizacji w limfocytach B z delecją genów kodujących kinazy Lyn i Syk. Z kolei dowie-
dziono, że proces internalizacji BCR nie wymaga ani PLCł2, ani PI3K.
4.2.1.2. Przeżycie komórki i proliferacja
Sygnalizacja z receptora BCR może prowadzić do indukcji ścieżek niezbędnych dla prze-
życia i proliferacji limfocytów B. Można tu zaliczyć ścieżki PI3K, RAS-RAF-Erk oraz NF8
B (ryc.
4.15).
4.2.1.2.1. Ścieżka PI3K
Kinaza- 3- fosfatydyloinozytolu jest głównym kandydatem na czynnik indukujący przeży-
cie limfocytów B. Traktowanie limfocytów B inhibitorami tego enzymu skutkuje śmiercią ko-
mórek indukowaną przez BCR. Z innych cząsteczek indukowanych po aktywacji PI3K na
szczególną uwagę zasługuje Akt. U myszy z delecją genu kodującego podjednostkę PI3K -
p110´, aktywacja Akt w limfocytach B jest znacznie zaburzona. Generalnie, funkcjÄ… Akt jest
fosforylacja białek zaangażowanych w przeżycie komórki, w tym czynników regulujących
apoptozę i metabolizm glikogenu. Akt nie tylko chroni przed śmiercią indukowaną przez BCR,
ale także promuje przeżycie limfocytu B w stanie spoczynku. Jedną z funkcji Akt jest hamo-
wanie aktywacji proapoptotycznego białka z rodziny białek BCL-2  BAD (BCL2-antagonist of
cell death). Akt fosforyluje i hamuje kinazę GSK3 (Glycogen Synthase Kinase 3). W komórkach
niestymulowanych kinaza GSK3 jest ciągle aktywna, fosforyluje i destabilizuje białko MYC i
cyklinę D, które są niezbędne w cyklu komórkowym. Tak więc funkcją Akt jest promowanie
proliferacji i przeżycia limfocytów B.
191
Monika Ryba
4.2.1.2.2. Ścieżka RAS-RAF-Erk
Mimo, że Erk w innych komórkach jest zaangażowane w procesy prowadzące do przeży-
cia, jego rola w niedojrzałych limfocytach B jest niejasna. Inhibicja białka Erk nie wpływa na
indukowaną przez BCR śmierć niedojrzałych limfocytów B, jednak ta sama inhibicja blokuje
indukowaną przez BCR proliferację dojrzałych limfocytów B. Ścieżka RAF1-Erk jest zaangażo-
wana w zależną od BCR indukcję ekspresji cykliny D. Poza tym RAF może działać niezależnie
od Erk ulegając translokacji do mitochondrium i hamując bezpośrednio występujące tam
czynniki proapoptotyczne.
Ryc. 4.15. Indukowana przez BCR apoptoza, przeżycie i proliferacja komórki
(z
ródło: Niiro H Nature Reviews Immunology 2002)
4.2.1.2.3. Ścieżka NF8
B
Apoptoza limfocytów B u myszy z delecją genu dla inhibitora kinazy NF8
B (IKKÄ… i IKK²)
znacznie wzrasta. Aktywacja PLCÅ‚2 jest absolutnie konieczna do indukowanej przez BCR sty-
mulacji NF8
B, poza tym jakiekolwiek zaburzenia w regulacji aktywacji PLCł2 prowadzić będą
do zakłóceń w aktywacji NF8
B. I rzeczywiście, indukowana przez BCR aktywacja NF8
B jest
blokowana w limfocytach B z delecją genów kodujących BTK, BLNK i BAM32. Wyrzut jonów
Ca2+ pod wpływem PLCł2, jak również indukcja białkowej kinazy C wymagają aktywności
NFºB, co pokazuje, że indukcja zależnych od Ca2+ izoform kinazy PKC może regulować akty-
192
Rozdział 4. Lmfocyty B
wacjÄ™ NFºB. Rodzina kinaz biaÅ‚kowych C jest podzielona na cztery podgrupy: tradycyjne PKC
(Ä…, ²I/²II i Å‚), które wymagajÄ… zarówno Ca2+ jak i DAG; nowe PKC (´, µ, ·, i ¸), które wymaga-
ją tylko DAG; nietypowe PKC (ś i ), które wymagają albo Ca2+ albo DAG oraz ostatnia pod-
grupa PKCµ (PKD u myszy), która zachowuje siÄ™ caÅ‚kiem inaczej niż inne kinazy PKC. W limfo-
cytach T do aktywacji NFºB potrzebna jest kinaza PKC¸. Nie wystÄ™puje ona jednak w wiÄ™k-
szości limfocytów B. Wskazuje się na udział tradycyjnych kinaz PKC w indukowanej przez BCR
aktywacji NFºB. Rodzina czynników transkrypcyjnych NFºB skÅ‚ada siÄ™ z heterodimerów lub
homodimerów utworzonych przez podjednostki: NFºB1(p50), NFºB2 (p52), c-REL, RELA (p62)
i RELB. Różne pary tych podjednostek funkcjonują na różnych etapach rozwoju limfocytów B.
NFºB indukuje ekspresjÄ™ antyapoptotycznych biaÅ‚ek z rodziny BCL2 (np.BCL2, BCLXL i A1),
które hamują funkcje białek proapototycznych z rodziny BCL2 (np. BAX, BAD), chroniąc przez
to komórkÄ™ przed indukowanÄ… Å›mierciÄ… (ryc. 4.15). Innym genem regulowanym przez NFºB
w limfocytach B jest cyklina D. Jak już wspomniano, w limfocytach B zależna od Ca2+ kinaza
PKC² jest wymagana do indukowanej przez BCR aktywacji NFºB. Blokada kanałów Ca2+ caÅ‚-
kowicie hamuje indukowanÄ… przez BCR aktywacjÄ™ ekspresji cykliny D.
4.3. y
ródła różnorodności przeciwciał
4.3.1. Geny immunoglobulinowe
Tab. 4.2. Ludzkie geny immunoglobulinowe (z
ródło: Janeway CA Immunobiology 2005)
Liczba funkcjonalnych segmentów genowych
A
ańcuch Locus Chromosom V D J C
ciężki Igh 14 40 25 6 11
lekki 8
Ig8
2 40 0 5 1
lekki  Ig 22 30 0 4 4
Część zmienna łańcucha lekkiego jest kodowana przez dwa segmenty genowe V (varia-
ble) i J (joining), a łańcucha ciężkiego przez trzy segmenty genowe V, D (diversity) i J. Część
stała kodowana jest przez jeden segment genowy C (constant). Organizację locus dla łańcu-
chów ciężkiego i dwóch lekkich przedstawiono na ryc. 4.16. W odległości około 90pz w kie-
runku 5 od każdego z egzonów V znajduje się egzon L, kodujący sygnał inicjacji translacji
oraz peptyd sygnałowy, który umożliwia przejście immunoglobuliny przez retikulum endo-
plazma tyczne.
193
Monika Ryba
Ryc. 4.16. Organizacja loci genów immunoglobulinowych
(z
ródło: Janeway CA Immunobiology
W locus łańcucha lekkiego , za segmentami genowymi V leżą segmenty genowe J, z
których każdy jest połączony z genem dla części stałej C. W locus łańcucha lekkiego 8
za gru-
pą genów V leży grupa genów J i za nimi pojedynczy gen dla części stałej C. Locus łańcucha
ciężkiego przypomina locus 8
, z tym, że geny V od genów J oddzielone są grupą genów D.
Poza tym dla części stałej łańcucha ciężkiego występuje grupa genów C ułożona jeden po
drugim za genami J (ryc. 4.17).
Ryc. 4.17. Organizacja genów dla części stałej łańcucha ciężkiego immunoglobuliny
(z
ródło: Janeway CA Immunobiology 2005)
4.3.2. Rekombinacja genów V(D)J
Segmenty genowe V, D i J sÄ… oflankowane niekodujÄ…cymi sekwencjami DNA  RSS (Re-
combination Signal Sequence), które składają się z konserwowanych sekwencji hepta- i na-
nomerowych oddzielonych sekwencją DNA (wstawka) długości 12 lub 23 nukleotydów (ryc.
4.18).
194
Rozdział 4. Lmfocyty B
Ryc. 4.18. Sekwencja RSS
(z
ródło: Roth BD Nature Reviews Immunology 2003)
Sekwencje RSS są rozpoznawane przez kompleks rekombinazy V(D)J, na który składają
się specyficzne dla limfocytów T i B białka RAG-1 i RAG-2, razem z niespecyficznym białkiem
wiążącym DNA  HMG1 (High Mobility Group 1) lub HMG2.
Proces rekombinacji rozpoczynają białka RAG, które przecinają nić DNA dokładnie mię-
dzy RSS a sekwencją kodującą (ryc. 4.19a). Rekombinacja zachodzi zawsze między genami, z
których jeden zawiera sekwencję RSS z 12-nukleotydową wstawką, a drugi z 23-
nukleotydową wstawką. (ryc. 4.19b). W wyniku cięcia powstała wolna grupa 3 OH atakuje
przeciwległą nić prowadząc do podwójnego pęknięcia nici DNA i wytworzenia struktury szpil-
ki do włosów końca kodującego (ryc. 4.19c). Powstają 4 wolne końce DNA: dwa kodujące
(końce sekwencji genów, które mają się połączyć) i dwa sygnałowe (końce heptamerów se-
kwencji sygnałowych). Wolne końce DNA są utrzymywane razem przez białkowy kompleks,
w skład którego wchodzą białka RAG i inne białka związane z procesem naprawy DNA, takie
jak heterodimer Ku70:Ku80. Dwie sekwencje RSS łączą się tworząc złącze sygnałowe, nato-
miast zakończenia szpilkowe są likwidowane w wyniku nadrawienia jednej z nici. Przecięcie
szpilki może zachodzić w dowolnym miejscu, co przyczynia się do różnorodności sekwencji w
ewentualnym przyszłym złączu kodującym. Następnie po otwarciu struktury szpilki może
dojść do dołączenia lub usunięcia nukleotydów na złączu (ryc. 4.24). Na koniec ligaza IV DNA
łączy segmenty genowe tworząc złącze kodujące (ryc. 4.19d).
195
Monika Ryba
Ryc. 4.19 Etapy rekombinacji V(D)J
(z
ródło: Roth BD Nature Reviews Immunology 2003)
Struktura szpilki do włosów zostaje otwarta a póz
niej zamknięta w mechanizmie nieho-
mologicznego łączenia końców DNA (NHEJ). W mechanizmie tym biorą udział: białka Ku
(Ku70 i Ku80), DNA-zależna kinaza białek (DNA-PKcs), nukleaza Artemis i kompleks ligazy
DNA IV składający się z podjednostki katalitycznej i jej kofaktora XRCCR4. Mechanizm ten
przedstawia ryc. 4.20. U ludzi defekt w genie kodującym którykolwiek z wymienionych czyn-
ników prowadzi do niedoborów odporności (SCID, syndrom Omena), w wyniku zaburzonej
syntezy immunoglobulin i receptorów TCR. Niefunkcjonalny mechanizm NHEJ u tych pacjen-
tów prowadzi również do chorób związanych z defektami naprawy DNA.
Heterodimer Ku70:Ku80 związany z pękniętą nicią DNA (ryc. 4.20a) rekrutuje do tego
miejsca zależną od DNA kinazę białek (DNA-PKcs) (ryc. 4.20b). Ta interakcja prowadzi do
zmian w konformacji DNA-PKcs i wzbudza w niej aktywność kinazy. Holoenzym DNA-PK skła-
dający się z białek Ku i DNA-PKcs rekrutuje nukleazę Artemis, ligazę DNA IV/XRCCR4 oraz
polimerazę DNA (ryc. 4.20c). DNA-PKcs fosforyluje białko Artemis, które staje się aktywne i
otwiera strukturę szpilki do włosów. Polimeraza DNA wypełnia następnie przerwy, a XRCCR i
ligaza DNA IV łączą przecięte nici. Holoenzym DNA-PK odłącza się prawdopodobnie w wyniku
autofosforylacji przez DNA-PKcs (ryc. 4.20d).
Komórka w której doszło do pęknięcia podwójnej nici DNA nie może się dzielić gdyż mo-
głoby dojść do translokacji odcinków chromosomów i nieefektywnego połączenia sekwencji
kodujących. Po tym jak RAG1/RAG2 wprowadzą podwójne pęknięcie DNA w miejscu pomię-
dzy segmentem genowym a sekwencją RSS, do podwójnej przerwy przyłącza się kompleks
MRN, który składa się z białek MRE11 (meiotic recombination 11 homologue), RAD50 i NBS1
(Nijmegen breakage syndrome 1). Dochodzi do aktywacji kinazy białkowej ATM (Ataxia Te-
langiectasia Mutated), która fosforyluje szereg białek prowadząc do zatrzymania cyklu ko-
mórkowego (ryc. 4.21). Zapobiega to wejściu w fazę S cyklu i pozwala na naprawę powstałej
przerwy z wykorzystaniem mechanizmu NHEJ (ryc. 4.20). Ponadto aktywowany ATM może
wspomagać DNA-PKcs w aktywacji nukleazy Artemis przez jej dodatkową fosforylację. Dalej
196
Rozdział 4. Lmfocyty B
aktywna Artemis dokonuje otwarcia szpilki do włosów i proces jest kontynuowany tak jak to
opisano powyżej.
Ryc. 4.20. Mechanizm NHEJ
(z
ródło: Xu Y Nature Reviews Immunology 2006)
197
Monika Ryba
Ryc. 4.21. Odpowiedz
na podwójne uszkodzenie DNA podczas rearanżacji V(D)J
(z
ródło: Xu Y Nature Reviews Immunology 2006)
Geny VH i JH sÄ… oflankowane sekwencjami RSS zawierajÄ…cymi wstawki 23-nukleotydowe,
w związku z czym nie mogą się bezpośrednio ze sobą połączyć. Sekwencja RSS genu DH za-
wiera wstawkÄ™ 12-nukleotydowÄ… i dlatego zawsze najpierw dochodzi do rekombinacji po-
między genami D i JH, a dopiero póz
niej VH może połączyć się z genem DJH (ryc. 4.22).
Ryc. 4.22. Sekwencje RSS flankujące segmenty genowe łańcuchów lekkich i ciężkich
immunoglobulin (z
ródło: Janeway CA Immunobiology 2005)
198
Rozdział 4. Lmfocyty B
Ryc. 4.23. Rekombinacja przez wypętlenie (a) i inwersję (b)
(z
ródło: Janeway CA Immunobiology 2005)
Rekombinacja zachodzi najczęściej przez wypętlenie i delecję, prowadząc do powstania
kolistej cząsteczki DNA (ryc. 4.23a). Jeśli kierunki transkrypcji genów mających ulec połącze-
niu sÄ… przeciwne, wtedy dochodzi do rekombinacji przez inwersjÄ™ (ryc. 4.22b).
Powstałe zrekombinowane geny VJ i VDJ łączą się teraz z odpowiednim genem dla części
stałej C (ryc. 4.24).
199
Monika Ryba
Ryc. 4.24. Proces rekombinacji łańcucha ciężkiego i lekkiego immunoglobuliny
(z
ródło: Janeway CA Immunobiology 2005)
4.3.2.1. Regulacja aktywności białek RAG
Ekspresja białek RAG rozpoczyna się we wczesnych progenitorach limfoidalnych, które
dają początek prekursorom limfocytów B, T i komórek NK. Poziom ekspresji RAG jest wysoki
podczas wczesnego różnicowania limfocytów B i T (rearanżacja genów dla łańcucha ciężkiego
Ig lub ² TCR). Poziom transkryptów i biaÅ‚ka RAG gwaÅ‚townie spada podczas stadium pre-B i
pre-T (komórki wtedy proliferują). Następnie, po zakończeniu cyklu podziałowego komórki
pre-B i pre-T znów włączają ekspresję RAG, jest to okres rearanżacji genów dla łańcucha lek-
kiego immunoglobuliny i łańcucha ą receptora TCR. Ekspresja pełnego receptora BCR lub TCR
na powierzchni rozwijającego się limfocytu powoduje zahamowanie ekspresji białek RAG i
inaktywację rekombinazy. Jednak podczas selekcji negatywnej limfocytów B, w przypadku,
gdy receptor BCR jest autoreaktywny, może dojść do powtórnej rearanżacji genów dla łańcu-
cha lekkiego w mechanizmie zwanym edycjÄ… (redagowaniem) receptora. Wtedy ekspresja
białek RAG znów jest włączona. W wyniku tego procesu autoreaktywny łańcuch lekki może
zostać zastąpiony nowym, tworząc sprawny receptor BCR bez cech autoreaktywności. W
tymocytach ekspresja RAG zostaje wyłączona po przejściu przez te komórki etapu selekcji
pozytywnej w grasicy (ryc. 4.25).
200
Rozdział 4. Lmfocyty B
Ryc. 4.25. Aktywność rekombinazy V(D)J podczas rozwoju limfocytów
(z
ródło: Schlissel MS Nature Reviews Immunology 2003)
Ekspresja białek RAG jest regulowana zarówno na poziomie transkrypcji jak i potransla-
cyjnie na poziomie białka. W promotorach genów białek RAG zidentyfikowano miejsca wią-
zania różnych czynników transkrypcyjnych włączając PAX5, MYB, SP1, LEF1, NF-Y, C/EBP i
GATA3 (ryc. 4.26).
Ryc. 4.26. Locus genu Rag
(z
ródło: Schlissel MS Nature Reviews Immunology 2003)
Elementy leżące dystalnie od promotorów również są zaangażowane w regulację eks-
presji genów kodujących białka RAG. Zidentyfikowano przypuszczalne locus enhancera RAG
nazwane D3 w kierunku 5 od pierwszego egzonu RAG2 (ok. 8 kz). W obrębie tego elementu
występują miejsca wiązania takich czynników transkrypcyjnych jak E2A, MYB, RUNX1, C/EBP i
LYF1. Niedawno opisano nowy element enhancerowy  ERAB  w kierunku 5 od promotora
RAG2 (ok. 22 kz). Uszkodzenie tej sekwencji spowodowało częściową blokadę rozwoju w
kierunku limfocytów B, ale nie limfocytów T. W dodatku, okazało się, że w obrębie tej se-
kwencji mieszczą się miejsca wiązania czynników transkrypcyjnych z rodziny E2A. U człowie-
201
Monika Ryba
ka i myszy geny RAG leżą w regionie charakteryzującym się bardzo dużą homologią. W tym
regionie zidentyfikowano około 20 niekodujących sekwencji długości od 200 pz ze stopniem
homologii wynoszÄ…cym ponad 80%.
Na poziomie białka, ekspresja RAG jest hamowana przed wejściem komórki w cykl po-
działowy. Dzieje się to w fazie G0/G1 cyklu komórkowego. Fosforylacja białka RAG2 przez
kinazę zależną od cyklin prowadzi do jego degradacji. Ponieważ RAG1 tworzy kompleks z
RAG2, ten mechanizm prawdopodobnie prowadzi do rozpadu obu białek.
4.3.3. Zmienność na złączach
Ryc. 4.27. Zmienność na złączach
(z
ródło: Abbas AK Cellular and Molecular Immunology 2003)
202
Rozdział 4. Lmfocyty B
Do ogromnej różnorodności genów kodujących immunoglobuliny i TCR najbardziej przy-
czynia się usuwanie lub dodawanie nukleotydów pomiędzy segmentami genowymi V i D, D i J
lub V i J. Mechanizm ten, zwany zmiennością na złączach może odbywać się np. w wyniku
działania endonukleaz, które usuwają nukleotydy w DNA linii zarodkowej z końca sekwencji
segmentów genowych. Poza tym nowe nukleotydy, nie występujące w linii zarodkowej mogą
być dodawane na złączach. Segmenty genowe (np. V i J) przecinane przez białka RAG, jak już
wspomniano, tworzą strukturę szpilki do włosów. Otwarcie szpilki często przebiega asyme-
trycznie, tak że jedna nić DNA jest dłuższa niż nić przeciwległa (ryc. 4.27). Przed połączeniem
obu segmentów genowych, krótsza nić zostaje uzupełniona nukleotydami komplementar-
nymi do nici dłuższej. Komplementarnie dodane nukleotydy noszą nazwę nukleotydów P.
Poza nukleotydami P na złączu może być dodane do 20 nukleotydów N. Są one dołączane
bezmatrycowo przez enzym transferazę nukleotydów terminalnych (TdT). Dodawanie nukle-
otydów N częściej dotyczy Å‚aÅ„cuchów ciężkich Ig oraz TCR ², niż Å‚aÅ„cuchów lekkich Ig. Doda-
wanie nukleotydów P i N na złączu może w 2/3 przypadków prowadzić do zmiany ramki od-
czytu powstałego genu VDJ, co może dalej skutkować brakiem syntezy funkcjonalnego białka
w wyniku wprowadzenia kodonu nonsensownego.
4.3.4. Mutacje somatyczne
Procesem, który zwiększa liczbę wariantów cząsteczek immunoglobulin są mutacje so-
matyczne już zrekombinowanych genów V(D)J. Zachodzą one w limfocytach B grudek chłon-
nych między 6 a 14 dniem od kontaktu z antygenem i dotyczą fragmentów genów kodują-
cych rejon zmienny łańcuchów ciężkich i lekkich Ig. Najwyższa częstość mutacji występuje w
regionach CDR. Jedną mutację obserwuje się na ok. 10 000 komórek spośród jednej genera-
cji. Jest to częstotliwość olbrzymia, około milion razy większa niż w przypadku mutacji spon-
tanicznych w innych genach. W wyniku tego procesu dochodzi do wymiany nawet do 1%
nukleotydów w egzonach dla części zmiennych łańcuchów ciężkich i lekkich Ig. Mutacje so-
matyczne prowadzÄ… do zjawiska, tzw. dojrzewania odpowiedzi immunologicznej, polegajÄ…ce-
go na wzroście lub obniżeniu powinowactwa do antygenu. Proces generowania mutacji so-
matycznych przedstawia ryc. 4.28. Proces ten rozpoczyna się od aktywności enzymu AID (Ac-
tivation-Induced Deaminase), który katalizuje reakcję deaminacji cytozyny do uracylu. Ten
typ mutacji prowadzi do powstania uszkodzeń w postaci par U" G. Pary U" G są następnie
rozpoznawane albo przez glikozylazę uracylu (UNG) albo MSH2-MSH6. Wycięcie uracylu
przez UNG powoduje powstanie w DNA miejsca AP (purynowego bÄ…dz
pirymidynowego),
rozpoznawanego następnie przez endonukleaze APE1, która przecina łańcuch DNA obok
miejsca AP i powoduje jego wycięcie wraz z kilkoma innymi nukleotydami. Replikacja po-
wstałej luki (z udziałem REV1 i innych polimeraz DNA kopiujących mimo pęknięć) będzie prowa-
dzić albo do tranzycji albo transwersji par G/C. Rozpoznanie pary U" G przez MSH2-MSH6
wzbudza egzonuklezÄ™ I i proces naprawy zależny od polimerazy ·, który prowadzi do mutacji
par A/T.
203
Monika Ryba
Ryc. 4.28. Mechanizmy prowadzące do mutacji somatycznych regionów zmiennych
immunoglobulin (z
ródło: Neuberger MS Journal of Experimental Medicine 2006)
4.4. Proliferacja dojrzałych limfocytów B i produkcja przeciwciał
4.4.1. Przejściowe limfocyty B
Niedojrzałe limfocyty B IgM+, po opuszczeniu szpiku kostnego, dostają się do śledziony
jako przejściowe limfocyty B (trasitional), by następnie przekształcić się w dojrzałe limfocyty
B (ryc. 4.29). Limfocyty B przejściowe dzieli się na dwie subpopulacje  typu 1 (T1) i typu 2
(T2). Ponieważ T1 pochodzą bezpośrednio ze szpiku, komórki te mają fenotyp bardzo zbliżo-
ny do niedojrzałych limfocytów B. Nie mają lub mają bardzo niską ekspresję IgD, CD21 i
CD23, ale mają też wysoką ekspresję śródbłonowej IgM (mIgM). Tylko niewielki procent ko-
mórek T1 przechodzi w komórki T2, co oznacza, że większość T1 ulega apoptozie. Potwier-
dzają to dwie obserwacje. Po pierwsze, niektóre limfocyty B powstałe w szpiku mogą być
autoreaktywne tylko w stosunku do antygenów występujących na obwodzie. Po drugie, ko-
mórki T1 charakteryzuje ekspresja proapoptotycznego białka Fas, natomiast brak im ekspre-
sji antyapoptotycznego Bcl-2. Komórki T1, które zasiedlą grudki chłonne stają się komórkami
T2. Stanowią one formę pośrednią między T1 a dojrzałymi limfocytami B. Mają wysoką eks-
presję mIgM, mIgD, CD21 i CD23. W przejściu z formy T1 do formy T2 rolę odgrywa sygnali-
zacja z receptora BCR, która sprzyja proliferacji przejściowych limfocytów B typu 2. Istotnym
czynnikiem do przejścia T1T2 jest czynnik BAFF (B-cell activating factor), który przekazuje
komórce sygnaÅ‚ przeżyciowy, poprzez aktywacjÄ™ czynnika transkrypcyjnego NFºB.
204
Rozdział 4. Lmfocyty B
Ryc. 4.29. Rozwój przejściowych i dojrzałych limfocytów B
(z
ródło: Niiro H Nature Reviews Immunology 2002)
4.4.1.1. Ekspresja IgM i IgD tej samej swoistości
Jak to się dzieje, że naiwny limfocyt B ma na swojej powierzchni receptory IgM i IgD,
które mają taką samą swoistość, a więc rozpoznają te same antygeny? Jak już pokazano, na
ryc. 4.17 geny dla części stałych C łańcuchów ciężkich leżą w genomie w odpowiedniej kolej-
ności, która określa kolejność ich transkrypcji. W dojrzałych limfocytach B, inicjacja tran-
skrypcji z promotora VH biegnie przez egzony Cµ i C´ (ryc. 4.30). Powstaje dÅ‚ugi pierwotny
transkrypt, który następnie podlega alternatywnemu splicingowi. Cięcie i poliadenylacja w
miejscu µ (pA1) prowadzi do powstania mRNA kodujÄ…cego Å‚aÅ„cuch ciężki µ. CiÄ™cie, poliade-
nylacja w miejscu ´ (pA2) i splicing, który usuwa egzony Cµ prowadzi do powstania mRNA
kodujÄ…cego Å‚aÅ„cuch ciężki ´.
Ryc. 4.30. Koekspresja IgM I IgD w wyniku alternatywnego splicingu pierwotnego transkryptu
(z
ródło: Janeway CA Immunobiology 2005)
205
Monika Ryba
4.4.2. Ekspresja formy śródbłonowej i wydzielniczej immunoglobuliny
Pierwszą immunoglobuliną jaka pojawia się na wszystkich limfocytach B jest śródbłono-
wą formą IgM (mIgM). Po stymulacji antygenowej, część z aktywowanych limfocytów B prze-
kształca się w komórki plazmatyczne, produkujące przeciwciała (wolne formy immunoglobu-
lin IgM), pozostała część komórek, w procesie zmiany klas, nabywa zdolności do ekspresji
receptorów Ig innego izotypu z równoczesną produkcją form wydzielniczych. Formy śródbło-
nowe wszystkich klas Ig sÄ… monomerami. IgM i IgA polimeryzujÄ… tylko wtedy gdy sÄ… wydzie-
lane. W formie śródbłonowej łańcuch ciężki immunoglobuliny na końcu karboksylowym po-
siada hydrofobową domenę transbłonową długości ok. 25 aminokwasów, dzięki której im-
munoglobulina jest wbudowana w błonę limfocytu B. Formy wydzielnicze immunoglobulin
zamiast domeny transbłonowej na końcu karboksylowym łańcucha ciężkiego posiadają hy-
drofilowy ogon. Karboksylowe zakończenia formy śródbłonowej i wydzielniczej immunoglo-
buliny są kodowane przez różne egzony, a produkcja tych dwóch form odbywa się dzięki al-
ternatywnemu splicingowi (ryc. 4.31). Dwa ostatnie egzony każdego genu CH zawierają se-
kwencje kodujące region dla formy wydzielniczej (SC) i region dla formy śródbłonowej (MC).
W przypadku przeciwciała IgD sekwencja SC występuje w osobnym egzonie, jednak dla
wszystkich innych przeciwciał, tak jak pokazano na ryc. 4.31, sekwencja SC jest przedłuże-
niem ostatniego egzonu C. Każdy gen dla części stałej łańcucha ciężkiego C ma dwa miejsca
poliadenylacji określone jako pAs i pAm.
Ryc. 4.31. Forma śródbłonowa i wydzielnicza immunoglobuliny
(z
ródło: Janeway CA Immunobiology 2005)
Na ryc. 4.31a pierwotny transkrypt dla IgM ulega cięciu i poliadenylacji w miejscu pAm.
Splicing w miejscu zlokalizowanym miÄ™dzy egzonem Cµ4 i sekwencjÄ… SC oraz koÅ„cem
5 egzonów MC prowadzi do usunięcia sekwencji SC i połączenia egzonów MC z egzonem
Cµ4. Powstaje forma Å›ródbÅ‚onowa immunoglobuliny. Gdy pierwotny transktypt ulega polia-
denylacji w miejscu pAs (ryc. 4.31b) egzony MC zostają usunięte i powstaje forma wydzielni-
cza przeciwciała.
206
Rozdział 4. Lmfocyty B
4.4.3. Zasiedlanie obwodowych narządów limfatycznych przez limfocyty B
Po związaniu antygenu, naiwne limfocyty B IgM+IgD+ zwiększają ekspresję receptora
CCR7 i kierują się do stref obwodowych narządów limfatycznych bogatych w limfocyty Th, z
którymi zaczynają wchodzić w interakcje, prezentują im antygen, a w zamian otrzymują sty-
mulację i mogą różnicować się dwiema drogami: pierwsza prowadzi do powstania ośrodków
rozmnażania, druga prowadzi do wytworzenia krótko żyjących komórek plazmatycznych,
które produkują przeciwciała o niskim powinowactwie do antygenu (ryc. 4.32).
Ryc. 4.32. Drogi różnicowania limfocytów B
(z
ródło: Vinuesa CG Nature Reviews Immunology 2005)
4.4.3.1. Ośrodki rozmnażania
Limfocyty B, które zasiedlą grudkę zaczynają intensywnie proliferować, tworząc ośrodki
rozmnażania (ryc. 4.33), gdzie różnicują się w długo żyjące komórki plazmatyczne i komórki
pamięci. Proliferujące w ośrodku rozmnażania limfocyty B, nazywane centroblastami, prze-
chodzą liczne mutacje somatyczne regionów zmiennych łańcuchów ciężkich i lekkich immu-
noglobulin. Centroblasty tworzą strefę ciemną ośrodka rozmnażania. Po serii mutacji soma-
tycznych centroblasty opuszczają cykl komórkowy i przedostają się do strefy jasnej grudki.
Stają się centrocytami i jeśli prawidłowo zwiążą antygen, który przekazany jest im przez ko-
mórki dendrytyczne grudek  FDC (Rozdział 5), przetwarzają go a następnie prezentują obec-
nym w strefie jasnej limfocytom T pomocniczym grudek TFH (follicular B helper T cells). Inte-
207
Monika Ryba
rakcja z limfocytami TFH prowadzi do przeżycia i selekcji centrocytów z receptorami wykazu-
jącymi wysokie powinowactwo do antygenu, zapewnia sygnał do różnicowania w długo-
wieczne komórki plazmatyczne i komórki pamięci. Ponad to interakcja ta może stymulować
centrocyty do powrotu do strefy ciemnej ośrodka rozmnażania, aby mogły one tam ponow-
nie przejść serię mutacji somatycznych, które mogłyby jeszcze bardziej zwiększyć powino-
wactwo do antygenu ich receptorów BCR.
Ryc. 4.33. Grudka chłonna wraz z ośrodkiem rozmnażania
(z
ródło: Vinuesa CG Nature Reviews Immunology 2005)
4.4.3.1.1. Limfocyty T grudek chłonnych
Istnieje co najmniej siedem subpopulacji limfocytów T pomocniczych grudek chłonnych
(TFH). Zostały one zidentyfikowane na podstawie fenotypu powierzchniowego oraz lokalizacji.
Każda z tych subpopulacji wydaje się odgrywać inną funkcję. Funkcja efektorowa limfocytów
TFH jest wzmacniana w wyniku sygnalizacji poprzez receptor SAP (ryc. 4.36). Ogólną charakte-
rystykę subpopulacji limfocytów TFH przedstawiono w tabeli 4.3.
Tab. 4.3 Wybrane subpopulacje limfocytów T pomocniczych grudek chłonnych
Fenotyp Lokalizacja Funkcja
CD4+CD25CD57+ strefa jasna zapewniają pomoc limfocytom B ośrodków rozmnażania po-
CD69+CXCR5+ przez indukcjÄ™ ekspresji AID, zmiany klas i produkcji immuno-
globulin, po stymulacji zwiększają ekspresję OX40 i CD40L,
słabi producenci IFNłi TNFą
CD4+CD25-CD57- strefa zewnę- prawdopodobnie zapewniają pomoc limfocytom B ośrodków
CD69-CXCR5+ trzna rozmnażania gdyż zawierają preformowany CD40L
CD4+CD25+CD57- ośrodek hamują inne limfocyty TFH oraz produkcję immunoglobulin,
CD69+CXCR5- rozmnażania przeżycie i ekspresję AID przez limfocyty B ośrodków rozmna-
208
Rozdział 4. Lmfocyty B
żania
CD4+CD57- ośrodek rozm- limfocyty Th2 lub ich prekursory; produkują IL4, IL5 i IL13
CXR5+CRTH2+ nażania
CD4+ grudka chłon- lokalizują się w grudkach chłonnych pierwotnych; mogą za-
na wierać limfocyty T pamięci CD44hiIL7R+, które podtrzymują
wtórną odpowiedz
immunologicznÄ…
CD8+ ośrodek rozm- funkcja nieznana; stanowią <5% limfocytów T ośrodków roz-
nażania mnażania w migdałkach, ale 10-15% limfocytów T ośrodków
rozmnażania w węzłach chłonnych
4.4.3.1.2. Interakcja CD40-CD40L
CD40 jest białkiem powierzchniowym o masie 45-50 kDa, długości 277 aminokwasów
należącym do rodziny receptorów dla TNF. Cząsteczka ta kodowana jest przez gen leżący na
chromosomie 20. Ekspresję CD40 wykazują limfocyty B, komórki dendrytyczne, komórki na-
błonkowe grasicy, makrofagi oraz komórki śródbłonka. Ligandem dla CD40 jest powierzch-
niowe białko o masie 34-39 kDa - CD40L (CD154), kodowane przez gen leżący na chromoso-
mie X. Ta 261 aminokwasowa czÄ…steczka ulega ekspresji na aktywowanych limfocytach T,
aktywowanych limfocytach B i aktywowanych płytkach krwi. Podczas odpowiedzi zapalnej
ekspresja CD40L może pojawiać się na innych komórkach takich jak monocyty, czy komórki
śródbłonka naczyniowego. Ekspresja genów kodujących CD40 i CD40L jest regulowana przez
czynnik transkrypcyjny AKNA, należący do czynników zawierających motyw typu haka AT
(AT-hook), wiążących się z sekwencjami DNA bogatymi w pary AT. AKNA bezpośrednio wiąże
elementy regulatorowe promotorów genów CD40 i CD40L indukując ich transkrypcję. Inte-
rakcja CD40-CD40L prowadzi do klonalnej ekspansji limfocytów B, tworzenia ośrodków roz-
mnażania, zmiany klas syntetyzowanych przeciwciał, dojrzewania powinowactwa, różnico-
wania długowiecznych komórek plazmatycznych, a także chroni limfocyty B przed apoptozą.
Rozpoznanie antygenu prezentowanego w kontekście MHC klasy II przez receptor TCR na
limfocycie Th indukuje ekspresję CD40L na tym limfocycie (ryc. 4.34a). Następnie CD40L wią-
że się z receptorem CD40 na powierzchni limfocytu B prowadząc do zwiększenia ekspresji
cząsteczek B7.1 i B7.2 na limfocycie B (ryc. 4.34b). Jak już wiadomo, cząsteczki B7 są nie-
zbędne do kostymulacji limfocytu T w wyniku łączenia z cząsteczką CD28 (ryc. 4.34c). Tak
więc interakcja CD40-CD40L przynosi korzyści obu reagującym ze sobą komórkom.
209
Monika Ryba
a b c
Limfocyt T
Limfocyt T
Limfocyt T
CD40L
CD28
CD4-TCR CD40L CD40L
CD40
B7
MHC-peptyd B7
Limfocyt B
Limfocyt B Limfocyt B
Ryc. 4.34. Interakcja CD40-CD40L
Sygnały przekazywane przez CD40 są wymagane już podczas pierwszej interakcji limfo-
cytów B z limfocytami T w strefie zewnętrznej grudki. Potem, sygnał CD40-CD40L wymagany
jest podczas selekcji centrocytów w strefie jasnej ośrodka rozmnażania. Jedna z subpopulacji
limfocytów TFH (tab. 4.3) zawiera preformowany CD40L, który ulega tylko przejściowej eks-
presji na powierzchni błony komórkowej po stymulacji receptora TCR. Limfocyty B ośrodków
rozmnażania, które nie otrzymają sygnałów od limfocytów T umierają śmiercią apoptotycz-
ną. Sygnał z receptora CD40 do wnętrza limfocytu B jest przekazywany za pośrednictwem
cytoplazmatycznych białek adaptorowych z rodziny TNF  TRAF (Tumour-necrosis factor re-
ceptor (TNFR)-associated factors). CD40, po zwiÄ…zaniu liganda, tworzy trimer, a do jego do-
meny cytoplazmatycznej przyłączają się białka TRAF (ryc. 4.35a). Cynkowa domena RING
białka TRAF2 wykazuje aktywność ligazy E3 ubikwityny i może inicjować ubikwitynację swoją
własną oraz innych białek TRAF. Takie białka dalej ulegają degradacji w proteasomie. Połą-
czenie TRAF2 lub TRAF6 z receptorem CD40 i zwiÄ…zanym z nim ligandem aktywuje czynnik
transkrypcyjny NF8
B w limfocytach B. Samo TRAF2 inicjuje degradację białek TRAF oraz po-
średniczy w utrzymaniu synergii między sygnalizacją z receptora BCR, a CD40. Samo TRAF6, z
kolei, przekazuje sygnał do produkcji IL6 i wydzielenia przeciwciał IgM (ryc. 4.35A).
A
210
Rozdział 4. Lmfocyty B
B
Ryc. 4.35. Funkcje białek TRAF w limfocycie B (A) oraz drogi transdukcji sygnału prowadzące
do ekspresji odpowiednich genów (B)
(z
ródło:Bishop AG Nature Reviews Immunology 2004)
Indukcja NF8
B następuje poprzez aktywację kinazy NIK (NF8
B-inducing kinase) oraz
kompleksu IKK (inhibitor of NF-8
B (I8
B) kinase complex). Produkcja IL6 indukowana przez
TRAF6 zachodzi w wyniku aktywacji czynnika transkrypcyjnego NF-IL6 (Nuclear Factor of In-
terleukin-6). Poza tym TRAF6 aktywuje czynnik transkrypcyjny AP1. Kinaza GC (Germinal-
Centre kinase) i inne pokrewne enzymy mogą wchodzić w interakcję z białkiem TRAF2, a to
prowadzi do aktywacji kinazy JNK (ryc. 4.35B).
4.4.3.1.3. ICOS i IL10
ICOS i IL10 są czynnikami, które wspomagają różnicowanie i wzrost limfocytów B w
ośrodkach rozmnażania
Cząsteczka ICOS i jej ligand zostały przedstawione już w rozdziale 3.2.. Jak już wtedy
powiedziano, limfocyty T w wyniku stymulacji TCR-MHC i ICOS-ICOSL proliferujÄ… i produkujÄ…
IL10, będącą silnym stymulantem wzrostu i różnicowania limfocytów B. Wysoki poziom eks-
presji ICOS obserwuje się na limfocytach TFH obecnych w strefie jasnej ośrodka rozmnażania.
Poza tym istnieje dodatnia korelacja pomiędzy poziomem ekspresji ICOS na limfocytach T
CD4+, a ilością produkowanej IL10. U osób z delecją ICOS dochodzi do rozwoju pospolitego
zmiennego niedoboru odporności (CVID). U takich pacjentów nie obserwuje się ani zmiany
klas produkowanych przeciwciał, ani produkcji limfocytów B pamięci. Świadczy to o udziale
interakcji ICOS-ICOSL w generowaniu pamięci immunologicznej. Spokrewniona z ICOS czą-
steczka CD28 jest również niezbędna w funkcjonowaniu ośrodków rozmnażania. W wyniku
interakcji CD28 na limfocycie T z B7 na APC, na limfocytach T CD4+ dochodzi do zwiększenia
ekspresji cząsteczki OX40, która jest wymagana do zasiedlania grudek chłonnych przez limfo-
cyty T.
211
Monika Ryba
4.4.3.1.4. IL21
Produkcja IL21, szczególnie przez limfocyty TFH, oraz wysokie poziomy receptora dla tej
cytokiny stwierdzone na powierzchni większości limfocytów B wskazują, że pełni ona rolę
cytokiny wspomagającej limfocyty B. Efekty działania IL21 na limfocyty B zależą od warun-
ków stymulacji. Podanie IL21 wraz z przeciwciałem anty-CD40 zwiększa mitogenezę limfocy-
tów B oraz promuje ich różnicowanie w kierunku komórek plazmatycznych, co wykazano na
podstawie produkcji przez nie przeciwciał różnych klas, jak również na podstawie wzrostu
ekspresji czynnika transkrypcyjnego charakterystycznego dla komórek plazmatycznych
BLIMP1. Poza tym stwierdzono, że u myszy z delecją receptorów dla IL4 i IL21, produkcja IgG
jest znacznie obniżona. Wskazuje to na współpracę IL21 z IL4 w regulacji humoralnej odpo-
wiedzi immunologicznej.
4.4.3.1.5. Bcl-6
Badania pokazują, że Bcl-6 może być czynnikiem transkrypcyjnym regulującym różnico-
wanie i funkcje występujących w grudkach zarówno limfocytów B jak i limfocytów T. ekspre-
sja Bcl-6 podlega ścisłej regulacji i jest praktycznie ograniczona do limfocytów T i B ośrodka
rozmnażania. Co ważne, Bcl-6 ulega ekspresji w limfocytach TFH, ale nie w limfocytach Th1
czy Th2. W limfocytach B, Bcl-6 reguluje różnicowanie tych komórek w limfocyty B ośrodków
rozmnażania, hamując jednocześnie różnicowanie w kierunku komórek plazmatycznych. My-
szy Bcl-6-/- mają defekt w odpowiedzi immunologicznej zależnej od limfocytów T oraz całko-
wity brak mutacji somatycznych, co potwierdza niezdolność tych mysich limfocytów B do
tworzenia ośrodków rozmnażania.
Na ryc. 4.36 przedstawiono interakcję między limfocytem B ośrodka rozmnażania, a lim-
focytem TFH. Część z tych interakcji dotyczy również oddziaływania limfocytów T i B na ob-
wodzie.
Należy jeszcze dodać, że zasiedlanie grudki przez limfocyty B i T odbywa się pod wpły-
wem sygnałów chemotaktycznych wysyłanych przez komórki zrębu grudki, które produkują
chemokinę CXCL13, która łączy się ze swoim receptorem CXCR5 na powierzchni limfocytów B
i T kierowanych do grudki chłonnej.
Ryc. 4.36. Cząsteczki uczestniczące w interakcji limfocytów B i TFH w grudce chłonnej
(z
ródło: Vinuesa CG Nature Reviews Immunology 2005)
212
Rozdział 4. Lmfocyty B
4.4.4. Zmiana klas syntetyzowanych przeciwciał
Mechanizm zmiany klasy syntetyzowanych przeciwciał (Class-Switch Recombination 
CSR) jest procesem polegającym na ponownej rekombinacji genów immunoglobulinowych,
podczas której limfocyt B przełącza się z produkcji IgM na IgG, IgE lub IgA. Jak już powiedzia-
no wcześniej, proces zmiany klas, podobnie jak mutacje somatyczne, zachodzą w limfocytach
B po ich kontakcie z antygenem. Mutacje somatyczne w regionach zmiennych łańcuchów
lekkich i ciężkich prowadzą do selekcji limfocytów B, które produkują przeciwciała z wyższym
powinowactwem do antygenu.
W wyniku mechanizmu CSR dochodzi do wymiany egzonu kodujÄ…cego część staÅ‚Ä… (Cµ)
na któryÅ› z egzonów leżących dalej w kierunku 3 (CÅ‚, Cµ lub CÄ…). Tak wiÄ™c CSR pozwala na
ekspresję przeciwciał o takiej samej swoistości do antygenu, ale należących do innej klasy
(IgG, IgE lub IgA) i przez to pełniących inne funkcje efektorowe. Mechanizm zmiany klas wy-
maga, podobnie jak proces mutacji somatycznych, enzymu AID. Dodatkowo limfocyt B może
zmienić klasę syntetyzowanych przeciwciał dopiero po otrzymaniu pomocy ze strony limfo-
cytu Th.
4.4.4.1. Regiony S
Powyżej każdego genu dla części staÅ‚ej C (z wyjÄ…tkiem C´) wystÄ™pujÄ… tzw. regiony S (swi-
tch) - przełączeniowe (ryc. 4.37). Regiony S są bogate w guaninę w nici niekodującej (ryc.
4.38).
Ryc. 4.37. Rozmieszczenie regionów switch
(z
ródło: Janeway CA Immunobiology 2005)
Wykazano, że delecja wiÄ™kszoÅ›ci regionu Sµ prowadzi do ciężkiego upoÅ›ledzenia zmiany
klasy syntetyzowanych przeciwciał IgG, IgE i IgA, natomiast delecja całego regionu Sł1 bloku-
je zmianę klasy na IgG1. Zmiana części stałej (CH) w danej immunoglobulinie jest poprzedzo-
na transkrypcjÄ… odpowiedniego regionu S. W odpowiedzi na kostymulacjÄ™ i cytokiny docho-
dzi do inicjacji transkrypcji z promotora leżącego powyżej egzonu I, poprzedzającego wszyst-
kie geny CH (ryc. 4.39) Transkrypcja przechodzi przez region S oraz znajdujÄ…ce siÄ™ za nim geny
dla części stałej.
213
Monika Ryba
Ryc. 4.38. Sekwencje regionów switch
W wyniku splicingu pierwotnego transkryptu region S zostaje wycięty, umożliwiając po-
łączenie egzonu I z pozostałymi egzonami CH (ryc. 4.39a).
Region S może tworzyć stabilne hybrydy RNA-DNA, w którch nić niekodująca może two-
rzyć albo nietypowe struktury (G-kwartet, szpilka do włosów), albo pozostaje w formie jed-
noniciowej, prowadząc do utworzenia pętli R (ryc. 4.39b).
Ryc. 4.39. Transkrypcja podczas CSR (a) oraz powstałe w tym czasie struktury (b)
(z
ródło: Chaudhuri J Nature Reviews Immunology 2004)
4.4.4.2. Mechanizm CSR
Zmiana klasy zachodzi w wyniku rekombinacji pomiędzy odpowiednimi regionami S. Na
ryc. 4.40 przedstawiono mechanizm zmiany klasy z IgM na IgG. W wyniku transkrypcji prze-
biegajÄ…cej przez oba rekombinujÄ…ce ze sobÄ… regiony S (w tym wypadku Sµ i SÅ‚) dochodzi do
wytworzenia pętli R. Pojedyncza nić DNA regionu S staje się substratem dla enzymu AID, któ-
ry dokonuje deaminacji cytydyny. Następnie enzym UNG rozpoznaje wprowadzony uracyl.
Dochodzi do powstania luki w nici niekodujÄ…cej regionu S. System naprawczy BER (Base Exci-
tion Repair), a konkretniej główny enzym tego systemu  APE1, wprowadza pojedyncze
uszkodzenia w obu niciach (Single Strand Break  SSB) i jeśli te uszkodzenia znajdują się wy-
214
Rozdział 4. Lmfocyty B
starczająco blisko, dochodzi do powstania podwójnego uszkodzenia DNA (Double Strand
Break  DSB) w regionach S. Jeśli jednak uszkodzenia SSB są bardziej od siebie oddalone, to
do wytworzenia DSB potrzebny jest udział innego systemu naprawczego  MMR (Mismatch
Repair). Odcinek pomiędzy dwoma rekombinującymi ze sobą regionami S ulega delecji, na-
tomiast niekompletne regiony S przybliżają się do siebie tworząc rodzaj synapsy. W tworze-
niu tej synapsy uczestniczy szereg białek, które rozpoznają podwójne uszkodzenia DNA (DSB)
i zapewniają prawidłowe połączenie obydwu końców w mechanizmie NHEJ.
Ryc. 4.40. Mechanizm CSR
(z
ródło: Chaudhuri J Nature Reviews Immunology 2004)
4.4.5. Komórki plazmatyczne
Komórki plazmatyczne mogą powstawać z naiwnych limfocytów B strefy brzeżnej śle-
dziony, limfocytów B grudek chłonnych, ośrodków rozmnażania, a także z komórek pamięci.
To która subpopulacja przejdzie terminalne różnicowanie zależy od rodzaju antygenu, jego
dawki, a także miejsca podania. Pierwszą linię obrony przed niektórymi patogenami stano-
wią przeciwciała produkowane przez limfocyty B1.
215
Monika Ryba
Ryc. 4.41. Ścieżki różnicowania limfocytów B
(z
ródÅ‚o: Küppers R Nature Reviews Immunology 2003)
4.4.5.1. Limfocyty B1
Limfocyty B1 występują głównie w jelicie i jamie otrzewnowej. U osób dorosłych stano-
wią one ok. 20% limfocytów B krwi obwodowej i śledziony, ale w okresie płodowym jest ich
2 3-krotnie więcej. Limfocyty B1 pojawiają się wcześniej podczas rozwoju ontogenetyczne-
go. Progenitory komórek B1 występują bardzo licznie w płodowej wątrobie, ale brak ich w
dorosłym szpiku kostnym. Komórki B1 mają unikatową zdolność do samoodnawiania. Są od-
powiedzialne za produkcję  naturalnych IgM w odpowiedzi na własne antygeny, ale też sta-
nowią pierwszą linię obrony przeciwbakteryjnej. Produkują przeciwciała (głównie IgM, mniej
IgA i IgG) o szerokim spektrum swoistości. Komórki B1 są aktywowane podczas odpowiedzi
nieswoistej przez antygeny grasiczoniezależne, na które odpowiedz
nie wymaga bezpośred-
niej pomocy ze strony limfocytów Th. Limfocyty Th mogą jednak w pewnych warunkach
zwiększać aktywację limfocytów B1 i wpływać na przełączanie klas produkowanych przez nie
przeciwciał. Limfocyty B1 nie różnicują się w komórki pamięci immunologicznej. Część limfo-
cytów B1 (B1a) wykazuje ekspresję powierzchniowej cząsteczki CD5 (negatywny regulator
sygnalizacji przez BCR), CD11b (na komórkach w jamie otrzewnowej). Po aktywacji limfocyty
B1 migrują do śledziony gdzie tracą ekspresję CD5 i stają się komórkami wydzielającymi
przeciwciała (ryc. 4.42). Transkrypcja CD5 jest kontrolowana przez specyficzną sekwencję
wzmacniającą zależną od NFAT. Rozwój komórek B1a wymaga czynnika transkrypcyjnego
NFATc1, ale jest niezależny od NFATc2. Limfocyty B1 charakteryzują się stale aktywnym biał-
kiem STAT3, podczas gdy w tradycyjnych limfocytach B (B2), STAT3 jest aktywowane tylko w
odpowiedzi na sygnalizację przez receptory dla cytokin lub TLR. Komórki B1, które zaczną
produkować przeciwciała, podobnie jak limfocyty B2, wymagają czynnika transkrypcyjnego
BLIMP1 do utrzymania swoich zdolności sekrecyjnych.
216
Rozdział 4. Lmfocyty B
4.4.5.2.Komórki plazmatyczne powstające we wczesnej fazie odpowiedzi immuno-
logicznej
Pierwszymi limfocytami B, które w odpowiedzi na obcy antygen, różnicują się w komórki
plazmatyczne, są limfocyty B strefy brzeżnej śledziony (marginalne). Myszy, którym brak
marginalnych limfocytów B są bardziej podatne na infekcje bakteryjne. Potwierdza to rów-
nież obserwacja, że marginalne limfocyty B reagują głównie na antygeny grasiczoniezależne
typu 2 (TI-2), aczkolwiek mogą też rozpoznawać antygeny grasiczozależne zapewniając jed-
nocześnie kostymulację limfocytom T. Marginalne limfocyty B nie krążą, a ich lokalizacja
sprzyja wczesnej odpowiedzi na antygeny pochodzÄ…ce z krwi. Zaledwie kilka godzin po im-
munizacji antygenem TI-2, marginalne limfocyty B przemieszczajÄ… siÄ™ w okolice miazgi czer-
wonej, gdzie bardzo szybko proliferują, różnicując się w plazmablasty, które są komórkami
proliferującymi i produkującymi przeciwciała jednocześnie. Najważniejszą właściwością lim-
focytów B strefy brzeżnej śledziony jest ich wrodzona zdolność do szybkiej odpowiedzi na
antygen. Mają niższy próg aktywacji antygenowej niż limfocyty B grudek chłonnych, a poza
tym znacznie większą zdolność do podziałów. Mechanizmy odpowiedzialne za tak gwałtowną
odpowiedz
tych komórek nie są do końca zrozumiałe, ale zwiększona ekspresja, na tych ko-
mórkach, cząsteczek takich jak CD21 (receptor dla dopełniacza), CD1d czy cząsteczek kosty-
mulujących B7, zdaje się sprzyjać pochłanianiu przez nie antygenów i kostymulacji limfocy-
tów T.
Dojrzałe limfocyty B grudek chłonnych, po rozpoznaniu antygenu i otrzymaniu pomocy
od limfocytów Th również odpowiadają szybko (choć wolniej niż marginalne limfocyty B)
przechodząc proliferację i różnicowanie w plazmablasty i komórki plazmatyczne (tylko pro-
dukują przeciwciała, nie proliferują). Dwa dni po immunizacji antygenem grasiczozależnym,
obserwuje się skupiska tych komórek w części okołonaczyniowej miazgi białej (PALS). Eks-
pansja tych komórek trwa aż do 8 dnia od immunizacji, potem powoli ustaje.
Komórki plazmatyczne powstałe z marginalnych limfocytów B i limfocytów B grudek
chłonnych, a więc powstałe we wczesnej fazie odpowiedzi immunologicznej pierwotnej żyją
kilka dni, przeciwciała, które produkują mają zwykle niskie powinowactwo do antygenu (nie
przechodzÄ… mutacji somatycznych), ale zapewniajÄ… szybkÄ… odpowiedz
na antygen (ryc. 4.42).
4.4.5.3. Komórki plazmatyczne powstające w póz
nej fazie odpowiedzi immunolo-
gicznej
W póz
nej fazie odpowiedzi immunologicznej lub powtórnej odpowiedzi na antygen (od-
powiedz
wtórna) powstają długowieczne komórki plazmatyczne. Powstają one albo z limfo-
cytów B ośrodków rozmnażania (podczas odpowiedzi pierwotnej) albo z komórek pamięci
(podczas odpowiedzi wtórnej). Odpowiedz
immunologiczna ośrodków rozmnażania osiąga
maksimum między 10 a 14 dniem od immunizacji, po czym spada. Komórki plazmatyczne i
komórki pamięci powstałe w strefie jasnej ośrodka rozmnażania, zdolne do ekspresji prze-
ciwciał różnych klas i których receptory BCR mają wysokie powinowactwo do antygenu
(przeszły mutacje somatyczne), opuszczają ośrodek rozmnażania. Przed różnicowaniem w
komórki plazmatyczne, aktywowane limfocyty B przechodzą bardzo intensywną proliferację,
która jest jeszcze większa w obecności IL4 lub IL5.
217
Monika Ryba
Ryc. 4.42. Powstawanie komórek plazmatycznych
(z
ródło: Shapiro-Shelef M Nature Reviews Immunology 2005)
4.4.5.4. Regulacja rozwoju komórek plazmatycznych
Profil ekspresji czynników transkrypcyjnych w komórce plazmatycznej znacznie różni się
od tego w aktywowanym limfocycie B. Co ciekawe, niektóre z tych czynników hamują białka
odpowiedzialne za inną formę różnicowania (ryc. 4.43).
Jak już powiedziano wcześniej, białko Pax5 jest wymagane do utrzymania fenotypu lim-
focytów B aż do stadium komórek plazmatycznych. Aby mogło dojść do różnicowania komó-
rek plazmatycznych, transkrypcja Pax5 musi zostać zablokowana. Pax5 aktywuje geny nie-
zbędne dla prawidłowego funkcjonowania limfocytów B (ryc. 4.4). Jest poza tym represorem
ekspresji białka XBP1 (X-box-binding-protein-1), które jest wymagane do sekrecji immuno-
globulin.
Białko MITF (Microphthalmia-associated Transcription Factor) również hamuje rozwój
komórek plazmatycznych. Jest ono niezbędne do utrzymania dojrzałych limfocytów B w sta-
nie spoczynku. Przy jego braku, dochodzi do indukcji ekspresji BLIMP1 i spontanicznego two-
218
Rozdział 4. Lmfocyty B
rzenia komórek plazmatycznych. Aktywność ta zależy od represji czynnika IRF4 (Interferon-
Regulatory Factor 4).
Ryc. 4.43. Czynniki transkrypcyjne charakterystyczne dla limfocyta B i komórki plazmatycznej
(z
ródło: Shapiro-Shelef M Nature Reviews Immunology 2005)
Ekspresja IRF4 jest indukowana pod nieobecość MITF, a z kolei obniżenie ekspresji IRF4
powoduje zahamowanie rozwoju komórek plazmatycznych. Wysoki poziom ekspresji BCL6
(B-cell lymphoma) stwierdza się w limfocytach B ośrodków rozmnażania. Główną funkcją
BCL6 jest hamowanie ekspresji BLIMP1, pozwalając jednocześnie na utrzymanie ośrodków
rozmnażania. Myszy Bcl6-/- produkują więcej komórek plazmatycznych niż myszy typu dzikie-
go. BCL6 hamuje ekspresję BLIMP1 w wyniku oddziaływań z czynnikami AP1 i przez wiązanie
do specyficznego miejsca w intronie 5 genu Prdm1 (positiveregulatory-domain-containing 1)
kodującego BLIMP1. MTA3 (Metastasis-associated 1 family, member 3) poprzez bezpośred-
nią interakcję z BCL6 promuje jego zdolność represyjną. Wraz z BCL6 odgrywa ważną rolę w
hamowaniu różnicowania komórek plazmatycznych.
219
Monika Ryba
4.4.5.4.1. BLIMP1 i XBP1
Ekspresja BLIMP1 (B-lymphocyte-induced maturation protein 1) jest inicjowana w pre-
plazmablastach, które powstają niezależnie od białka BLIMP1. Plazmablasty wykazują średni
poziom ekspresji BLIMP1, podczas gdy komórki plazmatyczne mają już wysoki poziom tego
czynnika. BLIMP1 jest represorem transkrypcji i jest niezbędny w różnicowaniu komórek pla-
zmatycznych i sekrecji immunoglobulin. Aktywność BLIMP1 prowadzi do: (1) zatrzymania
cyklu komórkowego (bezpośrednio hamuje geny takie jak myc ), (2) represji genów, które są
niezbędne w utrzymaniu fenotypu dojrzałych limfocytów B ośrodków rozmnażania (geny
kodujące białka biorące udział w sygnalizacji BCR, interakcjach z limfocytami Th, CSR, muta-
cjach somatycznych) oraz (3) indukcji funkcji wydzielniczych limfocytów B. BLIMP1 hamuje
ekspresję dwóch czynników transkrypcyjnych niezbędnych w reakcjach ośrodków rozmnaża-
nia  BCL6 i Pax5. BLIMP1 jest również odpowiedzialny za indukcję ekspresji wielu genów
kodujących białka potrzebne w różnicowaniu komórek plazmatycznych oraz zaangażowa-
nych w sekrecjÄ™ immunoglobulin.
XBP1 jest drugim czynnikiem transkrypcyjnym. Razem z BLIMP1 reguluje ekspresjÄ™ ge-
nów w komórkach plazmatycznych (ryc. 4.44). Indukcja ekspresji BLIMP1 prowadzi do obni-
żenia ekspresji Pax5 i zwiększonej ekspresji immunoglobulin. Te dwa zdarzenia są niezbędne
do wzbudzenia ekspresji mRNA dla XBP1 i aktywacji endorybonukleazy IRE1Ä… (endoribonuc-
lease inositol-requiring 1ą), która przecina mRNA Xbp1 (inny koniec karboksylowy), prowa-
dząc do powstania bardziej aktywnej i stabilnej formy białka. XBP1 indukuje następnie eks-
presję genów, których produkty są zaangażowane w produkcję form wydzielniczych Ig.
Ryc. 4.44. Zależna od BLIMP1 i XBP1 regulacja ekspresji genów w komórkach plazmatycznych
(z
ródło: Shapiro-Shelef M Nature Reviews Immunology 2005)
220
Rozdział 4. Lmfocyty B
4.4.5.5. Migracja komórek plazmatycznych do szpiku kostnego
Receptory dla chemokin, integryny i ligandy dla selektyn są istotne w zdolności komórek
plazmatycznych do opuszczania ośrodków rozmnażania i migracji do szpiku kostnego, ślu-
zówki czy miejsc, w których toczy się proces zapalny. Zmniejszona ekspresja receptorów
CXCR5 i CCR7 obniża zdolność komórek plazmatycznych w migracji do stref gdzie produko-
wana jest CXCL13 i CCL19, a więc obszarów zasiedlonych przez limfocyty B i T. Obniżenie
ekspresji CXCR5 pozwala komórkom plazmatycznym opuścić grudkę chłonną. Komórki pla-
zmatyczne z ekspresją CXCR4 migrują do miazgi czerwonej śledziony, węzłów chłonnych i
szpiku, wszędzie tam gdzie produkowany jest ligand dla CXCR4  CXCL12. Ulegające ekspresji
na komórkach zrębu szpiku E-selektyna i VCAM1 są ważne w zatrzymaniu komórek plazma-
tycznych w szpiku kostnym dzięki interakcjom ze swoimi ligandami na powierzchni komórek
plazmatycznych.
Ryc. 4.45. Długowieczna komórka plazmatyczna w szpiku kostnym
(z
ródło: Shapiro-Shelef M Nature Reviews Immunology 2005)
221
Monika Ryba
Po kontakcie z komórkami plazmatycznymi, komórki zrębu szpiku zaczynają produkować
IL6. Makrofagi i komórki dendrytyczne z kolei produkują czynnik BAFF (B-cell activating fac-
tor), który wiąże się z receptorem BCMA (B-cell maturation antigen). BAFF wraz z IL6 przeka-
zują komórce plazmatycznej sygnał do przeżycia (ryc. 4.45). Te długowieczne komórki pla-
zmatyczne stanowią subpopulację komórek B pamięci.
Bibliografia
1. Alberts B Molecular Biology of the Cell. New York and London:Garland Science;
2002.
2. Bishop AG The multifaceted roles of TRAFs in the regulation of B-cell function.
Nature Reviews Immunology 4: 775-786; 2004.
3. Chaudhuri J Class-switch recombination: interplay of transcription, DNA dea-
mination and DNA repair. Nature Reviews Immunology 4: 541-552; 2004.
4. Fearon TD Arrested Differentiation, the Self-Renewing Memory Lymphocyte,
and Vaccination. Science 293: 248-250; 2001.
5. Gołąb J Immunologia. Wydawnictwo Naukowe PWN; 2007.
6. Holmes LM The regulation of the B-cell gene expression programme by Pax5.
Immunology and Cell Biology 86: 47 53; 2008.
7. Janeway CA Immunobiology. The immune system in health and disease. New
York ; London : Garland Science Publishing, 2005.
8. Matthias P Transcriptional networks in developing and mature B cells. Nature
Reviews Immunology 5: 497-508; 2005.
9. Neuberger MS Somatic hypermutation: activation-induced deaminase for C/G
followed by polymerase · for A/T. Journal of Experimental Medicine 204: 7-10;
2006.
10. Niiro H Regulation of B-cell fate by antigen-receptor signals. Nature Reviews
Immunology 2: 945-956; 2002.
11. Nutt S The Transcriptional Regulation of B Cell Lineage Commitment. Immunity
22: 715-725; 2007.
12. Pierce SK Lipid rafts and B-cell activation. Nature Reviews Immunology 2: 96-
105; 2002.
13. Roth BD Restraining the V(D)J recombinase. Nature Reviews Immunology 3:
656-666; 2003.
222
Rozdział 4. Lmfocyty B
14. Schlissel MS Regulating antigen-receptor gene assembly. Nature Reviews Im-
munology 3: 890-899; 2003.
15. Shapiro-Shelef M Regulation of plasma-cell development. Nature Reviews Im-
munology 5: 230-242; 2005.
16. Vinuesa CG Follicular B helper T cells in antibody responses and autoimmunity.
Nature Reviews Immunology 5: 853-865; 2005.
17. Xu Y DNA damage: a trigger of innate immunity but a requirement for adaptive
immune homeostasis. Nature Reviews Immunology 6: 261-270; 2006.
223
5. Komórki dendrytyczne
Komórki dendrytyczne występują we wszystkich narządach, choć zwykle w niewielkim
odsetku. We krwi dorosłego człowieka ich ilość stanowi ułamek procenta. Odgrywają pod-
stawową rolę w pobudzaniu limfocytów, zwłaszcza naiwnych. Ich cechą charakterystyczną
jest wygląd podobny do ciała komórki nerwowej, które posiada liczne, rozgałęziające się wy-
pustki (dendryty).
5.1. Powstawanie i subpopulacje komórek dendrytycznych
5.1.1. Ogólny schemat powstawania komórek dendrytycznych
Ryc. 5.1. Schemat powstawania komórek dendrytycznych
(z
ródło: Banchereau J Nature Reviews Immunology 2005)
224
Rozdział 5. Komórki dendrytyczne
Komórki dendrytyczne powstają w szpiku kostnym z hematopoetycznych komórek ma-
cierzystych. Komórki dendrytyczne mogą różnicować się z komórek linii mieloidalnej lub lim-
foidalnej. (ryc. 5.1).Droga mieloidalna prowadzi do powstania komórek Langerhansa, które
występują w warstwie podstawnej skóry oraz są zlokalizowane w tkance łącznej wielu narzą-
dów - dendrytyczne komórki śródmiąższowe. Rozwój z prekursorów limfoidalnych prowadzi
do powstania plazmacytoidalnych komórek dendrytycznych (pDC), które produkują bardzo
duże ilości interferonów typu 1 podczas infekcji wirusowej.
Komórki dendrytyczne mogą różnicować się z monocytów. Monocyty poddane hodowli
w obecności GMCSF i IL4 różnicują się w homogenną populacje komórek dendrytycznych
przypominającą komórki śródmiąższowe. Hodowla monocytów w obecności GMCSF i TNFą
daje komórki Langerhansa. Dodanie IL4 do hodowli komórek macierzystych CD34+ w obec-
ności GMCSF i TNFą hamuje różnicowanie komórek Langerhansa. Doświadczenia in vitro
pokazały, że komórki Langerhansa i śródmiąższowe komórki dendrytyczne otrzymane w wy-
niku hodowli komórek progenitorowych CD34+, różnią się zdolnością w aktywowaniu limfo-
cytów. Śródmiąższowe komórki dendrytyczne biorą udział w indukcji różnicowania komórek
plazmatycznych z limfocytów B, natomiast komórki Langerhansa są szczególnie efektywnymi
aktywatorami limfocytów T cytotoksycznych CD8+. Odróżnia je również zdolność do produk-
cji cytokin (tylko komórki śródmiąższowe produkują IL10), oraz ich aktywność enzymatyczna,
która może mieć istotne znaczenie przy selekcji peptydów przeznaczonych do prezentacji
limfocytom T. Subpopulacja mieloidalnych komórek dendrytycznych (DC1) CD11c+ charakte-
ryzujÄ… siÄ™ ekspresjÄ… CD1b/CD1c, CD16 i antygenu BDCA3 (blood DC antigen). Subpopulacja
CD11c- pDC (DC2) charakteryzuje ekspresja receptora dla IL3 (CD123), BDCA2 i BDCA4. Poza
tym komórki dendrytyczne DC1 mają ekspresję TLR2 i TLR4, podczas gdy DC2 posiadają TLR9.
5.1.2. Subpopulacje ludzkich dojrzałych komórek dendrytycznych w warunkach in
vivo
W przeciwieństwie do mysich komórek dendrytycznych, nie ma za dużo danych na te-
mat dojrzałych ludzkich komórek dendrytycznych izolowanych z tkanek. Ze względu na łatwą
dostępność, większość danych pochodzi z badań nad komórkami izolowanymi z krwi i mimo,
że we krwi można znalez
ć formy dojrzałe DC, zdolne do aktywacji limfocytów, większość ko-
mórek dendrytycznych krwi stanowią niedojrzałe DC (iDC) i plazmacytoidalne DC (pDC).
Ludzkie komórki dendrytyczne izolowane z krwi charakteryzują się różnorodnością pod
względem ekspresji różnych markerów, ale wiele z tych markerów wskazuje raczej na różnice
DC będących w stanie aktywacji/dojrzewania niż na ich różne subpopulacje. Ludzie komórki
dendrytyczne, w przeciwieństwie do mysich, nie wykazują ekspresji CD8 (u myszy wśród DC
można wyróżnić subpopulacje CD8ą+ i CD8ą-). Tak więc ich ludzki odpowiednik jest trudny
do określenia. Jednak, podobnie jak u myszy, ludzkie komórki Langerhansa stanowią odręb-
ną subpopulację DC z charakterystycznymi markerami takimi jak ziarnistości Birbecka, CD1a
czy białko o charakterze lektyny  langeryna. Badania nad ludzkimi komórkami dendrytycz-
nymi izolowanymi z tkanek wykazały, że większość ludzkich DC z grasicy ma fenotyp
CD11c+CD11b-CD45ROlow, natomiast brak im innych markerów charakterystycznych dla ko-
mórek linii mieloidalnej. Przypominają więc mysie grasicze CD8+ DC. Mniejsza część ludzkich
grasiczych DC o fenotypie CD11chighCD11b+CDR5ROhigh wykazuje ekspresję wielu markerów
mieloidalnych, więc mogłaby odpowiadać mysim mieloidalnym DC - CD8ą-.
225
Monika Ryba
5.1.3. Subpopulacje ludzkich dojrzałych komórek dendrytycznych w warunkach in
vitro
Poznanie subpopulacji ludzkich komórek dendrytycznych i ich ścieżek rozwoju jest moż-
liwe, nie w wyniku ich bezpośredniej izolacji z tkanek, ale dzięki licznym badaniom opartym
na hodowlach w warunkach in vitro. Dzięki nim powstał model rozwoju ludzkich komórek
dendrytycznych (ryc. 5.2). Różne populacje prekursorowe były używane i testowane w celu
otrzymania ludzkich komórek dendrytycznych w warunkach in vitro (tab. 5.1).
Tab. 5.1. Hodowle in vitro badające rozwój ludzkich komórek dendrytycznych(z
ródło: Shortman K
Nature Reviews Immunology 2002)
PREKURSOR WARUNKI HODOWLI WYHODOWANE DC
prekursory CD34+ z krwi hodowla płynna komórki przypominające śródmiąż-
pępowinowej i dorosłego GMCSF, TNFą szowe DC oraz przypominające ko-
szpiku kostnego mórki Langerhansa
prekursory CD34+ ze szpiku hodowla półpłynna dojrzałe komórki dendrytyczne (mDC)
GMCSF i TNFÄ…
pre-stymulacja ligandem
dla c-kit
prekursory limfoidalne hodowla płynna dojrzałe i niedojrzałe komórki dendry-
CD34+CD10+ ze szpiku dziewięć różnych cytokin tyczne o różnej morfologii
kostnego
monocyty krwi obwodowej hodowla płynna niedojrzałe DC i dojrzałe DC1
(pDC1) GMCSF i IL4
dojrzewanie z TNFÄ…
prekursory pDC2 hodowla płynna dojrzałe komórki DC2 CD11clow
(CD45RAhighCD11clowIL- IL3 i składniki bakteryjne
3Rhigh)
z krwi, migdałków i grasicy
Prekursory CD34+ izolowane ze szpiku czy krwi pępowinowej tworzą czyste kolonie ko-
mórek dendrytycznych w hodowlach półpłynnych. Hodowla z GMCSF i TNFą prowadzi do
różnicowania dwóch odrębnych subpopulacji komórek dendrytycznych  śródmiąższowych i
komórek Langerhansa Wśród prekursorów tej ścieżki różnicowania można wyróżnić komórki
bez lub z ekspresją antygenu CLA (cutaneous lymphocyte-associated antigen),dzięki któremu
komórki migrujÄ… do skóry (ryc. 5.2). Prekursory CLA+ sÄ… zależne od obecnoÅ›ci TGF-², co jest
zgodne z obserwacjami, że myszy z delecjÄ… genu dla TGF² nie produkujÄ… komórek Langer-
hansa. Prekursory CLA- majÄ… z kolei czÄ…steczkÄ™ CD14 i przypominajÄ… monocyty. Monocyty
krwi obwodowej (pDC1) są najczęściej używanymi prekursorami komórek dendrytycznych w
hodowlach in vitro. W obecności GMCSF zróżnicują się w makrofagi, ale jeśli do ich hodowli,
zawierającej GMCSF, doda się jeszcze IL4, to po ok. sześciu dniach powstają mieloidalne ko-
mórki dendrytyczne (DC1). Końcowy etap  dojrzewanie  osiąga się stymulując te komórki
cytokinami prozapalnymi np. TNFą lub składnikami bakteryjnymi. Dojrzewanie tej subpopu-
lacji może również spowodować interakcja tych komórek z limfocytem Th. Prekursory pDC2
są, jak już wcześniej wspomniano komórkami produkującymi duże ilości interferonów typu1 -
IPC (interferon-producing cell). Były poznane wcześniej niż ich mysie odpowiedniki, głównie
dzięki morfologii przypominającej komórkę plazmatyczną i ich unikatowy fenotyp:
226
Rozdział 5. Komórki dendrytyczne
CD4+CD123+CD11c-. Występują we krwi i tkance limfatycznej. Do węzłów chłonnych wnikają
przez żyłki HEV, charakteryzują się brakiem markerów charakterystycznych dla komórek linii
mieloidalnej i produkujÄ… mRNA dla Igº i receptora pre-TCR. Poza tym charakteryzujÄ… siÄ™ we-
wnątrzkomórkową ekspresją MHC klasy II (podobnie jak niedojrzałe DC). W obecności IL3 i
CD40L, lub pod wpływem stymulacji antygenowej stają się dojrzałymi komórkami dendry-
tycznymi. Ich  potomstwo (DC2), tak jak prekursory, nie mają markerów mieloidalnych, są
CD11c-, ale wykazują wszystkie charakterystyczne cechy dojrzałych DC.
Ryc. 5.2. Ścieżki różnicowania ludzkich komórek dendrytycznych
(z
ródło: Shortman K Nature Reviews Immunology 2002)
5.2. Dojrzewanie komórek dendrytycznych
Przebywając w tkance, komórki dendrytyczne stale i z dużą wydajnością pochłaniają
substancje z otoczenia na drodze endo lub/i pinocytozy. Właściwości fagocytarne nie są
zbytnio nasilone. Pochłonięte substancje są przetwarzane na peptydy i wiążą się z cząstecz-
kami MHC klasy II i ewentualnie klasy I. Takie bytujące w tkankach DC, monitorujące środo-
wisko nazywamy niedojrzałymi (iDC). Aktywacja komórek dendrytycznych pod wpływem
antygenu i/lub czynników produkowanych przez otaczające je komórki, prowadzi do wzbu-
dzenia ekspresji receptora CCR7, który pozwala im migrować do tkanki limfatycznej. Komórki
dendrytyczne, podczas migracji do węzła chłonnego, przekształcają się w nieodpowiadające
na antygeny dojrzałe formy. Zwiększają ekspresję cząsteczek kostymulujących i cząsteczek
MHC. W węz
le chłonnym, komórki dendrytyczne wchodzą w interakcje z innymi komórkami i
funkcjonalnie dojrzewają. Od tej pory są w stanie aktywować inne komórki. Dojrzewanie
227
Monika Ryba
komórek dendrytycznych, prowadzące do efektywnej prezentacji antygenów, jest zdarze-
niem, które wzbudza swoistą odpowiedz
immunologicznÄ…. Proces dojrzewania DC jest regu-
lowany przez kaspazy, dla których substratem są białka adaptorowe AP (Adaptor Protein).
Białka adaptorowe AP są, obok klatryny, drugim ważnym składnikiem pęcherzyków okrytych
klatryną, które są zaangażowane w ruch materiału z błony komórkowej do endosomów i z
TGN (Trans-Golgi Network) do błony komórkowej. W niedojrzałych komórkach dendrytycz-
nych białka AP1 i AP2 ulegają pocięciu przez kaspazę 3 i tracą swoje właściwości (ryc. 5.4).
Ryc. 5.3. Dojrzewanie komórki dendrytycznej
(z
ródło: Hackstein H Nature Reviews Immunology 2004)
W wyniku stymulacji antygenem (LPS) lub cytokinami prozapalnymi, aktywność kaspaz
jest zahamowana i białka AP mogą uczestniczyć w przebudowie przedziału endosomalnego.
Cząsteczki MHC klasy II obładowane peptydami przemieszczają się w kierunku powierzchni
błony komórkowej w nowo powstałych pęcherzykach endosomalnych. Białko AP-1 jest po-
trzebne do utrzymania cząsteczki HLA-DM i łańcucha niezmiennego w przedziałach we-
wnątrzkomórkowych podczas dojrzewania DC.
228
Rozdział 5. Komórki dendrytyczne
Ryc. 5.4. Zależna od kaspaz regulacja dojrzewania DC
(z
ródło: Jensen PE Nature Immunology 2005)
5.2.1. Rola receptora CCR7 i migracja komórek dendrytycznych
Receptor CCR7 jest odpowiedzialny za mobilizację komórek dendrytycznych do tkanki
limfatycznej. Niedojrzałe komórki dendrytyczne mają na swojej powierzchni receptory dla
chemokin, które lokalizują je w tkance obwodowej. W wyniku endocytozy patogenu, komór-
ki dendrytyczne zwiększają ekspresję CCR7, z którym wiążą się produkowane w węz
le chłon-
nym chemokiny CCL19 i CCL21 (ryc. 5.5).
Ryc. 5.5. Dojrzewanie komórki dendrytycznej pod wpływem chemokin CCL19 i CCL21
(z
ródło: Bachmann MF Nature Reviews Immunology 2006)
Poza kierowaniem komórek dendrytycznych do węzłów chłonnych, chemokiny przeka-
zują sygnał prowadzący do dalszego dojrzewania komórki dendrytycznej.
229
Monika Ryba
Receptor CCR7 jest receptorem siedem razy przechodzącym przez błonę i należy do ro-
dziny receptorów związanych z białkiem G. Białka G składają się z trzech polipeptydów: pod-
jednostki Ä…, która wiąże i hydrolizuje GTP, oraz z podjednostek ² i Å‚ tworzÄ…cych dimer. Znane
są cztery rodziny podjednostek ą białka G: Gąs, Gąq, Gąi i Gą12. W wyniku wiązania liganda z
receptorem CCR7 dochodzi przynajmniej do dwóch niezależnych kaskad sygnałowych (ryc.
5.6). Pierwsza jest inicjowana przez aktywację białka Gą12. Skutkuje ona uwolnieniem wolne-
go dimeru ²Å‚, który aktywuje nastÄ™pnie biaÅ‚ka efektorowe, takie jak GTPazy Rho, kinazÄ™ Pyk i
białko wiążące aktynę  kofilinę. Ścieżka ta ostatecznie reguluje prędkość migracji komórki
dendrytycznej, ale nie chemotaksjÄ™. Chemotaksja jest regulowana przede wszystkim przez
biaÅ‚ko GÄ…i. Aktywacja GÄ…i indukowana w wyniku wiÄ…zania GTP do GÄ…i i uwolnienia dimeru ²Å‚
rozpoczyna kaskadę sygnalizacyjną w komórce i aktywację kinaz MAP (p38, Erk1/2 i Jnk).
Dodatkowo wolny dimer ²Å‚ aktywuje PI3K, PKC i Å›cieżkÄ™ Akt-NFºB których uruchomienie jest
niezbędne do aktywacji i przeżycia komórki. Poza tym w wyniku aktywacji fosfolipazy C do-
chodzi do uwolnienia jonów Ca2+. Zaraz po aktywacji ścieżki zależnej od białka Gąi może
dojść do uruchomienia trzeciej Å›cieżki zależnej od biaÅ‚ka GÄ…q. PowstaÅ‚y wolny dimer ²Å‚ akty-
wuje fosfolipazÄ™ ²1,3 prowadzÄ…c do dalszej produkcji IP3 i uwolnienia jonów Ca2+. Ektoen-
zym CD38 może działać jako koadjuwant tej ścieżki katalizując reakcję przemiany NAD do
cADP-rybozy (cADPR), która działając dalej na receptory rianodynowe (RyR) wyzwala dalsze
uwolnienie wapnia. Dochodzi do otworzenia błonowych kanałów wapniowych i uwolnienia
jonów Ca2+ na zewnątrz, co jest niezbędne do prawidłowej migracji komórek dendrytycz-
nych.
Ryc. 5.6. Ścieżki sygnalizacyjne prowadzące do migracji komórki dendrytycznej
(z
ródło: Randolph GJ Annual Reviews in Immunology 2008)
Komórki dendrytyczne mieloidalne wnikają do węzłów chłonnych naczyniem limfatycz-
nym doprowadzającym, natomiast plazmacytoidalne komórki dendrytyczne, podobnie jak
limfocyty T i B, przez żyłki z wysokim śródbłonkiem. Oprócz receptora CCR7 pDC charaktery-
zują się również ekspresją CD62L.
230
Rozdział 5. Komórki dendrytyczne
5.3. Receptory komórek dendrytycznych
Niedojrzałe komórki dendrytyczne monitorują środowisko używając receptorów rozpo-
znających wzorce molekularne patogenów (PRR). Są to głównie receptory TLR (opisane w
rozdziale 1) oraz receptory lektynowe typu C (CLR). Na komórkach dendrytycznych wykazano
obecność co najmniej czterech typów TLR: TLR3, TLR7, TLR8 i TLR9. Receptory TLR rozpozna-
ją pewne charakterystyczne struktury patogenów (LPS, kwasy nukleinowe) i przesyłają do
komórki sygnał, który prowadzi do dojrzewania DC oraz indukcji produkcji cytokin (ryc. 5.7).
Receptory CLR rozpoznają pewne charakterystyczne struktury węglowodanowe, będące
składnikami patogenów, i inicjują proces internalizacji tego patogenu, prowadzący dalej do
jego degradacji i prezentacji w postaci peptydów na cząsteczkach MHC (ryc. 5.7). W tab. 5.2
przedstawiono ekspresję receptorów TLR i CLR na różnych subpopulacjach komórkek den-
drytycznych.
Ryc. 5.7. Receptory komórek dendrytycznych
(z
ródło: van Kooyk Y Nature Reviews Immunology 2003)
Tab. 5.2. Ekspresja receptorów clr i tlr na komórkach dendrytycznych (z
ródło: van Kooyk Y Nature
Reviews Immunology 2003)
Subpopulacja DC CLR TLR
Krew obwodowa
Plazmacytoidalne DC BDC2A TLR7
dektyna-1 TLR9
Mieloidalne DC DC-SIGN TLR1
DEC205 TLR2
TLR3
TLR4
Tkanki
Komórki Langerhansa langeryna
231
Monika Ryba
Inne DC wywodzÄ…ce siÄ™ z linii MGL1 TLR1
monocytarnej DC-SIGN TLR2
receptor dla mannozy TLR3
CLEC1 TLR4
DEC205 TLR5
DECAL
DCIR
5.3.1. Receptory lektynowe typu C
Receptory lektynowe typu C wiążą reszty cukrowe w mechanizmie zależnym od wapnia,
używając wysoko konserwowanych domen rozpoznających węglowodany  CRD (Carbohy-
drate Recognition Domain).
Ryc. 5.8. Przykłady receptorów lektynowych typu C
(z
ródło: Figdor CG Nature Reviews Immunology 2002)
Domeny CRD zawierają, niezbędne w łączeniu się z ligandem, kieszonki wiążące wapń.
Receptory lektynowe typu C występują albo jako białka śródbłonowe, albo jako rozpuszczal-
ne. Do form rozpuszczalnych należą białka surfaktantu płucnego SP-A i SP-D, które są kolek-
tynami wydzielanymi przez pneumocyty typu II oraz białko wiążące mannozę MBP  kolekty-
232
Rozdział 5. Komórki dendrytyczne
na obecna w osoczu. Scharakteryzowano różne formy śródbłonowe receptorów lektynowych
typu C, z których część ulega ekspresji tylko na komórkach dendrytycznych. Rozróżnia się
dwie grupy receptorów CLR na komórkach dendrytycznych  typu I (koniec aminowy wystaje
z komórki) i typu II (koniec aminowy jest w cytoplazmie).
Receptory typu I zawierajÄ… kilka domen CRD lub CRD-podobnych, natomiast zidentyfikowa-
ne do tej pory receptory typu II mają jedną domenę CRD na końcu karboksylowym (ryc. 5.8).
Receptor MMR (Macrophage Mannose Receptor, CD206) jest prototypowym przedsta-
wicielem receptorów typu 1. Na końcu aminowym zawiera powtórzenia bogate w cysteinę
(ryc. 5.8), powtórzenie fibronektynowe typu II i 8 domen CRD. Wiązanie liganda jest możliwe
dzięki domenie CRD4 i CRD5. Domeny cytoplazmatyczne receptorów lektynowych typu C
wykazują różnorodność i zawierają różne konserwowane motywy białkowe istotne w po-
chłanianiu antygenu: motyw tyrozynowy, triadę kwaśnych aminokwasów i motyw leucyno-
wy. Oprócz tego, receptory typu II mogą zawierać też inne motywy sygnalizacyjne (ITIM,
ITAM, czy regiony bogate w prolinÄ™ (PPP)).
5.3.1.1. Ekspresja receptorów CLR na komórkach dendrytycznych
Ogólna charakterystyka receptorów CLR została przedstawiona w tab. 5.3.
Tab. 5.3. Charakterystyka receptorów lektynowych typu C (z
ródło: Figdor CG Nature Reviews Immu-
nology 2002)
Nazwa Aminokwasy Chromosom Występo- Ligand Funkcja
wanie
MMR 1456 10p13 DC, LC, Mo, mannoza, pochłanianie
(CD206) MØ fukoza antygenu
DEC-205 1722 2q24 DC, LC, ? pochłanianie
(CD205) aktywowa- antygenu
ne DC
Dektyna 1 247 12p13 DC, LC ²-glukan interakcje z lim-
I focytem
Dektyna 2 209 2p13 DC, LC ? pochłanianie
I antygenu
Langeryna 328 2p13 LC ? tworzenie ziarni-
(CD207) I stości Birbecka
DC-SIGN 404 19p13 DC HIV1 (gp120), interakcje z lim-
(CD209) I SIV, mannan, focytemT pato-
ICAM2, ICAM3 logia HIV1, mi-
gracja pochła-
nianie antygenu
BDCA2 ? ? pDC ? pochłanianie
I antygenu?
DCIR 237 12p13 DC, ? ?
(LLIR) I Mo, MØ, B
DLEC 231 12p13
CLEC1 229 12 DC ? ?
I
[DC  komórka dendrytyczna; LC  komórka Langerhansa; pDC  plazmacytoidalna komórka dendry-
tyczna; Mo  monocyt; MØ  makrofag; B  limfocyt B]
233
Monika Ryba
Istnieją dowody, które potwierdzają różny poziom ekspresji receptorów C  lektyno-
wych na różnych subpopulacjach komórek dendrytycznych. Komórki dendrytyczne krwi ob-
wodowej, komórki Langerhansa oraz DC otrzymane z monocytów w warunkach in vitro cha-
rakteryzują się niską ekspresją DEC-205, która jednak wzrasta po aktywacji. Świadczy to o
udziale DEC-205 w procesie aktywacji komórek dendrytycznych. Z kolei niedojrzałe komórki
dendrytyczne pochodzenia monocytarnego majÄ… wysokÄ… ekspresjÄ™ MMR i DC-SIGN, ale ich
produkcja spada w trakcie dojrzewania komórek. W świeżo izolowanych obwodowych DC i
komórkach Langerhansa nie wykrywa się ekspresji MMR, a ekspresja DC-SIGN jest wykry-
walna tylko w małej subpopulacji obwodowych DC. Receptor DCIR jest produkowany przez
mieloidalne komórki dendrytyczne CD14+ . Zaobserwowano, że jego ekspresja również spada
wraz z dojrzewaniem komórki. Podobnie jest w przypadku receptora plazmacytoidalnych
komórek dendrytycznych - BDCA2.
5.3.1.2. Funkcje receptorów CLR
Śródbłonowe receptory C-lektynowe biorą udział w pochłanianiu antygenu w celu jego
degradacji do peptydów i ich ulokowania w rowku cząsteczek MHC. Formy rozpuszczalne
receptorów lektynowych (np. kolektyny) działają jako opsoniny, ułatwiając fagocytozę lub
mogą odgrywać rolę w transporcie antygenów. Kilkanaście śródbłonowych form receptorów
C-lektynowych obecnych na komórkach dendrytycznych uczestniczy w endocytozie. Po zwią-
zaniu antygenu i  przetransportowaniu go do wczesnych endosomów, receptor MMR w
formie nienaruszonej powraca na powierzchnię błony komórkowej gdzie może znów wy-
chwytywać patogeny , które następnie ulegają internalizacji. Do internalizacji wymagany jest
białkowy motyw obecny w części cytoplazmatycznej tego receptora (ryc. 5.8). W wyniku ob-
róbki pochłoniętego antygenu dochodzi do jego efektywnej prezentacji przez komórki den-
drytyczne. W przeciwieństwie do MMR, receptor DEC-205 transportuje antygeny od razu do
póz
nych endosomów lub lizosomów, gdzie dochodzi do ich degradacji. Cytoplazmatyczna
domena DEC-205 zawiera dwa funkcjonalne regiony  proksymalnie leżący region zawierają-
cy tyrozynę - potrzebny do internalizacji oraz dystalnie położony region zawierający triadę
kwaśnych aminokwasów  potrzebny do przetransportowania antygenu do proteolitycznych
wakuoli. Podobny mechanizm może funkcjonować w przypadku receptora DC-SIGN, który
oprócz motywów tyrozynowego i leucynowego zawiera również triadę aminokwasową po-
dobną do tej występującej w receptorze DEC-205. Tak więc MMR, DEC-205, DC-SIGN i praw-
dopodobnie BDCA2 uczestniczÄ… w wychwytywaniu i prezentacji antygenu (ryc. 5.9b). Badania
nad receptorem DC-SIGN pokazują, że bierze on udział w interakcjach komórek dendrytycz-
nych z limfocytami T. Podobnie, dektyna 1 może uczestniczyć w interakcjach DC-T (ryc. 5.9a)
Receptory MMR i DC-SIGN mogą być również wydzielane w formie rozpuszczalnej (ryc. 5.9c)
pełniąc funkcję opsonin. W końcu MMR, tak jak selektyny, może wiązać sulfonowane wę-
glowodany np. sLeX, przez co odgrywa rolę w migracji komórek dendrytycznych (ryc. 5.9d).
234
Rozdział 5. Komórki dendrytyczne
Ryc. 5.9. Funkcje receptorów lektynowych typu C na komórkach dendrytycznych
(z
ródło: Figdor CG Nature Reviews Immunology 2002)
5.3.2. Współdziałanie receptorów TLR i receptorów CLR w regulacji odpowiedzi
immunologicznej
Równowaga między stopniem aktywacji receptorów TLR, a receptorów lektynowych ty-
pu C na komórkach dendrytycznych kieruje różnicowaniem tych komórek, jednocześnie de-
cydując o typie odpowiedzi immunologicznej. Rozpoznanie własnego antygenu przez recep-
tor CLR, przy braku aktywacji receptora TLR, prowadzi do jego przetworzenia, z tym że ko-
mórka dendrytyczna nie otrzymuje żadnych sygnałów, które prowadziłyby do jej aktywacji, a
dalej dojrzewania. Skutkuje to indukcjÄ… tolerancji (ryc. 5.10A). Podczas odpowiedzi zapalnej,
dochodzi do aktywacji komórek dendrytycznych i ich dojrzewania w wyniku stymulacji recep-
tora TLR (np. przez LPS).
235
Monika Ryba
Ryc. 5.10. Współdziałanie receptorów CLR I TLR w regulacji odpowiedzi immunologicznej
(z
ródło: Geijtenbeek TH Annu Rev Immunol 2004)
Jednoczesne pochwycenie własnego antygenu przez CLR doprowadzi do wzbudzenia au-
toreaktywnych limfocytów T, co z kolei może prowadzić do rozwoju autoimmunizacji (ryc.
5.10B). Rozpoznanie patogenu np. Mykobakterii przez oba receptory jednocześnie, będzie
prowadzić do aktywacji odpowiedzi immunologicznej gdy sygnał z receptora TLR będzie sil-
niejszy niż sygnał z receptora CLR. To może mieć miejsce gdy małe ilości patogenu zwiążą
CLR (ryc. 5.10C). Jeśli duże ilości patogenu zwiążą się z receptorem CLR, sygnał  tolerancji z
receptora CLR będzie silniejszy niż sygnał indukowany przez TLR. Dojdzie do zatrzymania róż-
nicowania komórki dendrytycznej, supresji immunologicznej i przeżycia patogenu (ryc.
5.10D).
5.3.3. Udział receptora DC-SIGN w infekcji wirusem HIV
236
Rozdział 5. Komórki dendrytyczne
Jak już wiadomo, niedojrzałe komórki dendrytyczne z pochwyconymi w tkance obwo-
dowej (skóra, śluzówka) antygenami migrują do obwodowych narządów limfatycznych. Jako
dojrzałe komórki dendrytyczne, prezentują one antygeny naiwnym limfocytom T aktywując
je i inicjujÄ…c swoistÄ… odpowiedz
immunologiczną. Komórki dendrytyczne przebywające w
śluzówce charakteryzują się wysoką ekspresją receptora DC-SIGN, który między innymi, wią-
że białko kapsydu wirusa HIV  gp120 (ryc. 5.11a). Wirus HIV, który zostaje pochwycony
przez komórkę dendrytyczną, nie ulega degradacji prowadzącej do przetworzenia go na pep-
tydy, lecz po dotarciu do węzłów chłonnych w komórce dendrytycznej (ryc. 5.11b) zostaje w
całości  przekazany limfocytowi T CD4+ (ryc. 5.11c). Receptor DC-SIGN, w przeciwieństwie do
CD4 i CCR5, które umożliwiają wirusowi HIV zakażenie i wzmacniają niejako etap jego wnika-
nia do komórki, służy, wraz z niosącą go na swojej powierzchni komórką dendrytyczną, jako
swego rodzaju środek transportowy, dzięki któremu wirus może zakażać komórki docelowe 
limfocyty T CD4+. Co ciekawe, zauważono, że gdy komórki dendrytyczne DC-SIGN+ były inku-
bowane w pożywce zawierającej żywe wirusy HIV, to po wypłukaniu niezwiązanych wirusów
jeszcze przez co najmniej 4 dni były one zdolne do zakażania limfocytów T.
Ryc. 5.11. Udział komórek dendrytycznych w zakażeniu wirusem HIV
(z
ródło: Figdor CG Nature Reviews Immunology 2002)
237
Monika Ryba
5.4. Funkcja immunoregulacyjna komórek dendrytycznych
5.4.1. Udział komórek dendrytycznych w polaryzacji odpowiedzi immunologicznej
Ryc. 5.12. Udział DC w różnicowaniu limfocytów Th1 i Th2
(z
ródło: Kapsenberg ML Nature Reviews Immunology 2003)
Polaryzacja limfocytów Th została już opisana w rozdziale 3. Tu zajmiemy się rolą komó-
rek dendrytycznych w różnicowaniu subpopulacji efektorowych limfocytów Th (ryc. 5.12).
Zidentyfikowano wiele czynników produkowanych przez komórki dendrytyczne, pod
wpływem patogenu, które kierują rozwojem odpowiedzi limfocytów Th. Do czynników
wzbudzajÄ…cych odpowiedz
typu 1 można zaliczyć członków rodziny cytokin IL12 (IL12, IL23 i
IL27), interferony typu 1 oraz czÄ…steczkÄ™ ICAM1. Czynniki indukujÄ…ce odpowiedz
typu 2 pro-
dukowane przez DC to np. MCP1 czy OX40L. Większość czynników  polaryzujących , po roz-
poznaniu antygenu przez komórki dendrytyczne, ulega w nich słabej albo przejściowej eks-
presji. By doszło do produkcji dużej ilości tych czynników wymagana jest ścisła interakcja
komórki dendrytycznej z limfocytem T i udział cząsteczek kostymulujących CD40 na DC i
CD40L na limfocycie T. Sygnały 1 i 2 są niezbędne do wzbudzenia ekspresji CD40L na limfocy-
cie T (ryc. 5.12).
Tab.5.4. Czynniki tkankowe indukujÄ…ce odpowiedz
typu 1 I 2
Czynnik tkankowy Typ 1 Typ2
Cytokiny IFNÄ…/², IFNÅ‚, IL12, TNF², IL18, IL4, IL5, IL9, IL13, IL25
IL27
Chemokiny CXCL9, CXCL10, CCL21 CCL2, CCL7, CCL8, CCL13, CCL17
Czynniki kostymulujÄ…ce ICAM1 OX40L
Inne prostanglandyna E2, histamina
Niewątpliwie, zarówno bezpośrednia reakcja komórki dendrytycznej z patogenem (roz-
poznanie PAMP) jak również kontakt z czynnikami produkowanymi przez tkankę (tab. 5.4)
238
Rozdział 5. Komórki dendrytyczne
wpływają na kierunek obrany przez układ immunologiczny i sterują rozwojem odpowiedzi
immunologicznej w kierunku Th1 lub Th2 (ryc. 5.13).
Ryc. 5.13. Polaryzacja odpowiedzi immunologicznej z udziałem DC
(z
ródło: Kapsenberg ML Nature Reviews Immunology 2003)
Do niedawna sądzono, że rozpoznanie PAMP przez odpowiedni TLR zawsze skutkuje
rozwojem odpowiedzi Th1. Jednak coraz więcej danych wskazuje, że komórki dendrytyczne
dojrzewające pod wpływem ligacji receptora TLR2 mogą promować inne typy odpowiedzi
immunologicznej.
TLR2 ulega ekspresji na większości komórek dendrytycznych CD11chigh, a jego ligandy
mogą wzbudzać różne typy odpowiedzi. Bakteryjne lipoproteiny wiążą się TLR2, który na-
stępnie zaczyna tworzyć heterodimery z receptorem TLR 1. Prowadzi to do produkcji głównie
IL12.
Głównym ligandem dla TLR3 jest dwuniciowy RNA, który silnie pobudza komórki den-
drytyczne do polaryzacji odpowiedzi immunologicznej w kierunku Th1. Aktywowane DC pro-
dukują IL12 i interferony typu 1. TLR4, którego ligandem jest LPS, podobnie indukuje produk-
cjÄ™ IL12.
Innymi receptorami TLR indukujÄ…cymi odpowiedz
typu 1 sÄ…:
TLR7 i TLR9. Ligacja TLR7 doprowadza do produkcji IL12 przez komórki dendrytyczne
CD11chigh i IFNą przez plazmacytoidalne DC. TLR9 u ludzi występuje tylko w plazmacytoidal-
nych komórkach dendrytycznych (u myszy również w mieloidalnych DC). Ligacja TLR9 pro-
wadzi do produkcji IFNÄ… i IL12.
239
Monika Ryba
5.4.2. Indukcja fenotypu regulatorowego i tolerancja immunologiczna
Komórki dendrytyczne indukują i utrzymują tolerancję immunologiczną, zarówno w gra-
sicy jak i na obwodzie. Utrzymanie tolerancji w grasicy zależy od występujących tam dojrza-
łych komórek dendrytycznych, które są niezbędne w delecji tymocytów, mających autoreak-
tywne receptory TCR oraz indukcji naturalnych limfocytów T regulatorowych
CD4+CD25+Foxp3+ (ryc. 5.14a).
Ryc. 5.14. Mechanizmy tolerancji immunologicznej w grasicy (a) i na obwodzie (b) (z
ródło: Kyewski
B Nature Reviews Immunology 2004; Banchereau J Nature Reviews Immunology 2005)
W tolerancji obwodowej biorą udział niedojrzałe komórki dendrytyczne. Prezentują one
antygeny naiwnym limfocytom T bez odpowiedniej kostymulacji, prowadzÄ…c do anergii lub
delecji autoreaktywnych limfocytów T albo do rozwoju indukowanych limfocytów T regula-
torowych (ryc. 5.14b).
5.4.2.1. Niedojrzałe, półdojrzałe i dojrzałe komórki dendrytyczne
Lutz i Schuler [15] przedstawiają inny podział komórek dendrytycznych, ze względu na
ich zdolność do indukowania tolerancji obwodowej i odpowiedzi immunologicznej. Uważają
oni, że komórki dendrytyczne występujące w trzech lokalizacjach (tkanki, krew/limfa i węzły
chłonne) różnią się właściwościami i funkcją (ryc. 5.15). Subpopulację migrujących komórek
dendrytycznych określają jako półdojrzałą. Półdojrzałe DC mają, podobnie jak dojrzałe DC
wysokÄ… ekspresjÄ™ czÄ…steczek MHC klasy II oraz czÄ…steczek kostymulujÄ…cych, jednak nie pro-
dukują wystarczającej ilości cytokin prozapalnych. Pomimo zmiany fenotypu komórki te w
dalszym ciągu nie mogą wywołać aktywacji limfocytów T, nawet jeśli dobrze prezentują an-
tygen. Wczesne zetknięcie się antygenu z niedojrzałymi DC we krwi lub w tkankach nie po-
240
Rozdział 5. Komórki dendrytyczne
zwala na jego właściwą prezentację limfocytom T. Subpopulacji półdojrzałych komórek den-
drytycznych przypisuje się rolę w indukowaniu rozwoju limfocytów regulatorowych produku-
jących IL10 (Tr). Niedojrzałe komórki dendrytyczne, które jak wiadomo, nie posiadają lub
charakteryzujÄ… siÄ™ bardzo niskÄ… ekspresjÄ… czÄ…steczek kostymulujÄ…cych, prowadzÄ… do anergii
limfocytów T. Dopiero w pełni dojrzałe DC są zdolne do indukcji odpowiedzi immunologicz-
nej.
Ryc. 5.15. Niedojrzałe, półdojrzałe i dojrzałe komórki dendrytyczne
(z
ródło: Lutz MB Trends in Immunology 2002)
5.4.2.1.1. Wytwarzanie tolerogennych komórek dendrytycznych w warunkach in
vitro
Na ryc. 5.16 przedstawiono dwie strategie wytwarzania tolerogennych komórek dendry-
tycznych w warunkach in vitro, które po podaniu, już w warunkach in vivo, mogą indukować
anergiczne i regulatorowe limfocyty T.
241
Monika Ryba
Ryc. 5.16. Powstawanie tolerogennych komórek dendrytycznych w warunkach in vitro
(z
ródło: Hackstein H Nature Reviews Immunology 2004)
Niedojrzałe komórki dendrytyczne z niską ekspresją MHC klasy II i cząsteczek kostymulu-
jÄ…cych, niezdolne do produkcji cytokin prozapalnych i indukujÄ…ce anergiczne limfocyty T
otrzymuje się stosując inhibitory dojrzewania komórek dendrytycznych, takie jak kortykoste-
roidy, witaminÄ™ D3, IL10 czy inhibitor czynnika NF8
B  analogu 15-deoxypergualiny  LF15-
0195 (ryc. 5.16a). Tolerogenne, półdojrzałe komórki dendrytyczne można wyhodować stosu-
jąc kombinację czynników, które promują dojrzewanie fenotypowe DC (TNF, LPS) z czynni-
kami hamujÄ…cymi funkcjonalne dojrzewanie DC (IL10, TGF). Prowadzi to do blokady produk-
cji cytokin prozapalnych przez te komórki i daje im zdolność indukcji limfocytów T regulato-
rowych (ryc. 5.16b).
5.4.2.2. IDO
Indoleamina 2,3-dioksygenazy (IDO) to enzym ułatwiającego degradację tryptofanu
wewnątrz komórek. Ostatnie badania wskazują, że komórki z ekspresją tego enzymu mogą
hamować odpowiedz
limfocytów T i promować tolerancję immunologiczną. U ssaków wy-
stępują dwa geny kodujące enzymy, które katalizują degradację tryptofanu: IDO i 2,3-
dioksygenaza tryptofanu (TDO). Oba enzymy katalizujÄ… tÄ… samÄ… reakcjÄ™, a mianowicie utle-
nienie indolowego pierścienia tryptofanu. TDO jest enzymem występującym głównie w wą-
trobie i wydaje się, że jego ekspresja nie jest regulowana przez komórki układu immunolo-
gicznego. Komórki z ekspresją IDO występują w wielu tkankach, a poziom samego enzymu
jest regulowany przez sygnały wysyłane przez układ immunologiczny. Pierwotne białko (apo-
enzym) jest kodowane przez pojedynczy gen (10 egzonów) leżący na chromosomie 8 (ryc.
5.17).
242
Rozdział 5. Komórki dendrytyczne
Ryc. 5.17. IDO  regulacja ekspresji i aktywność
(z
ródło: Mellor AL Nature Reviews Immunology 2004)
Transkrypcja genu kodującego IDO jest ściśle kontrolowana i odpowiada tylko na okre-
ślone czynniki prozapalne, a ekspresja jest zarezerwowana tylko dla niektórych komórek.
Promotor genu IDO zawiera sekwencje, będące elementami odpowiedzi stymulowanej przez
interferon (ISRE) oraz sekwencje GAS (ł-activating sequence). Różne komórki, włączając DC,
fibroblasty czy też niektóre linie nowotworowe, włączają ekspresję IDO po stymulacji IFNł.
Białka STAT1 i IRF1 (IFN-regulatory factor 1) uczestniczą wspólnie w zależnej od IFNł indukcji
ekspresji IDO. Jak dotÄ…d, nie znane sÄ… represory transkrypcji genu kodujÄ…cego IDO, ale ze
względu na ograniczoną ekspresję tego białka, na pewno takie występują. Związanie proste-
tycznej grupy hemowej oraz prawdopodobnie modyfikacje potranslacyjne holoenzymu czy-
niÄ… IDO aktywnym enzymem katalizujÄ…cym reakcjÄ™ degradacji tryptofanu. Tryptofan jest nie-
zbędny do proliferacji limfocytów T. Metabolity, które powstają podczas jego rozpadu  ki-
nurenina czy kwas 3-OH antranilowy działają immunosupresyjnie.
5.4.2.2.1. IDO jako czynnik indukujÄ…cy fenotyp tolerogenny
Biorąc pod uwagę dotychczasowe rozważania dotyczące wzbudzania tolerancji przez
niedojrzałe/półdojrzałe komórki dendrytyczne, zgodnie z tym co powiedzieliśmy przed chwi-
lą, ekspresja IDO powinna ujawniać się tylko w niedojrzałych komórkach dendrytycznych.
Jednakże, jak się okazuje niektóre komórki dendrytyczne IDO+ mają dojrzały fenotyp. Sugeru-
je to, że proces dojrzewania i decyzja czy w danej komórce dojdzie do ekspresji IDO są od
243
Monika Ryba
siebie niezależne. Postuluje się, że regulacja odpowiedzi immunologicznej w której uczestni-
czy IDO najpierw wymaga istnienia niedojrzałych komórek dendrytycznych zdolnych, ale fi-
zycznie nie wykazujÄ…cych ekspresji IDO (IDO-kompetentne). Niewiadomo, czy jest to tylko
pewna specyficzna subpopulacja DC, czy też kolejny etap dojrzewania wielu typów komórek
dendrytycznych. Podczas lub może nawet skończywszy proces dojrzewania, IDO-
kompetentna komórka dendrytyczna może otrzymać jeden z dwóch sygnałów, prowadzą-
cych do dwóch różnych końcowych fenotypów (ryc. 5.18).
Ryc. 5.18. Dojrzewanie IDO-kompetentnych komórek dendrytycznych
(z
ródło: Mellor AL Nature Reviews Immunology 2004)
Sygnał tolerogeny, w wyniku ligacji cząsteczek CD80/CD86 na DC przez receptor CTLA4
na limfocytach Treg CD4+CD25+, wzbudzałby ekspresję IDO, czyniąc komórkę dendrytyczną
zdolną do indukowania tolerancji. Z kolei sygnały immunogenne, takie jak ligacja CD40 z
CD40L na limfocycie Th, czy wpływ cytokin prozapalnych, obniżałyby ekspresję IDO, prowa-
dząc do utraty przez komórki dendrytyczne zdolności tolerogennych. Badania z użyciem inhi-
bitora IDO i myszy IDO-/- pokazały, że praktycznie jedyna widoczna różnica między fenotypem
immunogennym a tolerogennym to ekspresja IDO. Oczywiście może to być zbyt duże uprosz-
czenie, gdyż blokada IDO często skutkuje zaburzeniami w zdolności do stymulacji limfocytów
T. Dlatego, przypuszcza się, że oba fenotypy  immunogenny i tolerogenny mogą dotyczyć
dojrzałych APC, lecz pełniących dwie przeciwstawne funkcje.
5.5. Plazmacytoidalne komórki dendrytyczne
Jak już powiedziano wcześniej plazmacytoidalne komórki dendrytyczne (pDC) zwane
również IPC (Interferon Producing Cells) są populacją komórek dendrytycznych pochodzenia
limfoidalnego o cechach morfologicznych charakterystycznych dla komórek plazmatycznych.
244
Rozdział 5. Komórki dendrytyczne
Charakteryzują się ekspresją receptorów TLR7 i TLR9 oraz są wyspecjalizowane w wydziela-
niu dużych ilości interferonów typu 1 w odpowiedzi przeciwwirusowej. pDC stanowią 0,2-
0,8% jednojądrzastych komórek krwi obwodowej, w póz
nym etapie odpowiedzi immunolo-
gicznej pDC różnicują się w subpopulację dojrzałych DC2 (ryc. 5.2), które w sposób bezpo-
średni mogą regulować funkcje limfocytów T .
5.5.1. Fenotyp powierzchniowy ludzkich pDC i produkcja cytokin
Tab. 5.5. Charakterystyka pDC
Fenotyp pDC/IPC Monocyty CD11c+ niedojrzałe DC
MARKER MIELOIDALNY
CD11b - + +
CD11c - + +
CD13 - + +
CD14 - + -
CD33 - + +
MARKER LIMFOIDALNY
Pre-TÄ… + - -
Ig1-like 14.1 + - -
Spi-B + - -
PRR
TLR1 + ++ +
TLR2 - ++ +
TLR3 - - ++
TLR4 - ++ +
TLR5 - + +
TLR6 + + +
TLR7 ++ - -
TLR8 - ++ ++
TLR9 ++ - -
TLR1 + - +
Receptor dla mannozy - +/- +/-
BDC2A + - -
CD1 - +/- +/-
INNE MARKERY
CD4 ++ + +
CD45RA + - -
CD45RO - + +
IL3R +++ + +
GMCSFR + ++ ++
FUNKCJA
produkcja IFNÄ…/² ++++ + +
produkcja IL12 - ++ ++
fagocytoza - ++ ++
Ludzkie pDC/IPC nie mają ekspresji żadnych markerów charakterystycznych dla którejś
ze znanych populacji komórek układu immunologicznego (CD19, TCR, CD3, CD14, CD16,
245
Monika Ryba
CD56, CD11c). Nie wykazują również aktywności fagocytarnej. Wszystko to sugeruje, że pDC
stanowią niezależną linię komórkową w układzie immunologicznym. Ogólną charakterystykę
tych komórek i porównanie z monocytami i niedojrzałymi komórkami dendrytycznymi po-
chodzenia mieloidalnego przedstawiono w tab. 5.5.
5.5.2.Produkcja cytokin
W wyniku zakażenia wirusowego pDC/IPC w ciągu 24h produkują olbrzymie ilości inter-
feronów typu 1 (3-10 pg/komórkę), co stanowi od 100 do 1000 razy więcej od jakiejkolwiek
innej subpopulacji komórek układu immunologicznego. Odpowiedz
przeciwwirusowa i pro-
dukcja IFN typu I przez plazmacytoidalne komórki dendrytyczne ma następujące cechy:
podczas infekcji wirusowej pDC wykorzystują TLR7 i TLR9 (ekspresja w błonie endosomu)
sygnalizacja przez receptory TLR indukuje syntezę INF typu 1 i prowadzi do różnicowania pDC
w dojrzałe komórki dendrytyczne (ryc. 5.19)
mRNA dla IFN typu I jest wykrywalny w komórkach pDC dopiero po ok. 4h od zakażenia wiru-
sowego, i osiąga największy poziom po ok. 12h.
między 6 a 12godziną od zakażenia, ok. 50% całkowitego mRNA koduje interferony typu 1
wÅ‚Ä…czajÄ…c wszystkie odmiany IFNÄ…, IRFN², IFN, IFNÉ i IFNÄ
w pierwszych 24h od zakażenia wirusowego pDC produkują głównie IFNą
po 24h pDC produkują umiarkowane ilości IFNą i stają się oporne na powtórną stymulację
tym samym wirusem
w przebiegu infekcji wirusowej pDC produkują umiarkowane ilości TNFą i IL6, ale nie produ-
kujÄ… IL-1Ä…, IL-1², IL-3, IL-10, IL-15, IL-18, IFNÅ‚ czy GMCSF.
ludzkie pDC/IPC mają ograniczoną zdolność do produkcji IL12
246
Rozdział 5. Komórki dendrytyczne
Ryc. 5.19. Odpowiedz
IPC na zakażenie wirusowe
(z
ródło: Liu YJ Annual Reviews of Immunology 2005)
5.5.3. Różnicowanie pDC w dojrzałe komórki dendrytyczne
pDC/IPC charakteryzujÄ… siÄ™ niskÄ… ekspresjÄ… czÄ…steczek MHC klasy II i niewykrywalnÄ… eks-
presjÄ… czÄ…steczek kostymulujÄ…cych B7 dlatego nie sÄ… one zdolne do indukcji proliferacji lim-
focytów T. Wyniki badań in vitro sugerują, że dwie ścieżki różnicowania uczestniczą w doj-
rzewaniu pDC/IPC. Pierwsza jest zależna od IL3. Ludzkie pDC, mające wysoką ekspresję re-
ceptora dla IL3, różnicują się w dojrzałe komórki dendrytyczne w hodowlach z IL3 lub IL3 i
CD40L. Druga ścieżka jest zależna od IFNą i TNFą. Sygnalizacja przez receptory TLR7 I TLR9
prowadzi do produkcji IFNą i TNFą - cytokin, które indukują dojrzewanie pDC. Stwierdzono,
że dojrzałe DC powstałe z pDC pod wpływem IL3 i CD40L aktywują limfocyty Th do produkcji
IL4, IL5 i IL10. Natomiast dojrzałe DC powstałe z pDC stymulowanych wirusem, aktywują lim-
focyty Th do produkcji IFNÅ‚ i IL10.
5.6. Komórki dendrytyczne grudek
Komórki dendrytyczne grudek - FCD (follicular dendritic cells), jak sama nazwa wskazuje
występują w grudkach chłonnych śledziony i węzłów limfatycznych. Są komórkami osiadłymi
bez możliwości migracji. Ich pochodzenie nie jest znane, ale są pewne doniesienia wskazują-
ce, że mogą one wywodzić się z komórek tkanki łącznej np. fibroblastów. W ośrodkach roz-
mnażania odgrywają one rolę w selekcji limfocytów B. Prezentują im natywne antygeny,
247
Monika Ryba
prowadząc do przeżycia tylko tych komórek, których receptory BCR wykazują wysokie powi-
nowactwo do antygenu. Przeżycie limfocytów B następuje na skutek zahamowania procesu
apoptozy. Selekcja z udziałem FDC jest uważana za kluczowy etap w powstawaniu komórek
pamięci. FDC w pewnym sensie mogą być uważane za komórki prezentujące antygen (APC),
ale istotnie się różnią od APC prezentujących antygeny limfocytom T. FDC nie pochłaniają ani
nie przetwarzają antygenu, co więcej nie mają cząsteczek MHC klasy II. Antygeny są prezen-
towane w formie kompleksów immunologicznych na cząsteczkach będących receptorami dla
dopełniacza  CD21 (CR2) i CD35 (CR1). U myszy na powierzchni FDC stwierdza się również
receptor FcłRIIB, który jest także ważny w chwytaniu antygenów.
5.6.1. Charakterystyka FDC
Pod mikroskopem FDC mogą być rozpoznane jako duże komórki z charakterystycznymi
długimi, smukłymi wypustkami, które po immunizacji grubieją. Struktury te, bogate w recep-
tory dla składników dopełnicza i receptory dla fragmentu Fc przeciwciał, określane są jako
ciałka pokryte kompleksami immunologicznymi  iccosomy (ryc. 5.20). Są one odpowiedzial-
ne za zagęszczanie antygenów prezentowanym limfocytom.
Ryc. 5.20. Morfologia FDC /L  limfocyt/
(z
ródło: Kosco-Vilbois MH Nature Reviews Immunology 2003)
Ekspresję CD21 i CD35 można wykryć również na innych, niż FDC, komórkach aczkolwiek
na niższym poziomie. CD21 wykrywa się np. na limfocytach B, a CD35 np. na neutrofilach,
limfocytach B czy erytrocytach. Wykazano, że FDC charakteryzują się wariantem genu CD21
kodującego dłuższą formę białka, natomiast w limfocytach B stwierdza się formę krótszą ko-
248
Rozdział 5. Komórki dendrytyczne
dowaną przez inny wariant tego samego genu. Jak dotąd, dłuższa izoforma białka CD21 jest
jedynym znanym markerem FDC. Poza ekspresją receptorów, komórki dendrytyczne grudek
produkują chemokinę przyciągającą limfocyty B  CXCL13, która wiąże receptor CXCR5. Poza
tym komórki FDC produkują czynnik HGF/SF (hepatocyte growth factor/scatter factor), który
wiąże się z kinazą tyrozynową c-Met, ulegającą ekspresji na limfocytach B. Ta interakcja mo-
że mieć znaczenie w zwiększeniu stopnia wzajemnej adhezji komórek. Ponadto adhezja mię-
dzy FDC i limfocytami B ośrodków rozmnażania jest możliwa dzięki interakcjom
BCR/antygen-przeciwciało-CD21 oraz LFA1/ICAM1 i VLA4/VCAM1.
5.6.2. Regulacja apoptozy limfocytów B ośrodków rozmnażania
Zaobserwowano, że wiele limfocytów B ośrodka rozmnażania, mimo rozpoczęcia proli-
feracji, wchodzi w proces apoptozy. Jeśli komórki te nie wejdą w interakcje z antygenem po
prostu umierają. Gdy na powierzchni limfocytu B, w ośrodku rozmnażania grudki chłonnej,
dojdzie do ekspresji nowego receptora BCR, dalszy los takiej komórki jest zależny od interak-
cji z komórką FDC, która prowadzi do  wyłączenia istniejącego uprzednio programu prowa-
dzącego do apoptozy. Zależne od antygenu interakcje między FDC a limfocytem B ośrodka
rozmnażania prowadzą do wyciszenia aktywności kaspazy 8, kaspazy 3 i polimerazy poli-ADP-
rybozy. Poza tym w limfocycie B dochodzi do zablokowania aktywności katepsyny B, co za-
pobiega fragmentacji DNA. FDC zawierają duże ilości inhibitora katepsyny  cystatyny A, któ-
ra jest przez nie wydzielana i może odgrywać rolę w hamowaniu apoptozy.
Poza tym, ważną rolę antyapoptotyczną odgrywa blokada ścieżki Fas-FasL. Limfocyty B
ośrodków rozmnażania charakteryzują się ekspresją Fas (CD95). Nie wiadomo jednak, które
komórki są z
ródłem FasL. Niektóre dane wskazują, że cząsteczka Fas na limfocytach B ośrod-
ków rozmnażania jest zdolna do autoaktywacji bez konieczności wiązania liganda. Ligacja
receptora Fas na izolowanych limfocytach B ośrodków rozmnażania w warunkach in vitro
przyśpiesza ich apoptozę, jednak gdy dojdzie do kontaktu z komórkami FDC proces ten nie
działa.
Okazało się, że komórki FDC blokują apoptozę związanych z nimi limfocytów B, w wyni-
ku indukcji ekspresji białka FLIP w cytoplazmie tych limfocytów. FLIP hamuje aktywację ka-
spazy 8, prowadząc jednocześnie do przeżycia limfocytu B (ryc. 5.21).
249
Monika Ryba
Ryc. 5.21. Blokada apoptozy limfocytów B ośrodków rozmnażania
(z
ródło: Kosco-Vilbois MH Nature Reviews Immunology 2003)
5.7. Interakcje komórek dendrytycznych z innymi komórkami
5.7.1. Interakcje z neutrofilami
Neutrofile, najliczniejsze z granulocytów, pełnią zasadniczą rolę w odpowiedzi nieswo-
istej, która polega na bardzo szybkim reagowaniu na obce substancje. Są zdolne do fagocyto-
zy, a także produkują szereg czynników prozapalnych. Wydaje się, że neutrofile mogą regu-
lować rozwój odpowiedzi swoistej właśnie poprzez kontakt z komórkami dendrytycznymi.
Neutrofile jako pierwsze pojawiają się w miejscu infekcji. Po aktywacji zaczynają produkować
chemokiny (IL8, GROÄ… oraz MIP1Ä… i MIP1². IL8 i GROÄ… sÄ… czynnikami chemotaktycznymi dla
neutrofilów i w związku z tym zapewniają napływ i akumulację ogromnej liczby tych granulo-
cytów w tkance objÄ™tej procesem zapalnym. WydzielajÄ…c MIP1Ä… i MIP1² neutrofile przyciÄ…-
gają do miejsca infekcji nie tylko monocyty i makrofagi, ale także niedojrzałe komórki den-
drytyczne. W dodatku okazuje się, że czynniki antybakteryjne uwalniane podczas degranula-
cji neutrofili działają chemotaktycznie na limfocyty T i niedojrzałe komórki dendrytyczne.
Niedojrzałe komórki dendrytyczne również produkują IL8, stymulując dalszy napływ neutrofi-
li i kolokalizację ich i swojej subpopulacji. To powoduje, że neutrofile i niedojrzałe DC znajdu-
ją się w tym samym miejscu o tym samym czasie, przez co mogą ze sobą reagować. Aktywo-
wane neutrofile produkują TNFą, który indukuje dojrzewanie komórek dendrytycznych. Doj-
rzałe DC następnie migrują do węzłów chłonnych (ryc. 5.22a). Wczesne prekursory neutrofili,
ale nie dojrzałe komórki, mogą różnicować się w komórki dendrytyczne pod wpływem cy-
tokin produkowanych przez aktywowane monocyty i makrofagi w uszkodzonej tkance
(ryc. 5.22b). I mimo, że takie powstałe z neutrofili DC mogą indukować proliferacjię limfocy-
tów T, ta zdolność jest ograniczona. Same neutrofile nie mogą prezentować antygenów lim-
focytom T, ale jako aktywowane komórki mogą wnikać do węzłów chłonnych, gdzie w wyni-
ku produkcji IL12 wpływają na rozwój odpowiedzi Th1 (ryc. 5.22c).
250
Rozdział 5. Komórki dendrytyczne
Ryc. 5.22. Neutrofile i regulacja odpowiedzi swoistej
(z
ródło: van Gisbergen K Trends Immunol 2005)
Niedojrzałe komórki dendrytyczne bezpośrednio łączą się z neutrofilami za pomocą re-
ceptora DC-SIGN, a jego ligandem nie jest jak w przypadku limfocytów T  ICAM3, tylko
Mac1. Co ciekawe, neutrofile charakteryzują się specyficzną glikoformą Mac1, która w prze-
ciwieństwie do form tej cząsteczki występujących na innych komórkach mieloidalnych, za-
wiera resztę Lex. To wyjaśnia dlaczego DC-SIGN rozpoznaje Mac1 na neutrofilach, ale już nie
na innych komórkach. Inna cząsteczka adhezyjna na neutrofilach: CEACAM1 (Carcinoembry-
onic antigenrelated cell adhesion molecule 1) również zawiera Lex co wskazuje, że mogłaby
być alternatywnym ligandem dla receptora DC-SIGN. Te dwa przykłady pokazują, że specy-
ficzna glikozylacja może odgrywać rolę w regulacji wzajemnych interakcji między komórką
dendrytycznÄ… a neutrofilem (ryc. 5.23).
251
Monika Ryba
Ryc. 5.23. Interakcja DC-neutrofil
(z
ródło: Van Gisbergen K Trends Immunol 2005)
Dojrzewanie komórki dendrytycznej w wyniku interakcji z neutrofilem jest procesem
dwuetapowym. Najpierw dochodzi do powstania synapsy pomiędzy dwoma komórkami w
wyniku oddziaływania DC-SIGN  Mac1, a następnie wyprodukowany przez aktywowanego
neutrofila TNFą i przekazania go komórce dendrytycznej. Neutrofile produkują małe ilości
TNFą stąd prawdopodobnie konieczność wytworzenia synapsy między dwiema komórkami.
Utworzenie synapsy przez Mac-1 i DC-SIGN umożliwia neutrofilom przekazanie TNFą wy-
łącznie niedojrzałym komórkom dendrytycznym, bo tylko one mają na swojej powierzchni
DC-SIGN. U myszy zaobserwowano, że aktywowane LPSem neutrofile potrzebują TNFą i kon-
taktu komórka-komórka do indukcji dojrzewania DC. Po aktywacji LPSem neutrofile zwięk-
szają ekspresję powierzchniowego TNFą, który bardziej niż forma rozpuszczalna jest wyma-
gany do zależnej od neutrofilów aktywacji DC. Może to wyjaśniać konieczność bezpośrednie-
go kontaktu obu komórek, ale oczywiście u myszy, jak i u człowieka, receptory umożliwiające
adhezję są zaangażowane w utrzymaniu tej interakcji. Neutrofile stymulują komórki dendry-
tyczne do produkcji IL12 i w ten sposób pośrednio indukują odpowiedz
Th1. I rzeczywiście,
kohodowle komórek dendrytycznych z neutrofilami umożliwiają tym pierwszym wzbudzanie
odpowiedzi Th1.
252
Rozdział 5. Komórki dendrytyczne
5.7.2. Interakcje z komórkami NK
Wyniki badań in vitro potwierdzają rolę cytokin i wzajemnego kontaktu komórka-
komórka w interakcjach między komórkami dendrytycznymi a komórkami NK. Sygnały wysy-
łane przez komórkę dendrytyczną wpływają na wzmocnienie funkcji (ryc. 5.23a) i proliferacji
(ryc. 5.23b) komórek NK.
Ryc. 5.23. Interakcja DC  NK (z
ródło: Degli-Eposti MA Nature Reviews Immunology 2005)
Cytokiny takie jak IL12 i IL18 zapewniają optymalną produkcję cytokin przez komórki NK.
IL12 wzmaga produkcję IFNł. Komórki Nk mogą być aktywowane przez DC niezależnie od
IL12. W odpowiedzi na zakażenie bakteryjne, IL2 produkowana przez DC wydaje się być waż-
niejsza niż IL12 i IL18 w indukcji produkcji IFNł przez komórkę NK. Interferony typu 1 odgry-
wają ważną rolę w indukcji aktywności cytotoksycznej komórek NK. Działają albo bezpośred-
nio, albo poprzez indukcję działającej autokrynowo IL15. Zarówno IFN typu 1 jak i IL15 mogą
wpływać na aktywację komórek NK poprzez regulację ekspresji ligandów dla receptora
NKG2D. Forma IL15 związana z błoną komórkową DC odgrywa rolę w proliferacji i przeżyciu
komórki NK. Rola bezpośredniego kontaktu DC  NK w indukcji aktywności komórki NK jest
dosyć jasna. Niedojrzałe komórki dendrytyczne są w stanie indukować aktywację komórek
NK. Mimo, że bardzo słabo produkują cytokiny, wykazują stałą ekspresję cząsteczek CD48 i
CD70, które są ligandami dla receptorów aktywujących na NK 2B4 i CD27. Dojrzałe komórki
dendrytyczne poza produkcją cytokin niezbędnych do aktywacji komórek NK, zwiększają
ekspresję cząsteczek kostymulujących i w zależności od otrzymanych bodz
ców mogą również
wytwarzać ligandy dla receptorów aktywujących komórki NK. Po stymulacji interferonami
typu 1, komórki dendrytyczne zaczynają produkować zwiększone ilości białek MICA i MICB,
które są ligandami receptora NKG2D. Co ciekawe, obniżają one ekspresję białka CLRB (C-
type-lectin-related B), liganda dla receptora hamujÄ…cego NKR-P1B (NK-cell receptor protein
1B) i NKR-P1D. Poziom ekspresji ligandów dla receptorów NK może ulegać zmianom podczas
dojrzewania komórki dendrytycznej. Cząsteczki adhezyjne ważne dla bezpośredniego kon-
taktu komórka-komórka mogą wpływać na wzajemne interakcje oddziałujących ze sobą ko-
253
Monika Ryba
mórek. wykazano, że w zależną od DC aktywację komórki NK zaangażowana jest cząsteczka
LFA1. Korzyści z wzajemnego kontaktu odnosi również komórka dendrytyczna, której funkcje
są regulowane dzięki sygnałom wysyłanym przez komórkę NK (ryc. 5.24). Niedojrzałe komór-
ki dendrytyczne, w przeciwieństwie do innych normalnych, zdrowych komórek są szczególnie
wrażliwe na zależną od NK cytolizę (ryc. 5.24b), podczas gdy dojrzałe DC są chronione przed
zniszczeniem.
Ryc. 5.24. Interakcja DC  NK
(z
ródło: Degli-Eposti MA Nature Reviews Immunology 2005)
Ta różnica wynika z innego poziomu ekspresji cząsteczek MHC klasy I, szczególnie HLA-E,
na niedojrzałych i dojrzałych DC (sygnały z receptorów hamujących) Receptor aktywujący
NKp30 (ryc. 2) jest również zaangażowany w niszczenie niedojrzałych komórek dendrytycz-
nych. Bardzo mały odsetek komórek NK (5 - 10%) o fenotypie NKG2Alow jest również zaanga-
żowany w ten proces. Wysoka ekspresja cząsteczek MHC klasy I czyni dojrzałe komórki den-
drytyczne opornymi na niszczenie przez komórki NK. Ale nie tylko. Dojrzałe komórki dendry-
tyczne zwiększają ekspresję wewnątrzkomórkowego inhibitora granzymu B  PI9 (protease
inhibitor 9). Mechanizm ten jest wykorzystywany przez DC do ochrony przed aktywowanymi
limfocytami Tc, ale może być też używany w ochronie przed komórkami NK. Eliminacja ko-
mórek dendrytycznych nie jest jednak jedynym efektem interakcji NK-DC. W pewnych wa-
runkach komórki NK mogą indukować lub przynajmniej wzmacniać proces dojrzewania ko-
mórek dendrytycznych (ryc. 5.24a). Rozpuszczalne czynniki, szczególnie, TNF i IFNł oraz wza-
jemny kontakt są wymagane do efektywnego dojrzewania DC. Ostatnio również zapropono-
wano udział cząsteczki 4-IBB w zależnej od NK aktywacji komórek dendrytycznych. To czy do
aktywacji komórek dendrytycznych potrzebny jest jednoczesny udział cytokin i bezpośred-
niego kontakt obu komórek zależy od warunków, w jakich te komórki się znajdą. Np. Akty-
wacja komórki dendrytycznej indukowana przez komórkę NK, która wcześniej w obecności
IFN typu 1 reagowała z komórką zakażoną, nie wymaga wzajemnego kontaktu obu komórek,
ale wymaga TNF i IFNÅ‚. Kolejnym czynnikiem determinujÄ…cym efekt interakcji NK  DC jest
ilość reagujących ze sobą komórek. Niski stosunek NK do DC skutkuje przeżyciem i dojrzewa-
niem DC, podczas gdy wysoki stosunek NK do DC prowadzi do eliminacji tych ostatnich.
254
Rozdział 5. Komórki dendrytyczne
5.8. Komórki dendrytyczne w immunoterapii
5.8.1. Użycie DC jako szczepionek
Na ryc. 5.25 przedstawiono ogólny schemat przygotowania komórek dendrytycznych do
terapii adoptywnej. Z puli jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) chorego izolu-
je się subpopulację monocytów, którą poddaje się pięciodniowej hodowli z GMCSF i IL4 w
celu indukowania różnicowania tych komórek w niedojrzałe komórki dendrytyczne (CD83-
CD80lowCD86low). Komórki te dojrzewają następnie pod wpływem TNFą czy CD40L lub w tzw
pożywce MCM (monocyte conditioned medium) zawierającej IL1, IL6, TNFą i PGE2. Indukuje
to rozwój komórek o fenotypie CD83highCD80highCD86high. Stymulacja z PGE2 jest szczególnie
użyteczna, gdyż wzmacnia ona odpowiedz
komórek dendrytycznych na MIP-3², chemokinÄ™,
która przyciąga DC do węzłów chłonnych. Zamiast rekombinowanych cytokin i prostaglandyn
immunogenność komórek dendrytycznych powstałych w warunkach ex vivo można wzmoc-
nić dzięki inkubacji z ligandami dla receptorów TLR. Taka stymulacja aktywuje kaskady sygna-
Å‚owe prowadzÄ…ce do aktywacji NF8
B czy genów kodujących interferony, a w następstwie do
zwiększenia funkcji i przeżywalności DC. Naturalnie występujące ligandy dla TLR to np. LPS,
ssRNA, niemetylowane reszty CpG. Z syntetycznych można wymienić np. imiquimod , który
jest powszechnie stosowany w leczeniu raków podstawnokomórkowych, i jako ligand recep-
tora TLR7 zwiększa immunogenność i przeżycie komórek dendrytycznych.
Dojrzałe DC inkubuje się przez 2 godziny z odpowiednim antygenem, i po odpłukaniu
podaje się spowrotem pacjentowi jako autologiczną szczepionkę z komórek dendrytycznych,
które będą stymulować odpowiedz
limfocytów T. Są różne strategie dostarczania antygenów
do komórek dendrytycznych podczas ich manipulacji w warunkach ex vivo. DC mogą być in-
kubowane w obecności syntetycznych epitopów otrzymanych z antygenów lub całych białek.
Antygeny można wprowadzać też stosując nagi DNA czy rekombinowane wirusy (wektory
retro- czy adenowirusowe). Można również podawać RNA dla określonego antygenu. DC
obładowane RNA są silnymi stymulatorami antygenowo- specyficznych limfocytów Tc.
Do tej pory nie określono jednoznacznie w jaki sposób powinny być podawane pacjen-
towi ex vivo wytworzone komórki dendrytyczne. Różne drogi podania komórek (śródskórnie,
podskórnie, dożylnie i dowęzłowo) są testowane klinicznie. Niektóre dane wskazują, że śród-
skórna i dowęzłowa droga podania obładowanych antygenami komórek dendrytycznych jest
bardziej efektywna w wywoływaniu odpowiedzi immunologicznej, jednak odpowiedz
immu-
nologiczną obserwowano również w przypadku iniekcji podskórnych i dożylnych. Śródskórne
lub podskórne iniekcje komórek dendrytycznych wykonuje się w pobliżu węzłów chłonnych
pachwinowych lub szyjnych. Stwierdzono, że mniej niż 10% wstrzykniętych w ten sposób
komórek dendrytycznych dotrze do węzłów. Jeśli chodzi o harmonogram szczepień, to w
większości przypadków stosuje się przynajmniej dwie dawki szczepionki podane cotygo-
dniowo, co drugi tydzień lub co miesiąc. Wydaje się, że kilka dawek szczepionki jest niezbęd-
ne do wzbudzenia odpowiedzi antygenowo specyficznych limfocytów in vivo.
255
Monika Ryba
Ryc. 5.25. Manipulacja komórkami dendrytycznymi w warunkach ex vivo
(z
ródło: Berzofsky JK Nature Reviews Immunology 2001)
Nadal pozostaje niejasne jak długo taka odpowiedz
trwa i kiedy należałoby podać ewen-
tualną dawkę podtrzymującą. Podobnie, niewiadomo jaka dawka komórek dendrytycznych
jest wystarczająca do wzbudzenia odpowiedzi immunologicznej. Większość badaczy używa
dawki w granicach między 1x105 a 250x106 komórek na jedną iniekcję. Komórki dendrytycz-
ne otrzymane w warunkach ex vivo mogą być także użyte do ex vivo ekspansji antygenowo
specyficznych limfocytów. W tym przypadku omija się etap indukowania odpowiedzi immu-
nologicznej przez DC w warunkach in vivo, a bezpośrednio pacjentowi podaje się wyprodu-
kowane komórki efektorowe. Ekspansja limfocytów T w warunkach ex vivo wydaje się być
obiecujÄ…cÄ… terapiÄ… u chorych z komplikacjami po przeszczepie szpiku kostnego. Niedawno
wykazano, że ex vivo, genetycznie zmodyfikowane limfocyty T były zdolne do odpowiedzi
immunologicznej u pacjentów z czerniakiem.
Do tej pory przeprowadzono ponad 150 prób klinicznych z wykorzystaniem komórek
dendrytycznych w leczeniu różnego typu nowotworów. Listę tych projektów można znalez
ć
na stronie internetowej pod adresem: www.mmri.mater.org.au. Najczęstszym typem nowo-
tworu (40 opublikowanych badań klinicznych) leczonym szczepionkami z komórek dendry-
tycznych jest czerniak, a za nim rak prostaty (20), rak nerkowo komórkowy (16), rak piersi
(12), szpiczak mnogi, białaczka, rak jelita grubego i glejak (9). Większość z tych badań obej-
mowała pacjentów w zaawansowanym stadium choroby, często z przerzutami do innych
narządów i po uprzednim agresywnym leczeniu. Najczęściej używano dojrzałych komórek
256
Rozdział 5. Komórki dendrytyczne
dendrytycznych (109 prób klinicznych). Niedojrzałe DC użyto w 39 próbach, krążące mielo-
idalne DC w 13, a DC wyhodowane z komórek hematopoetycznych CD34+ użyto w 9 projek-
tach. Komórki podawano dożylnie (72 próby kliniczne), śródskórnie (64), podskórnie (63),
dowęzłowo w 12, a doguzowo w 7. W niektórych projektach używano GMCSF i IL4 jako ad-
iuwantów. Ogólnie badania z użyciem szczepionek opartych na komórkach dendrytycznych
pokazały, że mogą być one bezpiecznie używane nie wywołując żadnych lub też bardzo słabe
efekty uboczne. W większości przeprowadzonych prób zaobserwowano rozwijającą się od-
powiedz
immunologiczną skierowaną przeciwko konkretnemu antygenowi pokazując, że
zmodyfikowane ex vivo DC są immunogenne w warunkach in vivo. W 40 różnych badaniach
wykazano korelację pomiędzy odpowiedzią kliniczną, a indukcją antygenowo specyficznej
odpowiedzi immunologicznej.
Podsumowując, można powiedzieć, że komórki dendrytyczne są przydatnym narzę-
dziem w indukowaniu specyficznej odpowiedzi immunologicznej, nawet u pacjentów w za-
awansowanym stadium choroby. Jednak aktywna immunoterapia nowotworów z użyciem
DC (jak również innych adiuwantów) wydaje się nie być wystarczającą do wzbudzenia pożą-
danej odpowiedzi klinicznej, przynajmniej jeśli chodzi o nowotwory w póz
nym stadium za-
awansowania. Wynika to prawdopodobnie z wcześniejszego, agresywnego leczenia, prowa-
dzącego niejednokrotnie do ciężkiej immunosupresji i/lub obecności takich mas guza, które
są trudno dostępne dla limfocytów. Z drugiej strony, tego typu podejście terapeutyczne mo-
że zwiększyć szanse na przeżycie pod warunkiem, że zastosuje się je jak najszybciej podczas
trwania choroby.
Bibliografia:
1. Bachmann MF Chemokines: more than just road signs. Nature Reviews Immu-
nology 6: 159-154; 2006.
2. Banchereau J Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer. Nature Re-
views Immunology 5: 296-306; 2005.
3. Berzofsky JK Strategies for designing and optimizing new generation vaccines.
Nature Reviews Immunology 1: 209-219; 2001.
4. Degli-Esposti MA Close encounters of different kinds: Dendritic cells and NK
cells take centre stage. Nature Reviews Immunology 5: 112-124; 2005.
5. Figdor CG C-type lectin receptors on dendritic cells and langerhans cells. Nature
Reviews Immunology 2: 77-84; 2002.
6. Geijtenbeek TH Self- and nonself-recognition by c-type lectins on dendritic
cells. Annual Review of Immunology 22:33 54; 2004.
7. Gołąb J Immunologia. Wydawnictwo Naukowe PWN; 2007.
8. Hackstein H Dendritic cells: emerging pharmacological targets of immunosup-
pressive drugs. Nature Reviews Immunology 4: 24-35; 2004.
9. Janeway CA Immunobiology. The immune system in health and disease. New
York ; London : Garland Science Publishing, 2005.
10. Jensen PE Dendritic cells: caspases keep them young. Nature Immunology 6:
968  969; 2005.
257
Monika Ryba
11. Kapsenberg ML Dendritic-cell control of pathogen-driven T-cell polarization.
Nature Reviews Immunology 3: 984-993; 2003.
12. Kosco-Vilbois MH Are follicular dendritic cells really good for nothing? Nature
Reviews Immunology 3: 764-769; 2003.
13. Kyewski B Self-representation in the thymus: an extended view. Nature Re-
views Immunology 4: 688-698; 2004.
14. Liu YJ IPC: Professional Type 1 Interferon-Producing Cells and Plasmacytoid
Dendritic Cell Precursors. Annual Review of Immunology 23:275 306; 2005.
15. Lutz MB Immature,semi-mature and fully mature dendritic cells: which signals
induce tolerance or immunity? TRENDS in Immunology 23: 445-449;2002.
16. Mellor AL Ido expression by dendritic cells: tolerance and tryptophan catabo-
lism. Nature Reviews Immunology 4: 762-774; 2004.
17. Nencioni A The use of dendritic cells in cancer immunotherapy. Critical Reviews
in Oncology/Hematology 65: 191 199; 2008.
18. Randolph GJ Migration of Dendritic Cell Subsets and their Precursors. Annual
Review of Immunology 26:293 316; 2008.
19. Shortman K Mouse and human dendritic cell subtypes. Nature Reviews Immu-
nology 2: 151-161; 2002.
20. van Gisbergen K Close encounters of neutrophils and DCs. Trends in Immunol-
ogy 26: 626-631; 2005.
21. van Kooyk Y DC-SIGN: escape mechanism for pathogens. Nature Reviews Immu-
nology 3: 697-709; 2003.
22. van Nierop K Human follicular dendritic cells: function, origin and development
Seminars in Immunology 14: 251-257; 2002.
258