Tom 51, 2002
Numer 3 (256)
Strony 343 351
ALICJA ZIEMIENOWICZ
Instytut Biologii Molekularnej i Biotechnologii
Uniwersytet Jagielloński
Gronostajowa 7, 30-387 Kraków
e-mail: [e-mail]
TRANSFER PLAZMIDÓW MIĘDZY BAKTERIAMI A KOMÓRKAMI EUKARIOTYCZNYMI
WPROWADZENIE: HORYZONTALNY TRANSFER GENÓW
Horyzontalny transfer genów (ang. hori- informacji genetycznej między komórkami
zontal gene transfer, HGT) polega na stabilnym bakterii Escherichia coli a komórkami drożdży
przeniesieniu informacji genetycznej z jedne- Saccharomyces cerevisiae. Co ciekawsze, w
go organizmu do drugiego. Ten typ wymiany przyrodzie stwierdzono do tej pory tylko jeden
genetycznej został dobrze zbadany u organi- przykład transferu DNA między komórkami
zmów prokariotycznych (transfer plazmidów bakteryjnymi a komórkami wyższych eukario-
podczas koniugacji bakterii), jednak rzadkie są tów: przeniesienie DNA komórek bakterii z ro-
przypadki HGT między organizmami prokario- dzaju Agrobacterium do komórek roS
linnych
tycznymi i eukariotycznymi. Nieliczne donie- (Rys. 1).
sienia informują o przypadkach przenoszenia
TRANSFER DNA Z E. COLI DO DROŻDŻY
Transfer informacji genetycznej między ko- cjacji replikacji w komórkach drożdży (ARS)
mórkami bakterii E. coli a komórkami drożdży po przeniesieniu z komórek bakteryjnych po-
S. cerevisiae został opisany zaledwie dekadę zostają w formie pozachromosomalnej, zaS
te
temu (HEINEMANN i SPRAGUE 1989, NISHIKAWA które nie zawierają ARS  integrują się do chro-
i współaut. 1992). Mechanizm tego procesu mosomów drożdży drogą rekombinacji homo-
jest bardzo podobny do bakteryjnej koniugacji. logicznej poprzez podwójny crossing-over.
Ponadto, plazmidy zawierające sekwencje ini-
AGROBACTERIUM
Agrobacterium tumefaciens jest Gram-u- Podczas transformacji Agrobacterium
jemną bakterią glebową odpowiedzialną za po- przyłącza się do komórek roS
linnych, a następ-
wstawanie tumorowatych naroS
li na roS
linach nie przenosi częS
ć swojego DNA do niektórych
dwuliS
ciennych dzięki zdolnoS
ci do przeno- z nich. Procesem transformacji zawiadują bak-
szenia DNA do komórek roS
linnych (GELVIN teryjne białka kodowane przez geny zarówno
2000, ZHU i współaut. 2000). W biotechnologii plazmidowe, jak i chromosomalne, przy
Agrobacterium jest powszechnie stosowane współudziale białek komórek gospodarza.
jako wektor do wprowadzania obcych genów DNA przenoszone do komórki roS
linnej (ang.
w celu uzyskania roS
lin transgenicznych. transferred DNA, T-DNA) pochodzące z duże-
344 ALICJA ZIEMIENOWICZ
MobA-ssDNA
A. tumefaciens
VirD2-ssT-DNA
A. tumefaciens
S. cerevisiae
komórka roS
linna
komórka ludzka
Ryc. 1. Horyzontalny transfer genów: koniugacja między komórkami Agrobacterium tumefaciens
(kompleks MobA-ssDNA) oraz transfer T-DNA do komórek eukariotycznych (kompleks VirD2-ssT-
DNA)
go plazmidu bakteryjnego, pTi (ang. tumor in- ce bakteryjnej, a następnie eksportowane do
ducing plasmid) A. tumefaciens lub pRi (ang. komórki roS
linnej, gdzie ulega integracji do ge-
root indicing plasmid) Agrobacterium rhizo- nomu roS
linnego (TINLAND i HOHN 1995,
genes, jest wycinane i przetwarzane w komór- SHENG i CITOVSKY 1996, TINLAND 1996).
CHEMOTAKSJA, ADHEZJA I INDUKCJA WIRULENCJI
Sygnałem do transferu DNA jest uwolnie- Pochodne fenolowe, cukry i kwasowoS
ć
nie podczas zranienia roS
liny pochodnych fe- S
rodowiska działają nie tylko jako czynniki
nolowych i cukrów, a także zakwaszenie S
rodo- chemotaktyczne, ale również jako induktory
wiska, co prowadzi do indukcji genów regionu wirulencji Agrobacterium. Czynniki te rozpo-
wirulencji (vir) plazmidu pTi, których produk- znawane są przez białko sensoryczne VirA zlo-
ty (białka virulencji) regulują obróbkę i trans- kalizowane w błonie komórkowej Agrobacte-
fer T-DNA. Pochodne fenolowe i cukry stano- rium. Pod wpływem induktorów cytoplazma-
wią czynniki chemotaktyczne, które kierują tyczna częS
ć tego białka ulega autofosforyla-
Agrobacterium w okolicę zranionych komó- cji, po czym grupa fosforanowa zostaje prze-
rek roS
linnych. Jednym z najwczeS
niejszych niesiona na drugi składnik kaskady sy-
etapów transformacji roS
lin przez Agrobacte- gnałowej  białko VirG, które ulega aktywacji.
rium jest adhezja bakterii do komórek roS
lin- Ufosforulowane białko VirG wiąże się z ele-
nych. W procesie tym biorą udział adhezyny mentami promotorowymi  vir i aktywuje
bakteryjne (polisacharydy zewnątrzkomórko- transkrypcję genów wirulencji plazmidu pTi
we, fibrylle celulozowe oraz białko zwane rhi- oraz genów chromosomalnych odpowiedzial-
cadhezyną), a także adhezyny roS
linne (zmody- nych za adhezję bakterii do infekowanej ko-
fikowane pektyny, białko podobne do ludzkiej mórki roS
linnej. Ekspresja plazmidowych
wironektyny, białko podobne do germiny oraz białek wirulencji warunkuje obróbkę i trans-
białka wiążące cukry  lektyny). fer T-DNA (Tabela 1).
Transfer plazmidów między bakteriami a komórkami eukariotycznymi 345
OBRÓBKA I TRANSFER T-DNA
T-DNA wycinane jest z plazmidu pTi przez puszczalnie dostarczają energii potrzebnej do
endonukleazę VirD2, która rozpoznaje tzw. se- eksportu kompleksu VirD2-ssT-DNA i innych
kwencje graniczne flankujące T-DNA: lewą białek. Z kolei białko VirD4, również niezbęd-
(ang. left border, LB) i prawą (ang. right border ne do eksportu T-DNA, zlokalizowane jest w
RB), i nacinając je łączy się kowalencyjnie obrębie błony wewnętrznej. Początkowo
Tabela 1. Funkcje głównych białek wirulencji.
Białko Funkcja
VirA i VirG Kaskada sygnałowa: VirA  receptor, VirG  aktywator transkrypcji ge-
nów vir
VirB1-11/VirD4 System sekrecji typu IV do transferu T-DNA i białek Vir; elementy struk-
turalne pili transferowych
VirC1 i VirC2 Obróbka T-DNA: zwiększenie wydajnoS
ci nacięcia sekwencji granicznych
poprzez aktywację wzmacniacza ( overdrive )
VirD1 i VirD2 Obróbka T-DNA: endonukleaza VirD2 nacina sekwencję graniczną T-DNA
plazmidu Ti w obecnoS
ci VirD1
VirE Transport T-DNA: VirE1 jest chaperonem eksportu VirE2; VirE2 tworzy
kanał w błonie komórki roS
linnej, opłaszcza T-DNA, chroni je przed de-
gradacją nukleolityczną i bierze udział w imporcie T-DNA do jądra ko-
mórkowego
VirF HRF: czynnik zakresu gospodarza; bierze udział w aktywacji systemu pro-
teolitycznego komórki gospodarza
VirH Detoksyfikacja: VirH1  oksydaza typu P450, VirH2  demetylaza fenolo-
wych induktorów np. acetosyryngonu (AS)
VirM, -L, -K, -J, -F, Inne białka Vir o mniej istotnych funkcjach
-P, -R, -D3, -D5 i
 E3
wiązaniem fosfotyrozynowym z końcem 5 na- sądzono, że białka VirB i VirD4 tworzą pory w
ciętego DNA (ZIEMIENOWICZ 2001). Aktyw- błonie komórkowej, przez które zachodzi eks-
noS
ć endonukleolityczna białka VirD2 wspo- port T-DNA. Przed paru laty wykazano jedna-
magana jest przez inne białka wirulencji: kże istnienie przypominających pile koniuga-
VirD1, VirC1 i VirC2. Nacięte DNA uwalniane cyjne pili transportowych, których głównym
jest z plazmidu Ti w postaci jednoniciowego składnikiem budulcowym jest białko VirB2.
DNA (ang. single-stranded DNA, ssDNA) po- Aparat transportowy VirB/VirD4 umożliwia
przez syntezę naprawczą. Kompleks VirD2- eksport kompleksu VirD2-ssT-DNA oraz białek
ssT-DNA oraz białka VirE2 i VirF przenoszone VirE2 i VirF drogą sekrecji typu IV. Eksporto-
są następnie do komórki roS
linnej poprzez wane białko VirE2 najprawdopodobniej two-
kanał transferowy zbudowany z jedenastu rzy w błonie komórki roS
linnej kanał białkowy,
białek VirB i białka VirD4. WiększoS
ć z tych który działa jako transbłonowy transporter
białek stanowią albo integralne białka błono- DNA. W cytoplazmie komórki roS
linnej T-DNA
we lub też eksportowane z cytoplazmy, i zloka- jest opłaszczane przez białko VirE2 wiążące się
lizowane są w obrębie wewnętrznej lub zew- z jednoniciowym DNA. VirE2 wiąże się z
nętrznej błony komórkowej. Dwa z białek VirB, T-DNA w sposób kooperatywny, ale niezależny
VirB4 i VirB11, są peryferyjnie związane z po- od sekwencji jednoniciowego DNA, i chroni je
zostałymi białkami VirB i zlokalizowane są przed degradacją przez enzymy nukleolitycz-
głównie w cytoplazmie tuż pod błoną komór- ne. Aby proces transformacji genetycznej ko-
kową. Białka te mają aktywnoS
ć ATPaz i przy- mórki roS
linnej zakończył się sukcesem T-DNA
346 ALICJA ZIEMIENOWICZ
musi zostać przetransportowane do jądra ko- do genomu jądrowego, a geny w nim zawarte 
mórkowego, a następnie musi ulec integracji ekspresji.
IMPORT DO JĄDRA KOMÓRKOWEGO I INTEGRACJA DO GENOMU
Utworzony w cytoplazmie komórki roS
lin- importu jądrowego, takich jak importyna i
nej kompleks białkowo-nukleinowy (nazywa- białko Ran, co wskazuje, że proces ten zacho-
ny kompleksem T-DNA lub kompleksem T) dzi tzw. klasyczną, zależną od importyn drogą
składa się z jednoniciowego T-DNA związane- importu jądrowego poznaną szczegółowo dla
go kowalencyjnie z białkiem VirD2 i opłaszczo- białek zawierających sekwencję NLS (NAKIEL-
nego białkiem VirE2. Ponieważ sam T-DNA nie NY i DREYFUSS 1999).
zawiera żadnej informacji czy sygnału umożli- W jądrze komórki roS
linnej T-DNA integruje
wiającego jego import do jądra komórkowego, się do genomu drogą rekombinacji nieupraw-
proces ten zachodzi dzięki sygnałom białek mu nionej, w wyniku której połączeniu ulegają
towarzyszących: VirD2 i VirE2 (SHENG i dwie cząsteczki DNA nie wykazujące znaczącej
CITOVSKY 1996, LARTEY i CITOVSKY 1997). W homologii sekwencji. W komórkach wyższych
komórkach eukariotycznych aktywny import eukariotów, takich jak roS
liny, rekombinacja
białek i kompleksów białkowo-nukleinowych nieuprawniona (niehomologiczna) jest domi-
wymaga specyficznych sygnałów lokalizacji nującym mechanizmem integracji obcego DNA.
jądrowej (ang. nulear localization signal, NLS), Chociaż rekombinacja nieuprawniona T-DNA
które rozpoznawane są przez cytoplazmatycz- została opisana już ponad dekadę temu, niewie-
ne czynniki importu jądrowego, zwane impor- le nadal wiadomo na temat czynników
tynami. Oba białka agrobakteryjne, VirD2 i Vi- biorących udział w tym procesie (TINLAND i
rE2, zawierają sekwencje NLS, które kierują je HOHN 1995, TINLAND 1996). Początkowo suge-
do jądra komórkowego, a ponadto, zidentyfi- rowano, że agrobakteryjne białko VirD2 działa
kowana została roS
linna importyna, która roz- podczas integracji T-DNA jako integraza lub li-
poznaje sekwencje NLS białka VirD2. Wykaza- gaza. Jednakże, obie te funkcje są specyficzne
no, że C-końcowa sekwencja NLS białka VirD2 dla sekwencji RB, co stoi w wyrax
nej niezgodzie
jest niezbędna dla wydajnego importu kom- z niehomologicznym mechanizmem integracji
pleksu T-DNA do jądra komórkowego. Niestety T-DNA. Sugeruje to, że czynniki biorące udział
nie można okreS
lić roli sekwencji NLS białka w tym procesie są pochodzenia roS
linnego (np.
VirE2, gdyż mutacje punktowe lub delecje czę- roS
lina ligaza DNA i inne). Nie wyklucza to jed-
S
ci sekwencji NLS hamują zdolnoS
ć wiązania nak innych funkcji białka VirD2 w integracji
się tego białka do jednoniciowego DNA. T-DNA do genomu roS
linnego: poprzez od-
Stwierdzono, że białko VirE2 jest niezbędne do działywanie z białkami roS
linnymi może ono
transferu kompleksu T-DNA do jądra komórko- ukierunkowywać je do miejsca integracji i/lub
wego, jednakże jego funkcja nie jest zależna od sprzyjać tworzeniu struktury ułatwiającej ten
sekwencji NLS. Przypuszcza się, że VirE2 nada- proces. Wykazane niedawno oddziaływanie
je T-DNA taką strukturę przestrzenną, która białka VirD2 z histonem roS
linnym H2A po-
umożliwia jego translokację przez kanał pory twierdza udział białek strukturalnych w proce-
jądrowej. Ponadto, badania wykazały, że trans- sie integracji T-DNA. Nadal jednak nieznane po-
port kompleksu T-DNA do jądra komórkowego zostają enzymy roS
linne biorące aktywny udział
zależny jest od cytoplazmatycznych czynników w tym procesie.
EKSPRESJA GENÓW T-DNA
T-DNA koduje szereg białek, których pro- pierwszej grupy genów zlokalizowanych w
dukcja w transformowanych komórkach ro- T-DNA, onkogenów, prowadzi do produkcji
S
linnych prowadzi do istotnych zmian w feno- enzymów biorących udział w biosyntezie auk-
typie tych roS
lin (BINNS i COSTANTINO 1998). syn i cytokinin. Te hormony roS
linne, produko-
Geny zlokalizowane w T-DNA przypominają wane w niezbalansowanej iloS
ci, powodują
swoją strukturą i organizacją geny eukariotycz- niepohamowane podziały komórkowe (proli-
ne: zawierają typowe dla nich elementy regula- feracja tkanek), czego efektem jest powstawa-
torowe transkrypcji i translacji. Ekspresja nie guzowatych naroS
li. Dodatkowe geny od-
Transfer plazmidów między bakteriami a komórkami eukariotycznymi 347
grywają podrzędną rolę w indukcji tworzenia wiedzialne za produkcję opin, katalizowaną
naroS
li, ale mogą zwiększać wrażliwoS
ć niektó- przez syntetazy opinowe. Opiny tworzone w
rych roS
lin na działanie fitohormonów, a na- tumorowatej tkance mogą być katabolizowane
wet indukować tworzenie naroS
li przy braku przez Agrobacterium, ale nie przez inne mikro-
głównych onkogenów. W przypadku infekcji organizmy glebowe, i stanowią jako substancje
przez A. rhizogenes powstające naroS
la mają odżywcze x
ródło węgla i azotu. W ten sposób
pokrój korzeni włoS
nikowatych, co wywołane Agrobacterium tworzy dla siebie niszę ekolo-
jest innym niż w przypadku A. tumefaciens ze- giczną poprzez genetyczną modyfikację komó-
stawem onkogenów przenoszonych w postaci rek roS
linnych, proces nazywany również  ge-
T-DNA. netyczną kolonizacją (ZIEMIENOWICZ 2001).
DNA przenoszone do komórki roS
linnej za-
wiera, oprócz onkogenów również geny odpo-
KONIUGACYJNY TRANSFER DNA MIĘDZY KOMÓRKAMI AGROBACTERIUM
Koniugacja jest zjawiskiem umożli- cjujących transfer plazmidów RSF1010 i
wiającym bakteriom wzajemną wymianę mate- R1162 (białko MobA), zaS
jego częS
ć C-końco-
riału genetycznego. Koniugacja między komór- wa  do domeny helikazowej białka TraI
kami Agrobacterium (Ryc. 1) zachodzi w spo- uczestniczącego w koniugacji plazmidu F. Po-
sób analogiczny do koniugacji komórek E. coli nadto, szereg białek Agrobacterium two-
(patrz artykuł M. WŁODARCZYK w tym zeszycie rzących kanał transferowy wykazuje znaczne
KOSMOSU). OriT plazmidu pTi wykazuje duże podobieństwo do analogicznych białek istot-
podobieństwo do sekwencji oriT plazmidów nych dla transferu plazmidu RP4 (białka Trb,
RSF1010/R1162, pSC101, pTF1, pGO1 i TrbK, TraF i TraG). Koniugacja plazmidu pTi
pIP501. N-końcowa domena agrobakteryjnego regulowana jest wielostopniowo przez opiny,
białka koniugacyjnego TraA jest homologiczna autoinduktor AAI, aktywator transkrypcji TraR
do specyficznych dla oriT endonukleaz ini- i modulator TraM.
TRANSFER T-DNA DO KOMÓREK ROR
LINNYCH
Naturalni gospodarze dla Agrobacterium to czynnikiem determinującym zakres gospoda-
szeroka gama roS
lin dwuliS
ciennych. Przez rzy (ang. host range factor, HRF), za typowy
długie lata sądzono, że jedynie roS
liny dwuliS
- HRF Agrobacterium uznawane jest białko VirF,
cienne mogą ulec transformacji przez Agrobac- które razem z kompleksem VirD2-ssT-DNA
terium, co wynikało z powszechnego stosowa- oraz białkiem VirE2 eksportowane jest do zaka-
nia testu na tworzenie guzów jako wskax
nika żanej komórki roS
linnej. Delecja genu virF pro-
transformacji. Jednakże, transfer T-DNA do ro- wadzi do zmniejszenia wirulencji Agrobacte-
S
lin jednoliS
ciennych (Ryc. 1) jest możliwy przy rium, ale ten efekt może zostać zniwelowany
zastosowaniu techniki  agroinfekcji (GRIMSLEY poprzez ekspresję genu virF w infekowanej ro-
i współaut. 1987). W ostatnich latach zastoso- S
linie. Niedawno wykazano, że białko VirF za-
wanie Agrobacterium jako wektora do transfor- wiera domenę F, poprzez którą wiąże się z
macji pozwoliło na uzyskanie transgenicznych białkiem roS
linnym homologicznym do dro-
roS
lin ryżu, pszenicy, kukurydzy, i innych jedno- żdżowego białka Skp1. Białko Skp1 oraz białka
liS
ciennych. Co ciekawe, wzór integracji T-DNA zawierające domenę F stanowią podjednostki
opisany dla tych roS
lin jest bardzo podobny do ligazy ubikwitynowej będącej jednym z enzy-
wzoru znanego z roS
lin dwuliS
ciennych, co mów znakujących białka komórkowe przezna-
wskazuje, że ta sama grupa enzymów roS
lin- czone do degradacji. Przypuszcza się, że białko
nych bierze udział w integracji T-DNA do geno- VirF bierze udział w proteolizie niektórych
mu roS
lin jedno  i dwuliS
ciennych. białek w komórce gospodarza we wczesnych
Pomimo, iż w zasadzie każde białko wiru- etapach transformacji.
lencji Agrobacterium może być równoczeS
nie
348 ALICJA ZIEMIENOWICZ
PORÓWNANIE TRANSFERU T-DNA I KONIUGACJI BAKTERYJNEJ
Mechanizm transferu T-DNA wykazuje sze- przypadku koniugacji bakteryjnej biorcą jest
reg podobieństw (i różnic) do bakteryjnego druga komórka bakteryjna, zaS
w przypadku
systemu transferu koniugacyjnego kodowane- transferu T-DNA biorcą jest zazwyczaj komór-
go przez plazmid RP4 o szerokim spektrum go- ka roS
linna. W koniugacji bakteryjnej miejsce
spodarzy (Tabela 2; FERRAND 1998, ROSSI i inicjacji transferu jest równoczeS
nie miejscem
Tabela 2. Podobieństwa i różnice między transferem T-DNA a konjugacją bakteryjną
WłaS
ciwoS
ci Transfer T-DNA Transfer plazmidu
Podobieństwa
start transferu + (RB) + (oriT)
inicjacja transferu + +
aktywnoS
ć białek transferowych in vitro ++
DNA przenoszone w formie jednoniciowej + +
kanał transferu + +
Różnice
integracja rekombinacja rekombinacja
nieuprawniona homologiczna
import do jądra komórkowego + -
aktywnoS
ć przenoszonych genów w dawcy - +
biorca po transferze staje się dawcą - +
współaut. 1998) Oba systemy posiadają miej- jego terminacji, a cytoplazma komórki biorcy,
sce startu transferu (oriT dla transferu koniu- do której wnika plazmid, jest miejscem docelo-
gacyjnego i RB dla transferu T-DNA), a także wym. W cytoplazmie komórki biorcy plazmid
miejscowo-specyficzne endonukleazy odpo- recyrkularyzuje się i pozostaje w formie poza-
wiedzialne za inicjację transmisji (TraI dla RP4 chromosomalnej (episom) lub też integruje się
i VirD2 dla T-DNA). Sekwencje miejsc startu do chromosomu biorcy. W dodatku, ma on
transferu są bardzo podobne i endonukleazy je nadal zdolnoS
ć do przemieszczenia się do ko-
nacinające mają podobne domeny w częS
ciach lejnej komórki bakteryjnej. Z kolei miejsca star-
N-końcowych sekwencji aminokwasowej. W tu i końca transferu T-DNA to prawa i lewa se-
obu przypadkach DNA przenoszone jest jako kwencja graniczna (RB i LB), a cytoplazma ko-
kompleks jednoniciowego DNA z endonukle- mórki roS
linnej, do której wnika T-DNA, nie
azą połączoną wiązaniem kowalencyjnym z ko- jest jeszcze jego miejscem docelowym. T-DNA
ńcem 5 DNA. Ponadto, białka tworzące kanał musi zostać wprowadzone do jądra komórko-
transferowy (Tra2 i TraG dla RP4, VirB2-11 i wego, a ponieważ nie może pozostać w formie
VirD4 dla T-DNA) wykazują podobieństwa se- pozachromosomalnej, musi zintegrować się z
kwencji i organizacji genów. Co prawda, struk- genomem roS
linnym. Ponadto, T-DNA nie ko-
tura kanału transferowego używana podczas duje genów niezbędnych do jego przemiesz-
koniugacji RP4 nie została jeszcze zidentyfiko- czania się i dlatego integracja do genomu jest
wana, ale sugeruje się, że może być ona zbliż- nieodwracalna. W dodatku, w przypadku bak-
ona do pili koniugacyjnych plazmidu F. Istnie- teryjnej koniugacji przenoszone geny ulegają
nie pili transferowych dla T-DNA zostało nie- ekspresji zarówno w komórce biorcy jak i daw-
dawno udokumentowane (DE LA CRUZ i LANKA cy, podczas gdy geny zawarte w T-DNA posia-
1998). dają eukariotyczne elementy regulacji tran-
Jednakże, te dwa systemy różnią się w spo- skrypcji i translacji i ulegają ekspresji jedynie w
sób istotny organizacją komórek biorcy. W komórce biorcy (Tabela 2).
Transfer plazmidów między bakteriami a komórkami eukariotycznymi 349
TRANSFER T-DNA DO KOMÓREK DROŻDŻY I INNYCH GRZYBÓW
Podobnie jak transfer T-DNA do komórek Istotną różnicą między transferem T-DNA
roS
linnych, transfer T-DNA do komórek S. ce- do komórek drożdżowych i roS
linnych jest
revisiae (Ryc. 1) zależny jest od genów wiru- fakt, że w tych pierwszych integracja zachodzi
lencji plazmidu pTi i podobny jest udział białek poprzez rekombinację homologiczną, domi-
wirulencji Agrobacterium w tym procesie. Je- nujący mechanizm integracji obcego DNA do
dynie bakteryjne białka adhezyjne wydają się genomu drożdży. Jedynie w sytuacji, gdy
nie być niezbędnymi do transfromacji drożdży. T-DNA nie wykazuje żadnej homologii do DNA
Transfer T-DNA do drożdży zależny jest od drożdżowego, integruje się on w miejscach
białek VirB i białka VirD4 tworzących kanał (pi- przypadkowych poprzez rekombinację nieho-
lus?) transferowy między A. tumefaciens a ko- mologiczną (nieuprawnioną). Odwrotna sytu-
mórką biorcy. Co ciekawe, C-końcowa sekwen- acja ma miejsce w komórkach roS
linnych,
cja NLS białka VirD2 jest, podobnie jak w przy- gdzie rekombinacja niehomologiczna jest do-
padku transformacji roS
lin, również istotna dla minująca. Potwierdza to hipotezę, że to
transformacji drożdży, co zgodne jest z obser- właS
nie enzymy komórki biorcy, a nie Agro-
wacjami, iż sekwencje NLS białka VirD2 są rów- bacterium, odpowiedzialne są za integrację
nież aktywne w komórkach drożdżowych. Z T-DNA do genomu gospodarza.
kolei mutacja delecyjna drugiego białka wiru- Niedawno udokumentowano także trans-
lencji VirE2 nie ma, jak to jest w przypadku ro- fer T-DNA z Agrobacterium do kilku gatunków
S
lin, tak dramatycznego efektu na wydajnoS
ć innych grzybów (DE GROOT i współaut. 1998).
transformacji drożdży, co wskazuje na różnice Analogicznie do transformacji drożdży, rów-
w komórkach biorców dotyczące systemów nież w tym przypadku integracja T-DNA zacho-
nukleolitycznych i importu jądrowego. dzi drogą rekombinacji homologicznej.
TRANSFER T-DNA DO KOMÓREK LUDZKICH
Pierwsze informacje na temat oddziaływań nak skuteczny w zwalczaniu infekcji
między Agrobacterium a organizmem ludzkim wywołanej przez Agrobacterium). Stwierdzo-
dotyczą zakażeń szpitalnych. Ponieważ bakte- ne dotychczas nieliczne w skali S
wiatowej bak-
rie z rodzaju Agrobacterium postrzegane są teremie spowodowane przez Agrobacterium
przede wszystkim jako patogeny roS
lin, ich wy- radiobacter sugerują, że w zasadzie bakteria ta
izolowanie z próbek pochodzących z pomiesz- nie stanowi poważnego zagrożenia dla zdro-
czeń szpitalnych traktowano początkowo jako wia ludzi, za wyjątkiem pacjentów o obniżonej
kontaminację lub też jako organizm o niskiej odpornoS
ci, szczególnie tych, którzy mają zain-
patogenicznoS
ci dla ludzi. Jednakże, do 2002 r. stalowany na stałe cewnik dożylny. Należy ta-
stwierdzono 26 przypadków bakteremii kże pamiętać, że wszystkie stwierdzone do tej
(obecnoS
ć bakterii we krwi) spowodowanych pory bakteremie wywołane były przez niepato-
przez Agrobacterium radiobacter. CzternaS
cie genny dla roS
lin gatunek A. radiobacter, który
z nich to zakażenia związane z dożylnymi cew- pozbawiony jest plazmidu pTi, a tym samym
nikami zainstalowanymi na stałe (np. u pacjen- niezdolny jest do transferu T-DNA i transforma-
tów poddawanych chemioterapii przeciwno- cji genetycznej roS
lin.
wotworowej). SzeS
ć kolejnych przypadków to MożliwoS
ć przeniesienia T-DNA z komórek
zapalenie otrzewnej, najczęS
ciej po przepro- Agrobacterium do komórek ludzkich (Ryc. 1)
wadzanej stale dializie otrzewnowej. Pozostałe zasugerowały wyniki badań prowadzonych w
przypadki dotyczą dwóch bakteremii nie laboratorium prof. Barbary Hohn (Instytut Fie-
związanych z założeniem weflonu, jeden przy- dricha Mieschera w Bazylei) nad rolą sekwen-
padek zapalenia wsierdzia po wstawieniu pro- cji NLS białek bakteryjnych w imporcie kom-
tezy zastawki, jeden przypadek bakteremii po pleksów T-DNA do jąder komórek eukariotycz-
transplantacji szpiku kostnego oraz dwa przy- nych (ZIEMIENOWICZ i współaut. 1999). Wyka-
padki infekcji układu moczowego. Szpitalne zano, iż import rekonstruowanych in vitro
izolaty Agrobacterium cechuje duża różnorod- kompleksów T-DNA do jąder permeabilizowa-
noS
ć genetyczna, a także opornoS
ć na więk- nych komórek HeLa zachodzi bardzo wydajnie
szoS
ć antybiotyków (latamoxef okazał się jed- poprzez komórkowy mechanizm importu
350 ALICJA ZIEMIENOWICZ
jądrowego zależny od NLS i importyn. Odkry- rek nerwowych. Stwierdzono ponadto, że
cie to może mieć fundamentalne znaczenie dla transfer T-DNA do komórek ludzkich zależny
ulepszenia metod terapii genowej, gdyż wyka- był od bakteryjnych białek wirulencji oraz od
zało możliwoS
ć obejS
cia jednej z jej barier jaką białek umożliwiających adhezję bakterii do ko-
jest transport DNA przez błonę jądrową, szcze- mórek gospodarza. Już wczeS
niejsze badania
gólnie w przypadku terapii zróżnicowanych sugerowały, że bakterie patogenne wykorzy-
komórek, które nie ulegają podziałom. stują podobne mechanizmy, aby przyłączyć się
Pierwszy dowód eksperymentalny na zdol- do powierzchni komórek roS
linnych i zwierzę-
noS
ć Agrobacterium do genetycznej transfor- cych. Na przykład, roS
linne białko podobne do
macji komórek ludzkich opublikowany został witronektyny prawdopodobnie działa jako re-
zaledwie rok temu (KUNIK i współaut. 2001). ceptor dla Agrobacterium, a zwierzęce witro-
Przeprowadzona w warunkach laboratoryj- nektyny pełnią istotną rolę w kolonizacji go-
nych 2-dniowa kokultywacja in vitro hodowli spodarzy przez szereg patogennych gatunków
komórek ludzkich z komórkami Agrobacte- bakterii, takich jak streptokoki, Staphylococcus
rium tumefaciens, a następnie selekcja linii ko- aureus i inne. Ponadto, analiza genetyczna linii
mórkowych w pożywce zawierającej antybio- ludzkich komórek transgenicznych uzyska-
tyk selekcyjny (na którego opornoS
ć gen znaj- nych poprzez transformację genetyczną z uży-
dował się w T-DNA) doprowadziła do uzyska- ciem Agrobacterium, choć jeszcze zbyt uboga
nia szeregu komórkowych linii transgenicz- na to by wysuwać końcowe wnioski, zdaje się
nych. Dotyczyło to nie tylko szybko dzielących potwierdzać przypuszczenia, że wzór integra-
się komórek HeLa, ale także dwóch linii komó- cji T-DNA do genomu ludzkiego jest zbliżony
rek zróżnicowanych: komórek nerek i komó- do wzoru znanego nam z komórek roS
linnych.
PODSUMOWANIE
ZdolnoS
ć Agrobacterium do przenoszenia tumorów. Zakres gospodarzy Agrobacterium
fragmentu jego DNA do komórki roS
linnej do- nie jest ograniczony jedynie do roS
lin. Bakterie
starcza biotechnologii roS
lin skutecznego na- z gatunku A. tumefaciens mogą przenosić DNA
rzędzia, i dlatego też transfer genów za poS
red- do komórek bakterii tego samego lub innych ga-
nictwem Agrobacterium jest jedną z powszech- tunków (koniugacja bakteryjna), jak również
nie stosowanych technik tworzenia roS
lin trans- do komórek innych mikroorganizmów, takich
genicznych. We wczeS
niejszych dekadach me- jak drożdże Saccharomyces cerevisiae, czy też
toda ta ograniczona była jedynie do roS
lin dwu- do komórek innych grzybów (Rys. 1). Niedaw-
liS
ciennych ze względu na stosowanie testu na no udokumentowany transfer T-DNA A. tume-
tworzenie guzów jako wskax
nika infekcji. Do- faciens do komórek ludzkich wskazuje, że za-
piero póx
niej stało się oczywiste, że pomimo iż sięg gospodarzy tej bakterii jest praktycznie nie-
Agrobacterium indukuje tworzenie tumorowa- ograniczony. Odkrycie to ma jednak bardziej
tych naroS
li jedynie na roS
linach dwuliS
cien- istotne znaczenie, gdyż sugeruje możliwoS
ć za-
nych, bakteria ta infekuje również roS
liny jed- stosowania Agrobacterium jako wektora w te-
noliS
cienne, nie wywołując jednakże tworzenia rapii genowej.
PLASMID TRANSFER BETWEEN THE BACTERIAL AND EUKARYOTIC CELLS
S u mma r y
Horizontal gene transfer (HGT) is characterized T-DNA transfer from Agrobacterium to plant cells. The
by a stable transfer of genetic information from one or- ability of Agrobacterium to transfer a fragment of its
ganism to another. This kind of genetic exchange oc- DNA to plant cell provides a powerful tool for plant
curs mainly between prokaryotic organisms (bacterial biotechnology, and therefore the Agrobacterium-me-
conjugation), whereas cases of HGT between pro- diated DNA transfer is one of the most commonly used
karyotic and eukaryotic organisms are extremely rare. techniques of plant transformation. In early days this
Some reports describe gene transfer between method was restricted only to the dicotyledonous
Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae cells plants, since it was believed that Agrobacterium could
that resembles bacterial conjugation. However, the infect dicots solely. This was due to the use of tumor
only example of gene transfer between prokaryotic formation tests as indication of bacterial infection.
cells and the cells of higher eukaryotes is the case of Later, it was found out that although Agrobacterium
Transfer plazmidów między bakteriami a komórkami eukariotycznymi 351
indeed induced tumors only on dicotyledonous bacterial species from the same family, Rhizobiaceae,
plants, it was able to infect monocotyledonous plants as well as to other microorganisms, such as yeasts
as well, but without tumor formation. The host range S. cerevisiae, filamentous fungi or cultivated mush-
of Agrobacterium is not restricted to plants only. rooms. Most recently, transfer of DNA from
Agrobacterium is able to transfer DNA also to other Agrobacterium to human cells has been documented.
LITERATURA
BINNS A. N., COSTANTINO P., 1998. The Agrobacterium NAKIELNY S., DREYFUSS G., 1999. Transport of proteins
oncogenes. [W:] The Rhizobiaceae. SPAINK H. P., and RNAs in and out of the nucleus. EMBO J. 9,
KONDOROSI A., HOOYKAAS P. J. J. (red.), Kluwer Aca- 3077 3084.
demic Publishers, Dordrecht, The Netherlands, NISHIKAWA M., SUZUKI K., YOSHIDA K., 1992. DNA inte-
251 266. gration into recipient yeast chromosomes by tran-
DE GROOT M. J., BUNDOCK P., HOOYKAAS P. J., 1998. Agro- s-kingdom conjugation between Escherichia coli i
bacterium tumefaciens-mediated transformation Saccharomyces cerevisiae. Current Genetics 21,
of filamentous fungi. Nature Biotechnol. 16, 101 108.
839 842. ROSSI L., TINLAND B., HOHN B., 1998. Role of virulence
DE LA CRUZ F., LANKA E., 1998. Function of the Ti-pla- proteins of Agrobacterium in the plant. [W:] The
smid Vir proteins: T-complex formation and Rhizobiaceae. SPAINK H. P., KONDOROSI A.
transfer to the plant cell. [W:] The Rhizobiaceae. HOOYKAAS P. J. J. (red.), Kluwer Academic Pu-
SPAINK H. P., KONDOROSI A., HOOYKAAS P. J. J. (red.), blishers, Dordrecht, The Netherlands, 302 330.
Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Net- SHENG J., CITOVSKY V., 1996. Agrobacterium-plant cell
herlands, 267 279. DNA transport: have virulence proteins, will
FERRAND S. K., 1998. Conjugal plasmids and their travel. Plant Cell 8, 1699 1710.
transfer. [W:] The Rhizobiaceae. SPAINK H P., TINLAND B., 1996. The integration of T-DNA into plant
KONDOROSI A., HOOYKAAS P. J. J. (red.), Kluwer Aca- genomes. Trends in Plant Science 1, 178  184.
demic Publishers, Dordrecht, The Netherlands, TINLAND B., HOHN B., 1995. Recombination between
199 233. prokaryotic and eukaryotic DNA: integration of
GELVIN S. B., 2000. Agrobacterium and plant genes Agrobacterium tumefaciens T-DNA into the plant
involved in T-DNA transfer and integration. Ann. genome. Genetic Engineering 17, 209 229.
Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 51, 223 256. ZHU J., OGER P. M., SCHRAMMEIJER B., HOOYKAAS P.,
GRIMSLEY N., HOHN T., DAVIES J.W., HOHN B., 1987. Agro- FARRAND S. K., WINANA S. C., 2000. The bases of
bacterium-mediated delivery of infectious maize crown gall tumorigenesis. J. Bacteriol. 182,
streak virus into maize plants. Nature 325, 3885 3895.
177 179.
ZIEMIENOWICZ A., G�RLICHD., LANKA E., HOHN B., ROSSI
HEINEMANN J. A., SPRAGUE G. F., 1989. Bacterial conjuga-
L., 1999. Import of DNA into mammalian nuclei
tive plasmids mobilize DNA transfer between bac-
by proteins originating from a plant pathogenic
teria and yeast. Nature 340, 205 209.
bacterium. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 96,
KUNIK T., TZFIRA T., KAPULNIK Y., GAFNI Y., DINDWALL C. i
3729 3733.
CITOVSKY V., 2001. Genetic transformation of
ZIEMIENOWICZ A., 2001. Odyssey of Agrobacterium
HeLa cells by Agrobacterium. Proc. Natl. Acad. Sci.
T-DNA. Acta Biochim. Polon. 48, 623 635.
USA 98, 1871 1876.
LARTEY R., CITOVSKY V., 1997. Nucleic acid transport in
plant-pathogen interactions. Genetic Engineering
19, 201 214.