ĆWICZENIE III
TRANSFORMACJA BAKTERII WEKTOREM GENETYCZNYM.
W celu poznania budowy i funkcji badanego genu należy przenieść jego sekwencję DNA lub cDNA z
organizmu macierzystego do nowego gospodarza, którym zazwyczaj są komórki bakterii, drożdży lub
eukariotycznych linii komórkowych. W przypadku bakterii, zabieg ten zwany jest transformacją i umożliwia
między innymi:
1. Tworzenie bibliotek genomowych lub cDNA w celu klonowania genów.
2. Namnożenie wyselekcjonowanego fragmentu DNA do ilości niezbędnej dla wykonania następnego
eksperymentu.
3. Syntezę in vitro białka kodowanego przez sklonowany fragment.
I. Wektory genetyczne. Wykonanie transformacji możliwe jest po uprzednim połączeniu badanego fragmentu
DNA (insertu) z cząsteczką wektora genetycznego. Wektory genetyczne są narzędziami badawczymi
konstruowanymi na bazie występujących w naturze plazmidów i wirusów. Są one wyposażone w sekwencje
odpowiedzialne za następujące funkcje.
1. Połączenie badanej cząsteczki z wektorem. Reakcja ta, zwana ligacją, odbywa się dzięki połączeniu końców
restrykcyjnych wektora i insertu. Konstruowane obecnie wektory posiadają na ogół szereg różnych,
unikatowych miejsc restrykcyjnych zgromadzonych w jednym rejonie wektora, tzw. polilinkerze. Dzięki
zgrupowaniu miejsc restrykcyjnych w jednym obszarze, niezależnie od tego, jaki enzym restrykcyjny
zostanie użyty, insert zostanie przyłączony do określonej sekwencji regulatorowej wektora, tj. promotor,
terminator, lub do kodowanego przez wektor określonego fragmentu białka.
2. Replikacja w komórkach gospodarza. Wektory genetyczne wyposażone są w miejsca startu replikacji
specyficzne dla danego gospodarza, dzięki czemu mogą utrzymywać się w komórkach jako niezależne
replikony. Wektory przeznaczone do transfekcji komórek eukariotycznych mogą być wyposażone w dwa
różne miejsca startu replikacji, tj. specyficzne dla bakterii, w której wektor jest przygotowywany oraz
specyficzne dla gospodarza ostatecznego.
3. Ekspresja insertu. W celu uzyskania ekspresji wklonowanego fragmentu DNA, wektory wyposażone są w
sekwencje regulatorowe (promotory, terminatory), umożliwiające transkrypcję insertu i translację białka
kodowanego przez insert.
4. Selekcja. Dzięki genom selekcyjnym możliwe jest odróżnienie komórek, do których został wprowadzony
wektor od pozostałych. W przypadku wektorów bakteryjnych są to na ogół geny kodujące białka nadające
komórkom odporność na antybiotyk zawarty w pożywce. Dodatkowo, niektóre wektory wyposażone są w
geny markerowe, ułatwiające identyfikację tych transformantów, które zawierają wektor połączony z
insertem, np. gen ²-galaktozydazy wykorzystywany w teÅ›cie Ä…-komplementacji.
5. Wektory często wyposażone są również w geny markerowe. Ligacja wektora tego typu z badaną sekwencją
regulatorową, np. z promotorem, prowadzi do ekspresji genu markerowego w układzie żywym. W innych
przypadkach, geny markerowe dołączone do sekwencji badanego białka, umożliwiają jego lokalizacją po
wprowadzeniu np. do linii komórkowych lub organizmów transgenicznych.
II. Ligacja. W celu połączenia wektora i insertu, czyli wytworzenia wiązań fosfodiestrowych pomiędzy tymi
cząsteczkami, wykorzystywany jest enzym ligaza i odpowiednie końce restrykcyjne. Właściwy dobór enzymów
restrykcyjnych ma zasadnicze znaczenie dla wyniku ligacji. Możliwe są następujące warianty tej reakcji:
1. Obie cząsteczki trawione są taką samą parą enzymów, kreujących różne lepkie końce (Rys. 1). W tym
przypadku możliwe jest wprowadzenie insertu tylko w jednej orientacji w stosunku do wektora. Fakt ten jest
istotny w przypadku, gdy sekwencja insertu powinna znajdować się pod kontrolą sekwencji regulatorowych,
np. promotorowych, lub markerowych, obecnych w wektorze. Ligacja tego typu charakteryzuje siÄ™
stosunkowo wysoką wydajnością a proporcja molarna cząsteczek insertu do wektora w reakcji powinna
wynosić: 2-5 / 1.
2. Obie cząsteczki trawienie są tym samym enzymem, kreującym identyczne lepkie końce (Rys. 2). W tym
przypadku insert można wklonować do wektora w obu orientacjach. Ligacja tego typu charakteryzuje się
niższą wydajnością niż w poprzednim przypadku, gdyż identyczne lepkie końce wektora będą łączyć się
preferencyjnie ze sobą z pominięciem insertu. Dlatego w celu zwiększenia wydajności ligacji wektor po
trawieniu należy poddać reakcji defosforylacji z użyciem alkalicznej fosfatazy. Enzym ten usuwa grupy
fosforanowe z 5 końców cząsteczki DNA, co uniemożliwia ligację prowadzącą do zamykania się pustego
wektora. Wektor może natomiast ligować z cząsteczką insertu, gdyż ta zawiera grupy fosforanowe na 5
1
końcach. Podniesienie wydajności reakcji można również uzyskać zawyżając proporcję insertu w stosunku
do wektora np. 5-10 / 1.
3. Obie cząsteczki trawione są enzymami kreującymi tępe końce (Rys. 3). W tym przypadku możliwe jest
uzyskanie obu orientacji insertu w stosunku do wektora, gdyż tępe końce są ze sobą zawsze kompatybilne,
niezależnie od tego, jakich enzymów użyto do ich przygotowania. Jest to ważna zaleta tego wariantu ligacji,
gdyż w praktyce często nie ma możliwości dobrania dwóch takich samych miejsc restrykcyjnych w wektorze
i insercie. Wadą ligacja tego typu jest bardzo niska wydajność tej reakcji, gdyż brak lepkich końców utrudnia
wiązanie się cząsteczek DNA. Zwiększenie wydajności ligacji można w tym przypadku uzyskać stosując
następujące zabiegi: zwiększenie stężenia obu cząsteczek DNA w mieszaninie reakcyjnej, dodanie do
mieszaniny związków zwiększających lokalne stężenie obu cząsteczek, np. glikol polietylenowy (PEG),
zwiększenie proporcji ilości insertu w stosunku do wektora (>10/ 1), zastosowanie ligazy o wyższej
aktywności. W przypadku, gdy chcemy uniknąć ligacji fragmentów posiadających tępe końce możemy
dołączyć do nich odpowiednie linkery (adaptery). Linkerami nazywamy krótkie, uzyskane syntetycznie
oligonukleotydy, zawierające wybrane miejsca restrykcyjne. Linkery mogą zawierać jednoniciowe, gotowe
do ligacji końcówki lub pełne sekwencje dwuniciowe, które po przyłączeniu do insertu muszą zostać
strawione restrykcyjnie. Ponieważ przygotowane syntetycznie linkery można stosować w bardzo wysokich
stężeniach molarnych, ich przyłączenie do tępych końców innych cząsteczek DNA nie stanowi problemu.
Linkery tego typu często dołączane są do sekwencji cDNA podczas przygotowywania bibliotek cDNA.
4. Obie cząsteczki trawione są różnymi enzymami kreującymi różne lepkie końce (Rys. 4). W przypadku, gdy
w wektorze i insercie brak jest tych samych miejsc restrykcyjnych, należy sprawdzić, czy istniejące miejsca
restrykcyjne, dają kompatybilne końce, które można będzie ze sobą połączyć, np. BclI i BamHI (Rys.4).
Jeżeli tak nie jest, wówczas należy doprowadzić do stępienia różnych  lepkich końców , np. stosując
fragment Klenowa polimerazy I i połączyć fragmenty DNA tak, jak w przypadku ligacji tępych końców.
5. Generowanie miejsc restrykcyjnych przy użyciu PCR. Jeżeli do wektora chcemy wprowadzić fragment DNA
uzyskany w wyniku reakcji PCR, wówczas w celu ułatwienia procesu ligacji można tak zaprojektować
startery, aby oprócz sekwencji homologicznych do matrycy zawierały one również odpowiednie miejsca
restrykcyjne.
Bam HI Eco RI Bam HI Bam HI Sma I Sma I Bcl I Bcl I
GATCC G GATCC G CCC GGG GATCA T
G CTTAA G CCTAG GGG CCC T ACTAG
INSERT
12 3 4
G AATTC G GATCC GAG CGG G GATCC
CCTAG G CCTAG G CTC GCC CCTAG G
Bam HI Eco RI Bam HI Bam HI Mbi I Mbi I Bam HI Bam HI
WEKTOR
III. Wprowadzenie DNA do komórek bakteryjnych.
Komórki bakterii przygotowane do przyjmowania DNA z zewnątrz nazywamy komórkami kompetentnymi.
Stan kompetencji można uzyskać zawieszając bakterie w buforach zawierających kationy Ca+2 lub Rb+. Tak
przygotowane komórki, zawieszone w buforze zawierającym glicerol, mogą być przechowywane w  80oC przez
dłuższy okres czasu, bez utraty kompetencji. Wprowadzenie wektora do bakterii odbywa się podczas inkubacji
komórek kompetentnych razem z DNA w temp +42oC.
Inną metodą wprowadzania DNA do komórek bakterii jest elektrotransformacja (elektroporacja), podczas
której preparat zawierający zawiesinę komórkową i DNA poddawany jest działaniu impulsów elektrycznych (4-
5 milisekund) o wysokim napięciu ( 12,3-15 kV/ cm).
IV. Selekcja transformantów.
Po transformacji należy wyselekcjonować te klony, które zawierają wektor połączony poprawnie z insertem.
1. Identyfikacja klonów z wektorem plazmidowym. Pojedyncza komórka bakterii po transformacji, czyli
przyjęciu wektora kodującego gen selekcyjny, uzyskuje zdolność do wzrostu na pożywce z antybiotykiem,
dając początek kolonii identycznych komórek z powielonymi cząsteczkami wektora.
2. Identyfikacja klonów z wektorem fagowym. Komórki po transformacji wektorem fagowym wylewane są na
szalkę selekcyjną pozbawioną antybiotyku, dzięki czemu wszystkie komórki ulegają podziałom. Fagi obecne
w pojedynczych, stransformowanych komórkach po namnożeniu infekują komórki sąsiednie. Obszary zajęte
2
przez zainfekowane komórki, widoczne są na tle pozostałych komórek dzięki słabszemu wzrostowi tworząc
obszary zwane pseudołysinkami, np. fag M13. W przypadku, gdy wektor fagowy prowadzi do lizy komórek,
np. fag , obszary zainfekowane tworzÄ… tzw. Å‚ysinki.
3. Spośród klonów bakeryjnych zawierających wektor należy wyselekcjonować te klony, w których wektor
połączony jest z insertem. W tym celu, zarówno w przypadku wektorów plazmidowych jak i fagowych,
wykorzystywane są następujące techniki:
a. Test ą-komplementacji. W wielu wektorach genetycznych polilinker zlokalizowany jest pomiędzy
promotorem operonu laktozowego a sekwencjÄ… kodujÄ…cÄ… 3 fragment genu markerowego, ²-galaktozydazy
(gen lacZ ). Fragment ten koduje polipeptyd uzupełniający uszkodzony gen tego enzymu obecny w genomie
szczepów E.coli używanych do transformacji. W wektorach pozbawionych insertu, polipeptyd kodowany
przez wektor ulega ekspresji a powstające białko w kompleksie z podjednostką kodowaną przez genom
bakteryjny, zamienia syntetyczny substrat obecny w pożywce, X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolo-D-
galaktozyd) na produkt, który nadaje kolonii barwę niebieską. Wprowadzenie insertu do polilinkera prowadzi
do inaktywacji genu markerowego, w efekcie czego kolonia ma barwÄ… biaÅ‚Ä…. Aktywność genu ²-
galaktozydazy indukujemy dodając do pożywki IPTG (izopropylotiogalaktozyd), syntetyczny induktor, który
blokuje represor lac.
b. Elektroforeza i analiza restrykcyjna DNA. Z klonów uzyskanych po transformacji izolujemy plazmidowy
DNA a następnie porównujemy jego migrację elektroforetyczną z pustym wektorem. Wklonowany insert
powoduje opóz
nienie migracji wektora. Ponadto, w celu sprawdzenia długości wklonowanego insetu
możemy go wyciąć z wektora przy użyciu odpowiednich enzymów restrykcyjnych a następnie oszacować
jego wielkości na podstawie elektroforezy z wzorcem mas cząsteczkowych.
c. PCR. Jeżeli dysponujemy starterami specyficznymi dla sekwencji insertu, możemy je wykorzystać do reakcji
PCR, w których matrycą jest DNA poszczególnych klonów bakteryjnych po transformacji. Jeżeli nie
dysponujemy starterami specyficznymi dla insertu, możemy użyć starterów przyłączających się do sekwencji
po obu stronach polilinkera, np. M13, T7, SP6. Startery te umożliwią amplifikację insertu, ewentualnie
pustego polilinkera.
d. Hybrydyzacja kolonijna. Test ten wykonuje się na ogół w celu identyfikacji w bibliotekach cDNA lub
genomowych klonu zawierajÄ…cego poszukiwanÄ… sekwencjÄ™, tzw. przeglÄ…d (ang. screening). Do hybrydyzacji
kolonijnej znakowany DNA, o sekwencji homologicznej do insertu, wykorzystywany jest jako sonda
hybrydyzacyjna.
Transformacja szczepu TG1 E.coli wektorem wektorem plazmidowym - pBluescript KS+
Tab. 1. Bufory używane do przygotowania komórek kompetentnych.
roztwór CM1 CM2
RbCl 1,2 % 0,12 %
NaOAc pH 5,6 10 mM 10 mM
MnCl2 4H2O 50 mM 5 mM
CaCl2 - 70 mM
NaCl 5 mM -
glicerol 15 % 15 %
Odczynniki i sprzęt
- pożywki LB 100 ml (wzrost log.) - mieszanina ligacyjna
- IPTG 23,8 mg/ml (w H2O)
- pożywka z agarem - blok grzejny na +42oC
- X-Gal 50 mg/ml (w DMF lub
- szalki - bagietka
DMSO)
- kuwety do spektrofotometru - tipsy i eppendorfki
- bufory CM1 i CM2
- probówki wirówkowe 20 ml
- pożywki LB 5 ml (zaszczepki)
- pojemniki z lodem
3
Postępowanie:I.
Przygotowanie szalek selekcyjnych
1. Do naczynia z płynną pożywką LB naważyć agar w ilości 1,5g/100ml (1,5%)
2. Pożywkę autoklawować lub zagotować.
3. Do pożywki ostudzonej do temp. ok. +60oC dodać antybiotyk, a następnie po zamieszaniu całość
wylać na szalki w komorze laminarnej lub przy włączonym palniku gazowym.
4. Po polimeryzacji agaru szalki przechowywać w +4oC.
II. Przygotowanie komórek kompetentnych
1. Pojedynczą kolonię bakterii szczepu E.coli TG1 użyć do zaszczepienia hodowli zawierającej 5 ml
pożywki LB bez antybiotyku. Pożywkę wytrząsać przez noc w temp. +37oC.
2. Hodowlę rozcieńczyć świeżą pożywką LB w stosunku 1:100, tzn. 0,5ml hodowli do 50 ml
pożywki.
3. Bakterie inkubować przez około 100 min. w +37oC w łaz
ni z wytrzÄ…saniem.
4. Zmierzyć absorbancję hodowli przy długości fali 600 nm. Hodowlę prowadzić do momentu, aż
zawiesina komórkowa uzyska OD600 = 0,3-0,4. Odpowiada ona wczesnej fazie wzrostu
logarytmicznego.
5. Hodowlę schłodzić w lodzie do temp. +4oC.
6. Schłodzone bakterie wirować 10 min. przy 4000 rpm, w +4oC.
7. Usunąć supernatant, a osad bakterii zawiesić ostrożnie, przy pomocy pipety automatycznej, w 10
ml zimnego roztworu CM1.
8. Całość inkubować w lodzie przez 5 min.
9. Zawartość probówki wirować przy 5000 rpm przez 10 min. w +4oC.
10. Powstały supernatant usunąć przy pomocy pipety automatycznej, a osad zawiesić bardzo ostrożnie
w 500źl zimnego roztworu CM2.
11. Mieszaninę inkubować w lodzie przez 30 min. Tak przygotowane komórki kompetentne mogą być
użyte bezpośrednio do transformacji lub mogą zostać zamrożone w ciekłym azocie i być
przechowywane w  80oC. Przed zamrożeniem bakterie należy rozporcjować w takich ilościach,
aby po rozmrożeniu nie trzeba było zamrażać ich ponownie.
III. Transformacja komórek plazmidowym DNA
1. 100 źl komórek kompetentnych przenieść delikatnie do probówki eppendorfa.
2. Do bakterii dodać 5źl mieszaniny ligacyjnej zawierającej ok. 100 ng DNA wektora.
3. Mieszaninę inkubować w lodzie przez 10 min.
4. Przeprowadzić szok cieplny inkubując mieszaninę w temp. +42oC przez 2 min. Na tym etapie
dochodzi do wniknięcia wektora do komórek. Po tym czasie mieszaninę szybko przenieść do lodu.
5. Po schłodzeniu mieszaniny dodać 500źl pożywki LB i całość inkubować w +37oC przez 20 min.
W tym czasie bakterie zregenerują ścianę komórkową i rozpoczną syntezę białek
odpowiedzialnych za odporność na ampicylinę.
6. Na szalkę zawierającą pożywkę LB z agarem i ampicyliną (100 źg/ml), wylać 12 źl X-Gal i 6 źl
IPTG (nie należy mieszać ze sobą stężonych roztworów X-Gal i IPTG), oraz 50 źl zawiesiny
bakterii. Całość dokładnie rozprowadzić po powierzchni pożywki zakrzywioną, sterylną bagietką.
7. Płytki pozostawić do chwili aż cały roztwór zostanie wchłonięty, a następnie odwrócić i inkubować
przez noc w temp. +37oC.
Uwaga: Prace należy wykonywać w warunkach sterylnych - sprzęt oraz odczynniki powinny być
autoklawowane. Roztwory, które nie mogą być autoklawowane, powinny być sterylizowane przez
sączenie z wykorzystaniem filtru bakteriologicznego (0,22 źm).
4