ZASTOSOWANIE LIPAZ W SYNTEZIE ORGANICZNEJ
Większość enzymów stosowanych w syntezach organicznych stanowią
hydrolazy, a wśród nich lipazy ( EC 3.1.1.3), katalizujące w warunkach
fizjologicznych hydrolizÄ™ triacylogliceroli. SÄ… one szeroko rozpowszechnione w
przyrodzie; występują w :
- organizmach zwierzęcych
- roślinach
- mikroorganizmach
WA
AÅšCIWOÅšCI LIPAZ:
" Rozpuszczalne w wodzie
" Maksymalną aktywność wykazują w zakresie pH od 5,6 do 8,5
" Nie wymagają kofaktorów
" Są stabilne w środowisku niewodnym
" Optymalna temperatura od 30 do 40° C
" Charakteryzują się zdolnością do przyjęcia konformacji odpowiednich dla
substratów znacznie różniących się wielkościami cząsteczki zachowując
jednocześnie enancjoselektywność
" Do przeprowadzenia reakcji często wystarczają preparaty średnio
oczyszczone, na przykład proszki acetonowe
" Aktywacja na granicy faz woda-tłuszcz
" Lipazy charakteryzuje specyficzność substratów, a także regioselektywność i
enancjoselektywność
" Wykazują specyficzność w stosunku do hydrolizowanego wiązania estrowego
Zastosowanie rozpuszczalnika organicznego jako środowiska reakcji ma ogromny
wpływ na kinetykę lipaz, stabilność biokatalizatora, jego specyficzność substratową,
regioselektywność i enancjoselektywność. Rozpuszczalniki hydrofobowe mogą
denaturować enzym, penetrując do hydrofobowego białka lub odrywając warstewkę
wody z jego powierzchni.
Miarą hydrofobowości rozpuszczalników jest jego log P, gdzie P jest
współczynnikiem podziału danego rozpuszczalnika pomiędzy oktanol i wodę
- rozpuszczalniki hydrofobowe (log P > 3 lub 4),np. toluen, heksan, oktan
- bardziej hydrofilowe ( log P<2), np. benzen, chloroform, rozpuszczalniki mieszajÄ…ce
siÄ™ z wodÄ…
W wyniku enzymatycznych syntez powstajÄ…:
" leki
" herbicydy
" insektycydy
" emulgatory
" substancje zapachowe
" aromaty
" słodziki
" kwasy
" alkohole
" polimery
" peptydy
" steroidy
" cukry
" lipidy
" zw. metaloorganiczne
Metody immobilizacji lipaz:
" Wiązanie ze stałymi nośnikami organicznymi ( celuloza, chityna, chitozan,
agaroza), lub nieorganicznymi ( celit, żel krzemionkowy), a także żywice
polimerowe
" Zamknięcie w odwróconych micelach, tworzonych przez wodną zawiesinę
enzymu w rozpuszczalniku niepolarnym, stabilizowanÄ… zwiÄ…zkami
powierzchniowo czynnymi. Odwrócone micele stosuje się w hydrolizie :
triglicerydów, syntezie glicerydów, transestryfikacji
Lipazy ktalizuja reakcje:
- hydrolizy
- estryfikacji
- transestryfikacji
- laktonizacji
- inne
1). REKCJE HYDROLIZY KATALIOWANE PRZEZ LIPAZY:
Reakcje hydrolizy prowadzone są najczęściej w wodnych roztworach
buforowych o pH optymalnym dla aktywności enzymu. Dodawane do nich
rozpuszczalniki organiczne ułatwiają rozpuszczanie substratów oraz stworzenie
powierzchni międzyfazowej, koniecznej do aktywacji lipaz. Hydrolizę można tez
prowadzić w roztworach organicznych, nie mieszających się z wodą, ale nią
nasyconych.
a) Otrzymywanie chiralnych estrów i kwasów:
R1 *COOR2 + H2O Ô! (R1 *COOH + R1COOR2 ) + R2OH
chiralne produkty
b) Otrzymywanie chiralnych estrów i alkoholi:
* *
R1COOR2 + H O Ô! (R2 OH + R1COOR2* ) + R1COOH
2
chiralne produkty
R1, R2 = alkil, aryl
Wśród wielu reakcji katalizowanych przez lipazy na uwagę zasługują reakcje,
w których substratami są prochiralne diestry.
Przykładem takiej reakcji jest, katalizowana przez lipazę z Pseudomonas
fluorescens, hydroliza 1,3  diacetoksy-2-metylopropanu jej rezultatem jest chiralny
2 acetoksy1 hyroksy-2-metylopropan o konfiguracji ( R ) , wykorzystywany w
syntezie antybiotyków
lipaza ze szczepu
Pseudomonas fluorescens
AcO OAc
AcO OH
H
Me
Me
H
Estry karboksylowe azyrydyn są syntonami w syntezie aminokwasów oraz
antybiotyków ß - laktamowych. Szczególnie czÄ™sto do katalizowania reakcji hydrolizy
ich estrów stosuje się lipazy ze szczepów: Rhizopus delemar i Candida cylindracea.
Substratami sÄ… tu estry N - podstawionych azydryn.
lipaza z
COOMe
COOMe
COOMe
Candida Cylindracea
N-R N-R
+ N-R
COOMe COOMe
COOMe
(+) lub (-)
(+/-) (+) lub (-)
Lipazy katalizują enancjoselektywną hydrolizę acyklicznych i cyklicznych estrów
2-azydoalkoholi, prekursorów 2-aminoalkoholi.Substancje te są prekursorami wielu
związków istotnych w medycynie.
R
R
R R
R R
+
N3
C3H7COO
N3 C3H7COO N3
HO
R=C2H5,C3H7 R=R,(cis),(trans)
R= (CH3)3,Ph
R=H
 Grupę niesterydowych leków przeciwzapalnych stanowią w większości rozbudowane
przestrzennie kwasy. Stereoselektywna hydroliza ich estrów okazała się doskonałą
metodą otrzymywania tych leków. Jednym z tych leków jest naproksen :
lipaza z
OMe
Candida cylindracea
COOH
O
OMe
OMe
metodą enancjoselektywnej hydrolizy estrów, katalizowanej lipazami, otrzymuje się
również leki o działaniu:
- antydepresyjnym
- regulującym ciśnienie krwi
- antybakteryjnym
- przeciwgrzybicznym
- antywirusowym
- regulatory tkankowe  prostaglandyny
Produkt y
ródło lipazy
nproksen Candida
cptoprol Aspergillus Niger
a tokaterol Candida
propranolol Peudomonas
Otrzymywanie optycznie czynnych aminokwasów. Przykładem jest rozdział
mieszaniy estrów 2  chloroetylowych N  benzyloksykarbonyloaminokwasów
lipaza z
NHZ NHZ
Aspargillus niger NHZ
+
COO(CH2)2Cl COOH
R R
COO(CH2)2Cl
R
R=alkil,C6H5CH2
2). REAKCJE ESTRYFIKACJI:
Lipazy w roztworach niewodnych katalizujÄ… reakcjÄ™ estryfikacji alkoholu kwasami
karboksylowymi lub ich bezwodnikami.
Na drodze enzymatycznej estryfikacji bezwodnikami kwasowymi uzyskano wiele
alkoholi drugorzędowych
lipaza z
R
Pseudomonas
R
R
+
bezwodnik
OH
OH
OH R
R
R
kwasowy
(S) (R)
Chiralne prekursory leków, z grupy ß-adrenoergicznych, otrzymuje siÄ™ w wielu
reakcjach estryfikacji bÄ…dz
hydrolizy.
Przykładem są reakcje estryfikacji pochodnych aminopropanodioli:
OH
lipaza z
ArO
N
trzustki wieprzowej
H (CCl3CO)2)
+
R
R
OH OCOOCCl2
ArO
ArO
N
N
H +
H
R
R
R
R
R = COMe, COPh
Ar = Ph, 2-MeO-Ph, 4-AcNHPh
R = H,Cl
Lipazy znalazły zastosowanie w produkcji triglicerydów kwasów nienasyconych.
Chemiczne metody otrzymywania triglicerydów nie zdają egzaminu w przypadku
niestabilnych, wymagających łagodnych warunków kwasów wielonienasyconych.
Immobilizowana lipaza ze szczepu Candida antarctita katalizuje z dużą wydajnością
estryfikacjÄ™ glicerolu kwasem cis  5,8,11,14,17  eikozapentaenowym, w wyniku
czego otrzymuje siÄ™ czysty trigliceryd tego nienasyconego kwasu.
3). REAKCJE TRANSESTRYFIKACJI:
W wyniku reakcji octanów azyrydyny z n - butanolem w eterze diizopropylowym,
katalizowanej lipazÄ… P, powstajÄ… optycznie czynne produkty, prekursory
aminokwasów i antybiotyków.
R
R
n-butanol
N
N
AcO
HO
OAc
HPr2O
OAc
lipaza P
R = SO2C6H4CH3
R = COOCH2Ph
Specyficzność lipaz katalizujących reakcję transestryfikacji stwarza możliwości
otrzymywania różnych produktów przemysłu tłuszczowego:
- wysokogatunkowych tłuszczów
- olejów
- substancji cenionych w żywieniu dietetycznym
- wyrobach cukierniczych
Przykładem jest otrzymywanie ekwiwalentów tłuszczowych, a konkretnie substytutu
masła kakaowego, w reakcji transestryfikacji oleju palmowego kw. Stearynowym,
katalizowanej lipazą o specyficzności 1,3
Innym przykładem jest transesryfikacja trójglicerydów wchodzących w skład masła,
prowadząca do otrzymania tłuszczu o niższej temp. topnienia.
W reakcji z alkoholem poliwinylowym, zachodzÄ…cej w eterze diizopropylowym i
katalizowanej przez lipazę z trzustki wieprzowej, następuje rozdział racemicznej
mieszaniny 3,4  epoksymaślanu trichloroetylu. Otrzymuje się optycznie czynny,
aktywny ester, a z drugiego produktu, estru polimeru, po transestryfikacji metanolem
w obecności tej samej lipazy, uzyskuje się chiralny ester metylowy epoksydu.
O li p a z a z tr z u s t k i
O w i e p r z o w ej
C l3 C C H O
2 O ( C H C H O ) n H
2 2
C
H H
O
O C
+
H O ( C H C H ) n C l3 C C H O
2 2 2
C H O H li p a z a z tr z u s tk i
3
w i e p r z o w ej
C
H
C
C H O
3
Transestryfikacja estrów fenoli jest jedną z metod otrzymywania chiralnych alkoholi
pierwszo- i drugorzędowych.
Przykładem reakcji jest selektywne arylowanie alkoholi w chloroformie z udziałem
lipazy z Pseudomonas fluorescens.
lipaza z
Pseudomonas fluoroscens
+
OCOCH3
OH R
OH
R
R
OAc
CH3(CH2)6
R= PhSCH2, PhSO2CH2 PH: CH3CHCH,
4). REAKCJE LAKTONIZACJI:
Lipaza ze szczepu Pseudomonas fluorescens katalizuje wewnÄ…trzczÄ…steczkowÄ…
transestryfikację mezo  hydroksydiestrów, w wyniku której otrzymuje się czynne
laktony.
lipaza ze szczepu
OH
O
Pseudomonas ROOC
P
COOR
izooktan
OH
OH
O
O
O
O
+
O
O
O
O
5). REAKCJE POLIMERYZACJI:
Potencjał katalityczny lipaz znalazł zastosowanie w enzymatycznej i
chemoenzymatycznej syntezie polimerów dzięki swojej specyficzności lipazy
katalizują powstawanie polimerów będących produktami polikondensacji zw.
ZawierajÄ…cych grupÄ™ kwasowÄ… i alkoholowÄ….
W wyniku katalizowanej w eterze przez lipazÄ™ z wieprzowej trzustki
enancjoselektywnej polimerazy Dniestru, zawierającego pierścień epoksydowy,
powstaje optycznie czynny polimer.
O lipaza z trzustki
wieprzowej
+
CI3CCH2OOCCH2CH
CHCH2COOCH2CCI3 HO(CH2)4OH
eter
OOCCH2 O
H
C
C
CH2COO(CH2)4
H
n
Polimery powstajÄ… na drodze katalizowanej przez lipazy transestryfikacji
polimerycznych alkoholi, jak i hydrolizy ich estrów w roztworze wodnym. W obecności
enzymów zachodzi również kopolimeryzacja z otwarciem pierścieni laktozowych.
6). REAKCJA SYNTEZY AMIDÓW:
Lipazy w rozpuszczalnikach organicznych katalizujÄ… syntezÄ™ wiÄ…zania amidowego.
Amidy powstają w wyniku reakcji kwasów tłuszczowych z aminami.
W reakcji ß - hydroksyestrów z aminami w obecnoÅ›ci lipazy z Candida antarctica,
powstają chiralne 3  hydroksyaminy, prekursory 1,3  alkoholi, które są materiałami
wyjściowymi do produkcji leków antydepresyjnych, a także antybiotyków.
lipaza z
R
OEt
Candida antarctica
RNH2
+
OH O
R
OEt
R
NHYR
+
OH O
R = C6H5CH2, CH3(CH2)n
R = CH3,C2H5,CH2Cl
W reakcji mieszaniny racemicznej niesymetrycznych węglanów
winylu z aminami lub alkoholami, wobec lipazy z Candida antarctica, otrzymano
chiralne węglany i karboaminy
O
lipaza z
antarctica
C R1
O
O
R
OH
R1
O
O
lipaza z
O
R O
C
antarctita
R1
NH2 O N
R1
R
H