Biotransformacje w syntezie organicznej
Pierwsze udokumentowane zastosowanie procesów biotechnologicznych miało
miejsce 8000 lat temu, kiedy to na obszarach bliskiego wschodu produkowano piwo.
Jednakże świadome wykorzystanie procesów biotransformacyjnych datuje się dopiero od
początków XIX w. kiedy to uruchomiono przemysłową produkcję octu winnego, w której
biokatalizator stanowiły bakterie octowe.
Popularność jaką cieszą się metody biotechnologiczne w przemyśle chemicznym i
farmaceutycznym wyraz
nie ilustruje skala w jakiej otrzymuje siÄ™ produkty przy pomocy tych
metod (tabela 1).
Tabela 1. Produkcja przemysłowa wybranych związków
chemicznych przy udziale biokatalizatorów
biokatalizator produkt skala [tony/rok]
sukraza dekstranu cyklodekstryny 10
lipaza butanian glicydolu
fumaraza kwas (-)-jabłkowy 102
aminoacylaza (-)-metionina, (-)-walina
b-tyrozynaza (-)-fenyloalanina
lipaza (-)-dopa
hydroksylaza (-)-karnityna
aspartaza kwas (-)-asparaginowy 103
termolizyna aspartam
hydantoinaza (+)-fenyloglicyna
aldonolaktonaza kwas (+)-pantotenowy
nitrylaza akryloamid 104
lipaza masło kakaowe
amidaza penicylanowa kwas 6-aminopenicylowy
izomeraza glukozy fruktoza 106
Metody  bio posiadajÄ… szeregi istotnych zalet:
- wysoka stereo-, regio- i chemoselektywność,
- mała energochłonność, łagodne warunki reakcji, nietoskyczne lub tanie rozpuszczalniki,
unikanie niebezpiecznych i szkodliwych dla środowiska substratów (zielona chemia),
- zadowalająca wydajność,
- immobilizacja enzymów i mikroorganizmów na nośnikach, a przez to możliwość
prowadzenia procesów w trybie ciągłym z efektywnym wykorzystaniem biokatalizatorów.
Należy również wymienić szereg wad, którymi cechują się omawiane metody:
- często żmudna izolacja produktów z mieszaniny reakcyjnej,
- niska produktywność objętościowa (stosunek ilości produktu do objętości reaktora),
- często brak ogólnych reguł pozwalających na racjonalne zaprojektowanie warunków
procesu i idąca za tym konieczność optymalizacji metodą licznych prób.
Za procesy biotechnologiczne uważa się te, które polegają na wykorzystaniu
metabolizmu żywych organizmów, syntetyzujących z prostych związków pożądane produkty,
o bardziej złożonej budowie, przy czym synteza ta przebiega na drodze wielu etapów
przemian biochemicznych. Natomiast procesy biotransformacyjne definiujemy jako
pojedyncze reakcje chemiczne realizowane przy udziale enzymów (izolowanych lub
zawartych w komórkach).
Podział enzymów można przeprowadzić ze względu na rodzaj katalizowanej reakcji
(tabela 2).
Tabela 2. Podział enzymów na klasy
klasa podklasa typ katalizowanej reakcji
oksyreduktazy dehydrogenazy, oksydazy, reduktazy, reakcje utleniania i redukcji
peroksydazy, katalazy, oksygenazy,
hydroksylazy
transferazy transaldolaza, transketolaza, transferazy, reakcje przenoszenia grup funkcyjnych z czÄ…steczki
kinazy, fosfomutazy donora do czÄ…steczki akceptora
hydrolazy esterazy, peptydazy, tiolazy, hydroliza i tworzenie wiązań w estrach, amidach
fosfolipazy, amidazy, dezamidazy, laktonach, laktamach, epoksydach, nitrylach,
glikozydazy bezwodnikach, glikozydach
liazy dekarboksylazy, aldolazy, ketolazy, reakcje addycji / eliminacji małych cząsteczek do
hydratazy, dehydratazy, syntazy, liazy wiązań podwójnych
izomerazy racemazy, epimerazy, mutazy izomeryzacja
ligazy syntetazy, karboksylazy reakcje tworzenia lub rozpadu wiązań sprzężone z
rozerwaniem wiÄ…zania pirofosforanowego w ATP
Pożądane produkty procesów biotransformacyjnych stanowią cząsteczki optycznie
czynne, często o wielu centrach asymetrii. W przypadku jednego centrum chiralnego miarą
czystości produktu jest nadmiar enancjomeryczny, definiowany jako stosunek ilości jednego z
izomerów do ilości ich obu. Nadmiar enancjomeryczny produktu P, ee (ang. enantiomeric
excess) można wyrazić wzorem:
[P] - [ent - P]
ee = Å"100%
[P] + [ent - P]
gdzie:
[P]  stężenie produktu,
[ent-P]  stężenie jego enancjomeru.
Wartości [P] i [ent-P], a raczej ich stosunek, uzyskuje się w praktyce z eksperymentów NMR
(widma diastereoizomerycznych pochodnych) oraz drogÄ… chromatografii na chiralnych fazach
[P]
stacjonarnych. W obu przypadkach odpowiada stosunkowi integracji odpowiednich
[ent - P]
sygnałów. Inną metodą określenia czystości produktu jest pomiar jego skręcalności właściwej
[ą] i porównanie jej ze skręcalnością właściwą czystego enancjomeru [ą]abs. Iloraz ten
definiuje czystość optyczną, op (ang. optical purity):
[Ä…]
op = Å"100% .
[Ä…]abs
O ile [ą]abs rzeczywiście odpowiada skręcalności właściwej czystego enancjomeru, to
czystość enancjomeryczna (ee) równa się czystości optycznej (op).
Jeżeli produkt stanowi mieszaninę diastereoizomerów, to w tym wypadku operuje się
terminem nadmiar diastereoizomeryczny, de (ang. diastereoisomeric excess):
[D1] - [D2]
ee = Å"100% ,
[D1] + [D2]
gdzie [D1] i [D2] określają stężenia diastereoizomerów.
1. Reakcje z użyciem drożdży piekarskich
Drożdże piekarskie, Saccharomyces cerevisiae (ang. baker yeasts) są niezwykle cennym
biokatalizatorem reakcji tworzenia wiązania C-C, hydrolizy estrów, asymetrycznej redukcji
grupy karbonylowej i wiązania C=C. Niska cena, łatwa dostępność i nieskomplikowane
warunki reakcji stanowią o dużej popularności tego katalizatora w syntezie chemicznej.
Asymetryczna kondensacja acyloinowa jest pierwszÄ… opisanÄ… syntezÄ… z zastosowaniem
drożdży piekarskich (Neuberg, 1921) [2] i stanowi przykład formowania wiązania C-C.
Aktywnym enzymem jest tu dekarboksylaza pirogronianowa (rys 1).
O
OH
drożdże
piekarskie
+ CH3CHO
O
Rys. 1. Kondensacja acyloinowa przy użyciu drożdży piekarskich
Wkrótce po doniesieniu Neuberga rozpoczęto produkcję D-(-)-efedryny na skalę
przemysłową (1930).
OH OH
CH3NH2
H2 / Pt
O NHCH3
D-(-)-efedryna
Rys. 2. Synteza D-(-)-efedryny
Innym przykładem zastosowania syntezy acyloinowej z udziałem drożdży piekarskich
może być synteza zredukowanej acyloiny i zredukowanego alkoholu furylowego, które
wykorzystuje siÄ™ w syntezie Ä…-tokoferolu (witaminy E), rys. 3.
CHO
O
drożdże
piekarskie
OH
OH
O O
OH
O O
HO
O
HO
O
Ä…-tokoferol
Rys. 3. Synteza Ä…-tokoferolu
Własności hydrolityczne drożdży piekarskich wynikają z obecności w ich komórkach
esteraz i lipaz. Hydroliza racemicznych estrów N-acetyloaminokwasów prowadzi do
powstania optycznie czynnych kwasów oraz nieprzereagowanych estrów o konfiguracji D [3]
(rys. 4).
O
O O
drożdże
piekarskie
R
R R
+
OEt
OEt OH
NHAc
NHAc NHAc
Rys. 4. Hydroliza wiązania estrowego w estrach etylowych N-acetyloaminokwasów
Duże zainteresowanie skierowane jest na zastosowanie drożdży piekarskich do
stereospecyficznej redukcji wiązania podwójnego C=C. Jest to doskonała droga
otrzymywania chiralnych substratów w syntezie asymetrycznej. Najwięcej danych
eksperymentalnych zgromadzono dla przypadku trójpodstawionego wiązania podwójnego [4]
(rys. 5).
drożdże
R1 R2 piekarskie R2
R1 *
R3
H R3
Rys. 5. Redukcja wiązania podwójnego C=C
Konfiguracja na powstałym centrum chiralnym zależy od rodzaju izomeru (Z / E) oraz od
właściwości podstawników R. Wydajności reakcji wahają się w granicach 30-65% i ee >
80%.
Na uwagę zasługuje katalizowana drożdżami redukcja aromatycznych związków
nitrowych. Przykładem może być otrzymywanie 1-amino-3-nitrobenzenu z 1,3-
dinitrobenzenu [5] (rys. 6).
NO2
drożdże piekarskie NH2
NaOH
CH3OH / H2O
70-80oC, 2h
NO2 NO2
Rys. 6. Redukcja aromatycznych związków nitrowych
Najszerzej jednak eksploatowanym zastosowaniem drożdży piekarskich w
asymetrycznej katalizie jest redukcja grupy karbonylowej w ketonach, diketonach i
ketoestrach. Stwierdzono, że reakcję redukcji katalizują co najmniej dwie reduktazy obecne w
komórkach drożdży. Ich stereochemiczne preferencje mogą być różne. Zmiana
rozpuszczalnika i modyfikacje strukturalne substratu wpływają istotnie na ee produktu.
Atak jonu wodorkowego może nastąpić zarówno od lica re jak i si (rys. 7).
Re-face
RS
RL
Si-face
Rys. 7. Definicja lica re (re-face) i lica si (si-face) ugrupowania karbonylowego. RL oznacza
duży, RS mały objętościowo podstawnik
Stereochemia produktu reakcji określona jest regułą Preloga [1] (rys. 8).
O OH
RS RS
RL RL
H-
atak od lica si
Rys. 8. Ilustracja reguły Preloga
Na rys. 9 znajdują się przykłady stereospecyficznej redukcji ketonów [6].
O OH
R1 R2 R1 R2
R1 R2 ee [%]
CH3 C2H5 67
CH3 n-C4H9 82
CH3 Ph 89
CH3 CF3 >80
CF3 CH2Br >80
CH3 C(CH3)2NO2 >96
CH3 CH2OH 91
CH3 (CH2)2CH=C(CH3)2 94
CH3 cyklo-C6H11 >95
Rys. 9. Redukcja ketonów za pomocą drożdży piekarskich
Produkty redukcji ²-ketoestrów stanowiÄ… niezwykle cenne chiralne bloki budulcowe.
Poniższy przykład pokazuje syntezę (R)-fluoksetyny, czynnego składnika popularnego leku
psychotropowego Prozac (koncern Eli Lilly). Pierwszy etap tej syntezy, stereospecyficzna
redukcja benzoilooctanu etylu do S-(-)-3-fenylo-3-hydroksypropionianu etylu jest tematem
jednego z ćwiczeń wykonywanych w naszej pracowni.
O O OH O
S. cerevisiae
O O
(i) LiAlH4
(ii) MsCl
F3C
(i) F3CPhOH, Ph3P, DEAD
OH
O
(ii) NaI, MeNH2
(iii) HCl / Et2O
OMs
N
H
x HCl
Rys. 10. Asymetryczna synteza popularnego leku psychotropowego (R)-fluoksetyny (Prozac)
Podobnie jak w przypadku reakcji redukcji ketonów, tu również na optyczną czystość
produktu ma wpływ rozpuszczalnik i rodzaj podstawników w cząsteczce. Ilustruje to poniższy
przykład.
ee [%]
H2O Et2O
O O
OH O
97 77
Me OEt
Me OEt
S
O O
OH O
30
2
Et OEt
Et OEt
S
O O
OH O
86 43
n-Pr OEt
n-Pr OEt
R
Rys. 11. Ilustracja wpływu wielkości podstawnika przy prochiralnym atomie węgla oraz
rozpuszczalnika na czystość optyczną produktu
Literatura
[1] Prelog, V., Pure Appl. Chem., 9:119, (1964).
[2] Neuberg, C., Hirsch, J., Biochem. Z., 115: 282, (1921).
[3] Csuk, R., Glanzer, B.I., Chem. Rev., 91: 49-97, (1991).
[4] Servi, S., Synthesis, 1-25, (1990).
[5] Baik, J.L. et al., Tetrahedron Lett., 35: 3965, (1994).
[6] Faber, K., Biotransformations in Organic Chemistry, Springer-Verlag, Berlin-
Heidelberg, (2004).