Wysokosprawna chromatografia cieczowa ( HPLC )
Ćwiczenia będą wykonywane w chromatograficznym układzie faz odwróconych z wykorzystaniem kolumny typu RP-18 oraz
mieszaniny metanol-woda jako eluentu. Mieszanina rozdzielana składa się z 5-ciu węglowodorów aromatycznych.
Wykonanie ćwiczenia:
Zapoznanie siÄ™ z aparaturÄ… do HPLC ( pompa, dozownik, kolumna chromatograficzna, detektor, rejestrator )
W ustalonych warunkach chromatograficznych ( skład eluentu, objętościowe natężenie przepływu fazy ruchomej (v) )
wprowadzamy do kolumny mieszaninę 5-cio składnikową. Na zarejestrowanym chromatogramie należy zaznaczyć czas retencji
(tR) poszczególnych substancji, wyliczyć objętości retencji (vR) dla poszczególnych substancji wiedząc, że vR = tR x v
Identyfikacja składników mieszaniny
Następnie należy zidentyfikować rozdzielone substancje (który pik odpowiada której substancji). Do kolumny dozuje się
pojedyncze substancje wzorcowe (te które są w mieszaninie 5-cio składnikowej). Identyfikacji dokonuje się poprzez porównanie
czasu retencji substancji w mieszaninie i wzorca. Do tego celu wykorzystany zostanie detektor typu UV-DAD, który umożliwia
zarejestrowanie widma absorpcyjnego w zakresie UV substancji rozdzielanych. Identyfikacji dokonuje się poprzez porównanie
widma absorpcyjnego w zakresie UV substancji rozdzielanych i wzorcowych.
Wyznaczenie objętości martwej kolumny.
Do kolumny dozuje się substancję nie oddziaływującą z wypełnieniem np. w układzie faz odwróconych aceton.
Sprawdzenie jak zmienia się retencja substancji rozdzielanych ze zmianą składu fazy ruchomej
Rozdzielona zostanie mieszanina ( 5-cio składnikowa ) w różnych warunkach tj. przy różnym składzie fazy ruchomej np. 75-
25% metanol-woda, 85-15% metanol-woada oraz 95-5% metanol-woda. Z zarejestrowanych chromatogramów należy wyliczyć
współczynniki rozdzielenia (k), a następnie narysować wykres k=f(%metanolu) w eleuncie
Sprawność, współczynnik rozdzielenia ( alfa ) oraz rozdzielczość
Na podstawie wybranych chromatogramów należy obliczyć w/w wielkości
Oznaczenie ilościowe
Należy zadozować do kolumny mieszaninę substancji o znanych stężeniach (2  3 różne stężenia), z faktu, że wielkość piku
(wysokość/powierzchnia) jest proporcjonalna do stężenia substancji wykreślamy krzywą kalibracyjną powierzchni/wysokość
piku = f(stężenia) dla każdej substancji. Na podstawie uzyskanej krzywej kalibracyjnej można oznaczyć stężenie substancji w
mieszaninie o nieznanym stężeniu.
Sprawozdanie
W sprawozdaniu należy odnieść się do uzyskanych wyników, przedyskutować otrzymane zależność. Obliczyć stężenie
substancji w próbce badanej.
Chromatografia Cienkowarstwowa (TLC)
1. Przygotowanie płytek do TLC
Sporządzić mieszaninę żelu krzemionkowego (Kieselgel G) i wody destylowanej w proporcjach objętościowych 1:2, w
kolbie kulistej o objętości 100ml. Kolbę zatkać korkiem i intensywnie wstrząsać, aż do uzyskania jednolitej mieszaniny
(bez pęcherzyków powietrza). Ułożyć szklane płytki w rzędzie obok siebie, następnie rozprowadzić mieszaninę
równomiernie po wszystkich płytkach jednym pociągnięciem. Odczekać 10 minut i wstawić płytki do suszarki (temperatura
130ºC) na 1.5 godziny.
2. Rozdzielanie składników tuszu do flamastrów
Na gotową płytkę z żelem krzemionkowym nanieść plamy startowe przez dotknięcie końcówką pisaka do płytki, 1 cm
powyżej dolnej krawędzi płytki. Wstawić płytkę do komory chromatograficznej i rozwijać w układzie: octan
etylu/etanol/woda 5+3+2 (objÄ™toÅ›ciowo), do ¾ wysokoÅ›ci pÅ‚ytki.
Interpretacja wyników: przerysować chromatogramy i skomentować uzyskane wyniki
3. Chromatograficzne rozdzielanie barwników wyodrębnionych z liści
Materiał roślinny, (liście, około 1g) rozetrzeć w moz
dzierzu z bezwodnym siarczanem sodowym (około 15g). Nanieść
roztarty proszek na sączek i przemyć dwukrotnie po 20 cm3 eteru etylowego. Przesącz zebrać do kolby stożkowej 100 cm3.
Ekstrakt przenieść do kolby kulistej i odparować nadmiar rozpuszczalnika przy pomocy wyparki obrotowej.
Eluent: cykloheksan i aceton (4 i 1,5 v/v).
Wlać eluent do komory chromatograficznej na wysokość 0.5  1 cm, zamknąć i pozostawić na około 15 minut, aby komora
równomiernie wysyciła się parami rozpuszczalnika.
Rozdzielanie chromatograficzne: nanieść wzbogacony ekstrakt na płytkę w 2 miejscach, 1 cm powyżej dolnej krawędzi.
Wstawić pÅ‚ytkÄ™ do komory chromatograficznej. Rozwijać do ¾ wysokoÅ›ci pÅ‚ytki. Po wyjÄ™ciu pÅ‚ytki zaznaczyć ołówkiem
front rozpuszczalnika. Pozostawić płytkę do wyschnięcia.
Interpretacja wyników: przerysować chromatogramy, obliczyć RF dla poszczególnych substancji, wszystkie zmierzone
(drogi migracji plamek i eluentu) i wyliczone (RF) wartości umieścić w tabeli.
4. Badanie chromatograficzne próbek wybranych środków farmaceutycznych
Tabletki (ibuprom, aspiryna i naproxen) rozetrzeć w moz
dzierzu i rozpuścić w etanolu. Na gotową płytkę z żelem
krzemionkowym nanieść przy użyciu kapilary przygotowane substancje w odpowiedniej odległości tak aby między
plamkami było około 0.5cm przerwy. Dodatkowo nanieść na płytkę substancję o nieznanym składzie, otrzymaną od
prowadzącego ćwiczenie.
Eluent: octan etylu/heksan/kwas octowy (80/20/1)
octan etylu/heksan/kwas octowy (50/50/1)
Wlać eluenty do komór chromatograficznych na wysokość 0.5  1 cm, zamknąć i pozostawić na około 15 minut, aby
komory równomiernie wysyciły się parami rozpuszczalnika.
Rozdzielanie chromatograficzne: płytki z naniesionymi substancjami wstawić do komór chromatograficznych i rozwijać do
¾ wysokoÅ›ci pÅ‚ytki. Po wyjÄ™ciu pÅ‚ytek zaznaczyć ołówkiem front rozpuszczalnika i pozostawić pÅ‚ytki do wyschniÄ™cia.
Obserwować plamki w świetle lampy UV.
Interpretacja wyników: przerysować chromatogramy, obliczyć RF dla poszczególnych substancji, wszystkie zmierzone
(drogi migracji plamek i eluentu) i wyliczone (RF) wartości umieścić w tabeli, zidentyfikować skład substancji nieznanej.
5. Dwukierunkowa chromatografia cienkowarstwowa próbek produktów naftowych
Roztwór nafty, nanieść na płytkę z żelem krzemionkowym (wycięta w kształcie kwadratu), wstawić do komory
chromatograficznej i rozwijać w heksanie. Gdy czoÅ‚o rozpuszczalnika osiÄ…gnie ¾ wysokoÅ›ci pÅ‚ytki, obrócić pÅ‚ytkÄ™ o 90º i
ponownie rozwijać w heksanie. Po wyjęciu płytek zaznaczyć ołówkiem front rozpuszczalnika i pozostawić płytki do
wyschnięcia. Obserwować plamki w świetle lampy UV.
Interpretacja wyników: przerysować chromatogramy i skomentować uzyskane wyniki