Instrukcja ćwiczenia laboratoryjnego  chemia analityczna
Chromatografia cienkowarstwowa (TLC)
WST
P
Rozdzielenie substancji może być wykonane również wtedy, gdy faza stacjonarna jest w
postaci cienkiej warstwy na powierzchni szkła, folii aluminiowej, albo z tworzywa
sztucznego. Tak realizowanÄ… chromatografiÄ™ cieczowÄ… nazywa siÄ™ chromatografiÄ… planarnÄ…
lub cienkowarstwowÄ… (Thin Layer Chromatography - TLC). Podstawowe zalety
chromatografii cienkowarstwowej to prostota niski koszt wyposażenia i wykonania,
możliwość przechowywania płytek z rozdzielonymi substancjami, możliwość obserwacji
stopnia rozdzielenia na każdym jego etapie i przerwania rozwijania chromatogramu w
dowolnym czasie, możliwość zastosowania różnych metod detekcji, w tym możliwość
selektywnej detekcji na drodze tzw.  wywoływania plamek z zastosowaniem odpowiednio
dobranych reagentów i inne. W przypadku chromatografii kolumnowej, można dokonać
detekcji i ocenić stopień rozdzielenia substancji dopiero po opuszczeniu kolumny przez
składniki rozdzielanej mieszaniny. Często nie jest pewne, czy nieznane składniki próbki o
wysokim powinowactwie sorpcyjnym do fazy stacjonarnej nie pozostały w kolumnie, co w
przypadku chromatografii cienkowarstwowej nie jest problemem.
MATERIAA
Y
PÅ‚ytki TLC (Kieselgel 60) bez fluoresceiny, PÅ‚ytki TLC (Kieselgel 60F254) z fluoresceinÄ…,
orto- nitroanilina, para- nitroanilina, ą - naftyloamina, ekstrakt acetonowy z igieł sosny,
heksan, 2- propanol, eter matylowo  tert  butylowy, cykloheksan, aceton, komora do
chromatografii cienkowarstwowej, jod, lampa UV
WYKONANIE ĆWICZENIA
1. Analiza jakościowa
Na płytki z żelem krzemionkowym nanieść  plamki startowe mieszaniny orto-nitroaniliny,
para- nitroaniliny i ą-naftyloaminy w heptanie oraz roztwory w/w pojedynczych składników
w heptanie. Plamki nanosimy na żel za pomocą strzykawki przy jednoczesnym
odparowywaniu rozpuszczalnika za pomocą nawiewu powietrza. Płytki należy wstawić do
komory chromatograficznej i rozwijać w kilku alternatywnych układach rozpuszczalników
(heksan z 5%, 10%, 15%, 20%, 25% zawartoÅ›ciÄ… izopropanolu v/v). PÅ‚ytki rozwijać do ok. ¾
wysokości. Po rozwinięciu płytek TLC bez fluoresceiny wywołać je jodem, natomiast płytki
TLC z fluoresceiną oglądać w świetle lampy UV, przy długości światła 254nm i 360 nm.
OPRACOWANIE WYNIKÓW
" Na podstawie uzyskanych chromatogramów wyznaczyć wartości Rf analizowanych
substancji, oddzielnie dla poszczególnych warunków rozdzielania.
(Rf = a/b, gdzie a-droga przebyta przez środek plamy analizowanej substancji, b-droga
czoła fazy ruchomej);
" Wszystkie wartości Rf zestawić w tabeli i porównać wartości Rf poszczególnych
składników mieszaniny substancji z wartościami Rf substancji worcowych 
identyfikacja substancji i kolejności elucji;
1
" Na podstawie wartości Rf uzyskanych z zastosowaniem różnych eluentów
zaproponować optymalny skład fazy ruchomej do rozdzielania składników tej
mieszaniny;
" Obliczyć wartość współczynnika retencji k oraz RM poszczególnych substancji dla
każdego z zastosowanych układów faz, korzystając z następujących zależności:
k= (1  Rf) / Rf log k = RM
" wykreślić wykresy zależności log k = f (logXS), gdzie: XS- stężenie bardziej polarnego
składnika eluentu, wyrażone jako ułamek molowy składnika bardziej polarnego w
eluencie;
2. Analiza ilościowa
Odważyć 0,5 g igieł sosny, albo świeżej trawy, albo liści. Próbkę homogenizować w 10 ml
acetonu. Otrzymaną zawiesinę osuszyć ok. 2 g bezwodnego siarczanu sodowego i przesączyć
przez filtr celulozowy 0,4 µm. Tak przygotowane próbki poddać rozdzielaniu z
zastosowaniem chromatografii cienkowarstwowej (TLC) na płytce Si 60 F254. Jako fazę
ruchomą stosuje się cykloheksan : aceton (8:3 v/v). Należy nanieść na płytkę próbki o znanym
rozcieńczeniu (2-3 różne, znane stopnie rozcieńczenia) oraz próbkę, której stopień
rozcieńczenia ma zostać oznaczony.
" Przerysować chromatogramy.
" Porównać intensywności plamek uzyskane podczas analizy próbek roztworów
chlorofili o znanym rozcieńczeniu z intensywnością plamek roztworu chlorofilu o
nieznanym rozcieńczeniu oznaczyć przybliżoną wartość stopnia rozcieńczenia
analizowanej próbki.
3. Dwukierunkowa chromatografia cienkowarstwowa tuszu do tzw. flamastrów
Na płytkę z żelem krzemionkowym w kształcie kwadratu nanieść plamkę startową tuszu
jednego, bÄ…dz
kilku flamastrów przez dotknięcie końcówką pisaka do płytki w tym
samym punkcie na przekątnej w odległości ok. 2 cm od jednego z wierzchołków
kwadratu. Wstawić płytkę do komory chromatograficznej i rozwijać w układzie octan
etylu : etanol : woda = 5 : 3 : 2 (v/v). Gdy czoÅ‚o rozpuszczalnika osiÄ…gnie ok. ¾
wysokości płytki, zaznaczyć ołówkiem front rozpuszczalnika i osuszyć płytkę. Obrócić ją
o 90°, tak, aby otrzymane plamki znajdowaÅ‚y siÄ™ po stronie powierzchni kolejnego
eluentu i ponownie rozwijać w układzie octan etylu: etanol : woda 8 : 4 : 2. Przerysować
chromatogramy i skomentować wyniki.
LITERATURA
1. Chromatografia cieczowa  praca zbiorowa pod redakcją M. Kamińskiego, CEEAM,
Gdańsk 2004
2. Z. Witkiewicz  Podstawy chromatografii, WNT, Warszawa 1995
2
Instrukcja ćwiczenia laboratoryjnego  RP/NP-HPLC-1
Wysokosprawna elucyjna, kolumnowa chromatografia cieczowa
w układzie faz normalnych (NP-HPLC) i odwróconych (RP-
HPLC)
 podstawowe zależności i zasady -
WST
P
Chromatografia jest przede wszystkim technikÄ… rozdzielania substancji. Po zastosowaniu detektora,
spełniającego rolę przepływowego instrumentu pomiarowego staje się techniką analityczną.
Oznaczanie zawartości substancji w mieszaninie jest często trudne, albo niemożliwe, a po ich
rozdzieleniu problem analityczny z reguły staje się zasadniczo prostszy.
Szczególna zaletą chromatografii cieczowej jest ogromnie szeroki zakres uniwersalności tej techniki
rozdzielania. Można ją zastosować do analizy mieszanin prawie wszystkich substancji, zarówno lotnych, jak i
nielotnych, trwałych i nietrwałych termicznie itd., pod warunkiem istnienia jakiegokolwiek ich rozpuszczalnika.
W nowoczesnym wykonaniu jest techniką rozdzielania, zarówno o wysokiej sprawności (wysoka liczba półek
teoretycznych kolumny), jak i o szczególnie wysokiej selektywności, która to, jest uzyskiwana dzięki
wykorzystywaniu konkurencyjnych oddziaływań między cząsteczkami rozdzielanych substancji i cząsteczkami
eluentu a powierzchnią sorpcyjną fazy stacjonarnej. Często wpływ na selektywność rozdzielania mają też
oddziaływania miedzy cząsteczkami rozdzielanych substancji i cząsteczkami eluentu (solwatacja, cofanie
dysocjacji, tworzenie tzw. par jonowych itp.).
Dysponujemy współcześnie bardzo dużą liczbą różnego rodzaju faz stacjonarnych oraz bardzo czułymi
detektorami, o korzystnej charakterystyce pomiarowej i dynamice odpowiedzi oraz oprogramowaniami
komputerowymi, zapewniającymi możliwość automatycznego sterowania modułami aparatu i wykonania w
sposób dokładny i precyzyjny oznaczeń ilościowych.
Niektóre z detektorów umożliwiają też wykonanie identyfikacji jakościowej z wysokim poziomem
ufności rezultatu (LC-MS, UV-DAD, LC-NMR).
W celu wykonania oznaczeń ilościowych, stosuje się metodę krzywej kalibracyjnej, metodę wzorca
wewnętrznego, albo metodę normalizacji, czy dodatku wzorca.
CEL ĆWICZENIA
1) Poznanie odstawowych pojęć i zależności opisujących retencję substancji, selektywność oraz
sprawność kolumny i układu chromatograficznego w warunkach HPLC oraz najważniejsze wzajemne
relacje i zależności funkcyjne między tymi wielkościami,
2) Zasady postępowania dla doboru optymalnych warunków rozdzielania, identyfikacji, detekcji i
oznaczania zawartości substancji z zastosowaniem wysokosprawnej kolumnowej, elucyjnej
chromatografii cieczowej w układzie faz normalnych (NP-HPLC) oraz faz odwróconych (RP-HPLC) z
detekcją UV-VIS / DAD, RID, FLD. Budowa i zasady działania aparatury HPLC różnego typu.
OGÓLNE ZASADY WYKONANIA ĆWICZENIA i SPRAWOZDANIA
- Studenci powinni być przygotowani w zakresie znajomości najważniejszych pojęć związanych z
chromatografią i z chromatografią cieczową, w szczególności.
Znaczenie i zrozumienie pojęć oraz parametrów opisujących sorbent, eluent, kolumnę, wypełnienie kolumny,
retencję substancji, selektywność i rozdzielczość układu chromatograficznego oraz kolumny; Podstawowe
mechanizmy fizykochemiczne decydujące o retencji substancji i selektywności adsorpcyjnych, podziałowych,
jonowymiennych i żelowych układów chromatograficznych; Zasady doboru eluentu i warunki jakie powinien
spełniać eluent; Pojęcie sprawności kolumny i zjawiska decydujące o sprawności (o wysokości równoważnej
półce teoretycznej); Sposób wyznaczania (obliczania)  współczynnika retencji, selektywności układu
chromatograficznego, współczynnika rozdzielenia (rozdzielczości), objętości martwej (czasu martwego),
sprawności kolumny (wysokości równoważnej półce teoretycznej / liczby pólek teoretycznych); Zasada budowy i
działania aparatu HPLC i jego głównych modułów (pompa, dozownik, kolumna, system programowania składu
eluentu, detektor, system rejestracji i przetwarzania danych pomiarowych); Podstawowe rodzaje detektorów
3
stosowanych w HPLC, ich najważniejsze parametry użytkowe oraz zasady doboru detektora i warunków
detekcji.
- W czasie trwania ćwiczenia przewiduje się krótkie sprawdzenie poziomu przygotowania studentów.
- Grupa laboratoryjna zostanie podzielona na 3-4 podgrupy. Każda z podgrup wykonuje niezależnie badania i
przygotowuje odrębne sprawozdanie, dotyczące opracowania wyłącznie wyników badań, wykonanych przez
podgrupę i stanowiące część pełnego sprawozdania. W konsekwencji sprawozdanie składa się z części
wykonanej przez poszczególne podgrupy i z części wspólnej dla całej grupy, gdzie zostają zestawione i
łącznie opracowane wyniki otrzymane przez poszczególne podgrupy. Do opracowania wniosków końcowych
jest konieczne wykorzystanie wyników uzyskanych przez wszystkie podgrupy.
- Każdy z aparatów HPLC, przeznaczonych do wykonania poszczególnych etapów ćwiczenia, jest nieco
inaczej zbudowany i wyposażony oraz przeznaczony do wykonania części badań (z zastosowaniem innego
układu chromatograficznego, innej próbki itp.).
- Każda podgrupa wykonuje kolejne etapy ćwiczenia w czasie 15 do 30-tu min na jednym stanowisku,
następnie do innego aparatu / stanowiska. W ten sposób każda z podgrup wykona badania na każdym z
stanowisk. Wyniki, otrzymane przez wszystkie podgrupy są podstawą do wykonania obliczeń i wykresów
badanych zależności funkcyjnych oraz do sformułowania wniosków końcowych.
- Po zanotowaniu celu etapu, warunków rozdzielania (typ układu chromatograficznego, nazwa i
wymiary kolumny, charakterystyka fazy stacjonarnej, skład eluentu, albo program elucji, natężenie
przepływu eluentu, temperatura, ciśnienie na wlocie do kolumny, składniki próbki i ich stężenia,
rozpuszczalnik próbki, budowa aparatu, typ i parametry pompy, detektora itp.) - student, albo
prowadzący wykonuje dozowanie próbki. W czasie trwania  analizy studenci obserwują przebieg
rozdzielania, szkicują schemat stanowiska / aparatu, mierzą, albo odczytują natężenie przepływu eluentu oraz
wyjaśniają wątpliwości z prowadzącym zajęcia. Po wykonaniu i zarejestrowaniu wyników rozdzielenia -
opisujÄ… otrzymany chromatogram.
Każdy chromatogram powinien zostać opisany w następujący sposób: Kolumna  typ sorbentu, wielkość ziaren,
wymiary kolumny (średnica wewnętrzna i długość wypełnienia), Skład eluenutu, albo program elucji - skladnik
A, B, ... eluentu, przebieg programu elucji, Próbka  składniki, ich stężenia, rozpuszczalnik, objętość dozowania,
Detektor i warunki detekcji  typ detektora, czułość detekcji ( pełnoskalowa wartość sygnału), Natężenie
przepływu eluentu  w [ml/min], Piki chromatograficzne  każdy pik na chromatogramie powinien mieć swój
numer, a w opisie chromatogramu, poszczególnym pikom powinny zostać przyporządkowane nazwy substancji.
W celu umożliwienia wyznaczenia wartości  k poszczególnych substancji każda próbka powinna zawierać pik
substancji niesorbowanej, wnikającej we wszystkie pory wypełnienia, albo kolumna powinna posiadać
wyznaczoną wartość tzw.  objętości martwej .
- Na podstawie otrzymanych chromatogramów oraz zanotowanych warunków badań, studenci powinni
wykonać w podgrupach następujące obliczenia oraz wykresy zależności funkcyjnych:
1. Dla każdego etapu ćwiczenia należy zamieścić w sprawozdaniu uzyskany chromatogram /
chromatogramy oraz podać warunki rozdzielania (w tym: czas martwy kolumny, objętość martwą, natężenie
przepływu eluentu, liniową prędkość eluentu, ciśnienie na wlocie do kolumny i inne warunki i parametry). W
tabeli zbiorczej należy zestawić następujące parametry pików substancji stanowiących główne składniki
rozdzielanej próbki: nazwa lub symbol substancji, F (powierzchnia piku), h (wysokość piku), tr (czas retencji), k
(współczynnik retencji), ą (współczynnik selektywności substancji i+1, względem substancji i), Rs
(współczynnik rozdzielenia substancji i+1 względem substancji i), liniowa prędkość przepływu eluentu, H
(wysokość równoważna półce teoretycznej), N (liczba półek teoretycznych);
2. Na podstawie wartości w/w parametrów, otrzymanych przez poszczególne podgrupy, po uzupełnieniu
danymi otrzymanymi przez inne podgrupy - dla odpowiadających sobie warunków rozdzielania i tych samych
substancji / par substancji stanowiących sąsiednie piki chromatograficzne - należy sporządzić wykresy
następujących zależności funkcyjnych: H = f(u); log(k)=f(X), gdzie X  ułamek objętościowy, albo ułamek
molowy składnika o wyższej sile elucyjnej; ą= f(X); Rs=f(X); C=f(F) oraz C=f(h)  krzywe kalibracyjne
(zależności stężenia  C odpowiedniej substancji od powierzchni (F) i od wysokości (h) piku).
Wykresy zależności funkcyjnych należy wykonać dla tych w/w parametrów i obliczonych wielkości, gdy grupie
laboratoryjnej udało się w czasie trwania ćwiczenia uzyskać co najmniej trzy punkty pomiarowe.
- Na podstawie wszystkich otrzymanych rezultatów, oddzielnie dla poszczególnych rodzajów układu
chromatograficznego (NP / RP) należy sformułować wnioski dotyczące:
4
1. mechanizmów fizykochemicznych decydujących o retencji i kolejności elucji rozdzielanych substancji,
w powiÄ…zaniu z ich strukturÄ… molekularnÄ…;
2. zależności retencji, selektywności i rozdzielczości od warunków rozdzielania oraz optymalnych
warunków rozdzielania substancji w każdym z układów chromatograficznych;
3. granicy i zakresu oznaczalności analizowanych substancji;
4. zakresu przydatności chromatografii cieczowej i określonych technik detekcji do analizy ilościowej i
jakościowej substancji oraz możliwości wykonywania analizy ilościowej w oparciu o powierzchnię, albo
wysokość piku.
Rozdzielanie substancji będzie wykonywane z zastosowaniem kolumnowej, elucyjnej, chromatografii cieczowej
z wykorzystaniem wysokosprawnych kolumn (tzw. HPLC) w układzie faz odwróconych (RP) oraz w układzie
faz normalnych (NP).
W układzie faz normalnych zostaną zastosowane dwa rodzaje wypełnienia kolumny (dwie fazy stacjonarne):
żel krzemionkowy typu H60 (średnia wielkość porów 60 A  6 nm, powierzchnia właściwa ok. 450 m2/g) i faza
stacjonarna typu CN 100 (izopropylo  nitryl związany chemicznie z powierzchnią żelu krzemionkowego o
średniej wielkości porów 100 A (10 nm) o powierzchni właściwej ok. 300 m2/g). Eluenty, to mieszaniny nisko i
średnio polarnych rozpuszczalników organicznych, spośród: n-heksan, n-heptan, eter metylowo  tertbutylowy
(MTBE), dioksan, czterowodorofuran (THF) izopropanol (IzoOH) i inne). W warunkach elucji izokratycznej,
albo gradientowej będą rozdzielane kilkuskładnikowe mieszaniny następujących substancji:
- chlorofile i karotenoidy, stanowiące składniki ekstraktu z wybranych roślin (metoda zbliżona do
doświadczenia dr Michaiła Cwieta);
- substancje organiczne o znanych strukturach molekularnych, w tym: barwniki azowe; izomery
nitroaniliny, nitrofenolu i inne.
W układzie faz odwróconych zostaną zastosowane kolumny HPLC typu Rp18, eluenty woda  metanol, albo
woda - acetonitryl o różnych proporcjach składników, elucja izokratyczna, albo/i gradientowa oraz węglowodory
aromatyczne lub pestycydy, jako przykłady substancji oznaczanych. Dla tych substancji zostaną wykonane
badania retencji i selektywności w funkcji składu eluentu i zostanie też wykonana kalibracja ilościowa oraz
oznaczenie składu próbki o nieznanym stężeniu komponentów.
Przykład 1.
Rozdzielanie, detekcja i oznaczanie chlorofilu z zastosowaniem NP-HPLC/UV-VIS DAD
W roślinie zielonej podstawową organellą, w której odbywa się absorpcja energii świetlnej i jej zamiana na
chemiczną, jest chloroplast. Występujące w chloroplastach chlorofile uczestniczą w procesie absorpcji energii
świetlnej i jej zamianie na energię przemian chemicznych, która z kolei jest wykorzystywana do procesów
biosyntezy. Chlorofile rozpuszczajÄ… siÄ™ Å‚atwo w lipidach i rozpuszczalnikach lipofilowych, natomiast sÄ… prawie
nierozpuszczalne w wodzie.
MATERIAA
Y I SPRZ
T LABORATORYJNY
Igły sosny, trawa, zielne liście, aceton, izopropanol, heksan, eter metylowo- tert-butylowy (MTBE),
czterowodorofuran (THF), bezwodny siarczan sodowy, filtr celulozowy 0,4 µm, probówki szklane, pipeta
automatyczna, strzykawki do HPLC;
APARATURA I WYPOSAŻENIE DO HPLC
Aparaty chromatograficzne do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (do HPLC): pompa tłokowa, albo
membranowa, albo tzw. bezpompowy układ zasilania kolumny za pośrednictwem ciśnienia sprężonego gazu
obojÄ™tnego (N2) dozownik zaworowy, albo membranowy kolumna Eurospher 100CN 7 µm 250x4 mm,
kolumna szklana HPLC, umożliwiająca obserwację elucji stref substancji barwnych, wypełniona żelem
krzemionkowym typu Si-60 detektor UV typu DAD, albo typu spektrofotometrycznego z programowaniem
długości fali, albo tzw. detektor UV-254, detektor refraktometryczny oraz fluoroscencyjny integrator, albo
komputerowy system rejestracji i przetwarzania danych, zawór przełączania kierunku przepływu w kolumnie
WARUNKI ROZDZIELANIA I DETEKCJI
Natężenie przepływu fazy ruchomej: w zakresie 0.5 - 1,5 ml / min.
Temperatura: 20° C, albo pokojowa.
5
WYKONANIE ĆWICZENIA
Przygotowanie próbki (wykonane w okresie przygotowania ćwiczenia)
Odważyć 2 g igieł sosny, albo trawy, albo zielonych liści. Próbkę homogenizować poprzez ucieranie w
moz
dzierzu z 10 ml acetonu i ok. 5 g bezwodnego siarczanu sodu. Supernatant utworzony w moz
dzierzu
przesÄ…czyć przez filtr celulozowy 0,4 µm i ciecz zawartÄ… w przesÄ…czu odparować w strumieniu sprężonego
azotu, a suchą masę rozpuścić w eluencie, albo w izopropanolu (w ok. 1  2ml). Tak przygotowane próbki
poddać analizie chromatograficznej.
Warunki dozowania, rozdzielania i detekcji
1. Ustawić stałą prędkość przepływu eluentu o składzie heksan : MTBE : THF =
55:8:6,4, albo innym  wskazanym przez prowadzÄ…cego  w zakresie 0,5 do 1,5 ml/min (warunki
izokratyczne, albo elucji gradientowej);
2. Ustabilizować warunki (stabilna linia podstawowa, powierzchnia sorpcyjna kolumny  zrównoważona
ze stosowanym eluentem), zmierzyć natężenie przepływu eluentu za pomocą cylinderka miarowego,
albo przepływomierza;
3. Po ustabilizowaniu warunków rozdzielania, wprowadzić do kolumny 10 do 50 mikrolitrów roztworu
próbki (w przypadku dozownika zaworowego wprowadzić do pętli dozującej co najmniej 2,5 krotność
jej objętości w położeniu  load rotora, stosując strzykawkę z płaską koncówką igły (!!!), a następnie
szybko przestawić zawór w położenie  inject , w przypadku dozownika membranowego wstrzyknąć
próbkę bezpośrednio do strumienia eluentu za pomocą mikrostrzykawki);
4. Zbadać jak zmienia się retencja rozdzielanych substancji ze zmianą składu fazy ruchomej. Próbka
zostanie poddana rozdzielaniu w kolumnie chromatograficznej typu CN, albo Si 60 w różnych
warunkach tj. przy różnym składzie fazy ruchomej (np. heksan : MTBE : THF = 50:15:8; heksan :
MTBE : THF = 51:19:10 i innych).
Przykładowy chromatogram rozdzielania chlorofili wyekstrahowanych z igieł sosny, otrzymany z
zastosowaniem detektora UVVIS/DAD (warunki rozdzielania zbliżone do optymalnych dla kolumny 250x4 mm
typu CN 5 um  heksan : MTBE : THF = 71,25 : 16,25 : 12,5).
OPRACOWANIE WYNIKÓW
Na podstawie zarejestrowanych chromatogramów należy obliczyć / wyznaczyć:
" współczynniki retencji k dla głównych składników badanej próbki (Jest to obiektywny parametr
pozwalający porównać selektywność różnych układów chromatograficznych. W odniesieniu do
konkretnej substancji wiąże on parametry eluentu i parametry fazy stacjonarnej). Współczynnik
retencji k wyznacza się na podstawie chromatogramu korzystając z zależności zwanej równaniem
elucji VR = V0 (1+k) lub tR = t0 (1+k), gdzie: VR, tR  objętość, czas retencji określonej substancji,
V0, t0  objętość, czas martwy kolumny
" na podstawie zależności wartości k poszczególnych substancji od składu eluentu: lg(k) = f (Xs) (XS-
ułamek molowy składnika polarnego w eluencie), albo lg (k) = f (Cs), (XS, CS  odpowiednio ułamek
molowy, stężenie składnika polarnego w eluencie) po stwierdzeniu która z tych funkcji posiada
6
przebieg liniowy, należy wskazać optymalny skład fazy ruchomej, do rozdzielania w warunkach elucji
izokratycznej chlorofili, zawartych w materiale roślinnym;
" na podstawie otrzymanych chromatogramów należy wyznaczyć także podstawowe parametry
opisujące układ chromatograficzny  selektywność (ą), rozdzielczość rzeczywistą (Rs) i sprawność
kolumny (H, N). Obliczenia wykonać dla substancji rozdzielonych do tego stopnia, że odpowiadające
im piki są  nie-nałożone powyżej ok. 25 % ich wysokości. (współczynnik rozdzielenia, retencję
względną , rozdzielczość i sprawność kolumny wyznacza się z następujących zależności:
Ä… = k2 / k1,
Rs 2/1 = ( tR2 - tR1 ) / 1.63 (S + S )
½ 2 ½ 1
H= 2,54 Lc (S / l R) 2
½
(na podstawie szerokości  połówkowych pików zmierzonych na podstawie chromatogramu);
H = (1/4 S) 2 / LR
(na podstawie pomiaru szerokości strefy barwnej substancji w warstwie wypełnienia kolumny;
N = Lc / H
gdzie: cyfry 1 i 2 odnoszą się do kolejnych pików chromatograficznych, odpowiednio: następnego i
poprzedniego; S to szerokość piku w połowie wysokości, zmierzona na podstawie chromatogramu; l R 
½
to odległość maksimum piku od  startu zmierzona na podstawie chromatogramu; S - to szerokość strefy
barwnej substancji zmierzona w kolumnie; LR  to odległość środka barwnej strefy od początku warstwy
wypełnienia kolumny.
Rozdzielczość (RS) uzależnia stopień rozdzielenia substancji w kolumnie w warunkach braku przekroczenia
zakresu liniowości izoterm sorpcji, od sprawności i selektywności układu chromatograficznego oraz od retencji
substancji, i jest wyrażona następującym równaniem otrzymanym na drodze rozumowania teoretycznego :
N Ä… -1 k2
RS =
4 Ä… 1+ k2
Sprawność układu chromatograficznego jest wyrażona liczbą półek teoretycznych (N), bądz
tzw. wartością
wysokości równoważnej półce teoretycznej (H). W praktyce, gdy rozkład stężenia w zakresie piku
chromatograficznego jest opisany równaniem Gaussa, liczbę półek teoretycznych można łatwo obliczyć na
podstawie chromatogramu, korzystając z podanych wyżej zależności.
Przykład 2 Rozdzielanie mieszaniny chlorofili i karotenoidów z zastosowaniem bezpompowego aparatu
chromatograficznego.
Układ faz normalnych zostanie zastosowany do rozdzielania ekstraktu acetonowego z trawy (mieszanina
chlorofili) z zastosowaniem nieorganicznej fazy stacjonarnej (faza stacjonarna: żel krzemionkowy, kolumna
szklana; faz ruchoma - heksan: MTBE:THF=60:18:22 v/v). Kolumna zasilana jest za pośrednictwem ciśnienia
sprężonego gazu obojętnego (N2). Rozdzielanie chlorofili prowadzić przy 3 różnych natężeniach przepływu
eluentu. Sporządzić wykres zależności funkcyjnych: H = f(u), gdzie H  wysokość równoważna półce
teoretycznej, u  liniowa prędkość przepływu fazy ruchomej [mm/sek.]
Przykład 3
Rozdzielanie, detekcja i identyfikacja wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych z
zastosowaniem RP-HPLC/UV-VIS DAD
Układ faz odwróconych (RP), to taki układ, w którym faza stacjonarna jest mniej polarna niż faza
ruchoma. W odwróconym układzie faz stosuje się najczęściej związane fazy stacjonarne typu, C18, C8,
 Phenyl , C4, CN, otrzymane na bazie żelu krzemionkowego, albo Al2O3, TiO2, ZrO2, SDB (styren  di-
vinylo-benzen). Bardzo rzadko, inne  nośniki . Fazami ruchomymi są, natomiast, mieszaniny wody i
rozpuszczalników organicznych ( tzw. modyfikatorów) mieszających się dobrze z wodą. Najczęściej stosowane
rozpuszczalniki organiczne (modyfikatory), to acetonitryl, metanol, izopropanol, etanol, tetrahydrofuran, albo
dioksan. Wykorzystuje się też często dodatek kwasu (zwłaszcza kwasu trójfluorooctowego (TFA), albo zasady
(zwłaszcza trietyloaminy (TEA) do eluentu na poziomie zawartości poniżej 0,1 % m/m, w celu  cofnięcia
dysocjacji elektrolitycznej substancji rozdzielanych i zwiększenia stopnia hydrofobowych oddziaływań. Uwaga!
W przypadku sorbentów otrzymanych na bazie żelu krzemionkowego nie można przekraczać zakresu
wartości pH eluentu od 2,0 do 8,0 ! Duże znaczenie ma też dodawanie do eluentu milimolowych zawartości
substancji tworzÄ…cych tzw. pary jonowe z jonami substancji rozdzielanych (chlorowodorki zasad
tetraalkiloamoniowych, albo kwasy alkilosulfonowe, bÄ…dz
ich sole sodowe, lub litowe).
7
MATERIAA
Y I SPRZ
T LABORATORYJNY
Wzorce: naftalenu, chryzenu, fluorenu, pirenu, antracenu, metanol, acetonitryl i woda do HPLC, czystości
 gradient grade , probówki i fiolki szklane, pipeta automatyczna, strzykawka do HPLC z płaską igłą, naczynie
na ścieki;
APARATURA
Aparaty chromatograficzne typu HPLC: pompa dozownik zaworowy, (albo automatyczny dozownik
repetycyjny, tzw. "autosampler") kolumna LiChrospher RP 18e (5µm) 125x4 mm detektor UV typu DAD
i detektor fluorescencyjny (FLD) integrator, albo komputerowy system rejestracji i przetwarzania danych.
WARUNKI ROZDZIELANIA I DETEKCJI
Natężenie przepływu fazy ruchomej: wartość stała w zakresie 0,5 do 1,5 ml / min, temperatura pokojowa,
ciśnienie na wlocie do kolumny: do 400 bar; objętość próbki dozowanej do kolumny: 20 ul, zakres długości fali
detekcji: UV - 200 do 400 nm; FLD  długość fali wzbudzenia - 250 do 410 nm, długość fali emisji  300 do
500 nm; zróżnicowany skład eluentu, natężenie przepływu eluentu oraz stężenie substancji dozowanych do
kolumny.
WYKONANIE ĆWICZENIA
Przygotowanie próbek do kalibracji i identyfikacji (wykonane w okresie przygotowania ćwiczenia)
Do kolby miarowej o pojemności 10 ml odważyć po 2 mg każdego ze wzorców - naftalenu, chryzenu, fluorenu,
pirenu, antracen i uzupełnić do kreski metanolem. Tak przygotowane próbki pierwotne zmieszać w różnych
proporcjach składników, oraz rozcieńczyć 10-cio do 1000  krotnie, otrzymując 5 próbek kalibracyjnych i
identyfikacyjnych. (W ten sposób przygotowane próbki umożliwiają jednoczesne wykonanie  wielopunktowej
kalibracji oraz identyfikacji czasu retencji poszczególnych składników, bez konieczności dozowania roztworów
pojedynczych składników w celu identyfikacji czasu retencji).
Próbki zmieszane i rozcieńczone poddać rozdzielaniu i analizie chromatograficznej.
Warunki rozdzielania, detekcji i kalibracji
1. Ustawić skład eluentu MeOH : H2O = 80:20 (albo inny, podany przez prowadzącego) oraz natężenie
przepływu eluentu na poziomie 0,5 do 1,5 ml/min (konkretne wartości natężenia przepływu zostaną podane
przez prowadzÄ…cego),
2. Ustabilizować warunki rozdzielania (stabilna linia podstawowa detektora / detektorów, powierzchnia
sorpcyjna kolumny  zrównoważona ze stosowanym eluentem);
3. Po ustabilizowaniu warunków rozdzielania wprowadzić do pętli zaworu dozującego o pojemności 20
mikrolitrów, co najmniej 50 mikrolitrów próbki (położenie  load zaworu dozującego  dlaczego tak duża
objętość próbki wprowadzonej do pętli ?) i po stwierdzeniu gotowości systemu rejestracji i przetwarzania
danych (komunikat  ready for injection i znikła ikona  klepsydry , w przypadku stosowania komputerowego
systemu rejestracji i przetwarzania danych), wprowadzić próbkę do kolumny ( dozować ,  wstrzyknąć
próbkę). Obserwować przebieg rozdzielania, kontrolować prawidłowość pracy aparatu, zanotować warunki
rozdzielania i detekcji oraz naszkicować schemat aparatu, a także wyjaśnić z prowadzącym wątpliwości.
4. Po zarejestrowaniu chromatogramu, odczytać czas retencji i powierzchnie poszczególnych pików oraz
wydrukować raport.
5. Zidentyfikować rozdzielone składniki mieszaniny. Identyfikacji dokonuje się dla węglowodorów
aromatycznych w przypadku stosowania detektora UV-DAD, poprzez porównanie widma absorpcyjnego w
zakresie UV substancji wzorcowych, albo w przypadku stosowania innych detektorów, na podstawie wartości
proporcji powierzchni / wysokości pików oraz proporcji stężeń substancji w dozowanych próbkach.
6. Zbadać jak zmienia się retencja rozdzielanych substancji (ln k) ze zmianą składu fazy ruchomej. Próbka
zostanie poddana rozdzielaniu w kolumnie chromatograficznej LiChrospher RP 18e (5µm) 125x4 mm w
różnych warunkach tj. przy różnym składzie fazy ruchomej (np. MeOH: H2O = 85:15; MeOH: H2O = 90:10 i
innych).
7. Wskazać optymalny skład fazy ruchomej, do rozdzielania w warunkach elucji izokratycznej WWA
(naftalenu, chryzenu, fluorenu, pirenu, antracenu)
8. W optymalnych warunkach dokonać rozdzielenia 2  3 roztworów kalibracyjnych o stężeniach: 1,4 µg/ ml ;
3,7 µg/ ml; 11 µg/ ml każdego ze wzorców (lub innych podanych przez prowadzÄ…cego ćwiczenia)
8
9. Zarejestrować chromatogramy i wyznaczyć powierzchnie i wysokości pików poszczególnych
składników roztworów kalibracyjnych
Rys. 2 Przykładowy poprawnie zintegrowany chromatogram roztworu kalibracyjnego zawierającego naftalen,
chryzen, fluoren, piren i antracen
10. W identycznych jak te, które stosowano podczas wzorcowania, dozować do kolumny roztwór próbki o
nieznanych stęzeniach komponentów
11. Zarejestrować chromatogram i odczytać powierzchnie i wysokości pików oznaczanych substancji
12. Na postawie uzyskanych krzywych kalibracyjnych wyznaczyć zawartość poszczególnych składników
oznaczanej próbki (wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych, pestycydów itp.) wyrażoną w ppm,
albo innych jednostkach stężenia.
Opracowanie wyników i sprawozdanie
Dla warunków układu faz odwróconych, należy wyniki opracować w taki sam sposób, jak dla warunków układu
faz normalnych. W sprawozdaniu należy, także, zamieścić schemat aparatu, krótki opis zasad wykonywania
oznaczeń ilościowych z zastosowaniem HPLC, równania otrzymanych linii kalibracyjnych, wartości
współczynników korelacji i wyniki oznaczenia stężenia węglowodorów aromatycznych / innych substancji
wskazanych przez prowadzącego w próbkach o nieznanych zawartościach tych substancji.
W oparciu o zalecenia podane w części ogólnej instrukcji, należy na sformułować wnioski dotyczące
otrzymanych wyników oraz zależności funkcyjnych, uwzględniające wpływ warunków rozdzielania na retencję
substancji, na selektywność układu chromatograficznego, na sprawność kolumny oraz wpływu warunków
rozdzielania i detekcji na dokładność i precyzję oznaczania zawartości substancji i na możliwość wykonywania
na zadowalającym poziomie ufności jakościowej identyfikacji substancji.
LITERATURA
3. M. Kamiński (ed)  Chromatografia cieczowa , CEEAM, Gdańsk, 2004.,
4. Z. Witkiewicz  Podstawy chromatografii, WNT, Warszawa 1995 i, korzystnie, wydania póz
niejsze.,
5. Inne podręczniki dotyczące współczesnej chromatografii cieczowej.
Warunkiem zaliczenia jest zaliczenie kolokwium teoretycznego oraz przygotowanie przez podgrupy /
grupę bezbłędnego sprawozdania.
9
Instrukcja ćwiczenia laboratoryjnego HPLC-2
1) OZNACZANIE ROZKA
ADU MASY CZ
STECZKOWEJ POLIMERÓW Z
ASTOSOWANIEM CHROMATOGRAFII ŻELOWEJ;
2) PRZYGOTOWANIE PRÓBKI Z ZASTOSOWANIEM SPE I
KONTROLA OBECNOÅšCI ORAZ OZNACZANIE ZAWARTOÅšCI
SACHAROZY W MIODZIE
WST
P
Chromatografia żelowa (GPC  Gel Permeation Chromatography, albo SEC  Size
Exclusin Chromatography) jest techniką rozdzielania substancji, w której wykorzystuje się
niejonowy mechanizm sita molekularnego, nazwany też mechanizmem wykluczania
molekularnego. W odróżnieniu od innych rodzajów chromatografii, w chromatografii żelowej
rozdziela się substancje prawie wyłącznie wg rozmiarów ich cząsteczek w roztworze.
Wykorzystuje się zróżnicowanie dostępności molekuł do porów o zróżnicowanych
średnicach, a w konsekwencji  zróżnicowanie w przestrzeni porów wewnątrz ziaren
wypełnienia kolumny - drogi i czasu dyfuzji cząsteczek różniących się wielkością i w
konsekwencji masą molekularną. Chromatografia żelowa może być też stosowana do
oznaczania zawartość tych składników próbki, które posiadają wydatnie wyższą, albo niższą
masę cząsteczkową od pozostałej części próbki. Bywa też wykorzystywana w procesie
przygotowania próbki, szczególnie, w celu oddzielenia substancji o wyższych masach
molekularnych od substancji oznaczanych, np. wyodrębnienie frakcji zawierającej WWA,
pestycydy, czy sole metali ciężkich z frakcji lipidów i fosfolipidów, albo kwasów
humusowych itp.
Ważne i wciąż rosnące zastosowanie ma też chromatografia jonowymienna i jonowa,
szczególnie w kontroli czystości różnego typu wód, a także ścieków. Dotyczy to przede
wszystkim oznaczania zawartości anionów nieorganicznych i organicznych, a także metali
alkalicznych, ziem alkalicznych, metali ciężkich, inhibitorów korozji itp. Stosuje się silne,
średnio mocne i słabe anionity oraz kationity. Szczególnie w przypadku rozdzielania
substancji organicznych wykorzystuje się często słabe, albo bardzo jonity i oddziaływania jon
 dipol, jon  dipol indukowany oraz dipol  dipol. Z wykorzystaniem bardzo słabych
anionitów można w ten sposób rozdzielać i oznaczać m.in. kwasy karboksylowe, cukry,
amino-cukry, aldehydy i alkohole.
CEL ĆWICZENIA
Celem pierwszej części ćwiczenia jest wyznaczanie rozkładu masy cząsteczkowej
polimerów na podstawie zależności funkcyjnej pomiędzy wartością log M (masy
cząsteczkowej) i czasem retencji wzorcowych polimerów (na podstawie specyficznego typu
krzywej kalibracyjnej).
W drugiej części ćwiczenia studenci mają za zadanie skontrolować czy próbka miodu
jest  sfałszowana (czy zawiera sacharozę) oraz oznaczyć zawartość sacharozy i dwóch
podstawowych cukrów (glukozy i fruktozy) obecnych w miodzie. Dodatkowym celem jest
przygotowanie próbki - oddzielenie wosków i innych składników hydrofobowych - z
zastosowaniem ekstrakcji do fazy stałej (SPE - solid phase ekstraction), a także wykonanie
kalibracji dla trzech rodzajów cukrów z wykorzystaniem metody krzywej kalibracyjnej
10
MATERIAA
Y I SPRZ
T
- Roztwory standardów polimerów o znanej wartości średniej masy cząsteczkowej i
minimalnej dyspersji rozkładu masy cząsteczkowej, w tetrahydrofuranie; Roztwory próbek
polimerów w tetrahydrofuranie; tetrahydrofuran, jako eluent; glukoza, fruktoza, sacharoza o
czystości ponad 99 % oraz roztwory kalibracyjne; Próbki miodu i ich roztwory w wodzie;
acetonitryl do HPLC, woda destylowana, albo o podobnej czystości;
- Aparat chromatograficzny do chromatografii żelowej: pompa
stem dozowania próbki  dozownik zaworowy z pÄ™tlÄ… 20 µl, kolumna
do chromatografii żelowej w warunkach liofilowych  wypełnienie LiChrogel PS MIX, dp =
5 µm, wymiary kolumny 250 mm (dÅ‚ugość) x 7 mm (Å›rednicy wewnÄ™trzna) detektor
refraktometryczny, integrator; zestaw sprzętowy do SPE, pompka próżniowa, kolumienki
SPE typu RP 18 (0.5 g); Waga analityczna
- Kolby miarowe 25, albo 10 ml; Pipeta automatyczna;
- Strzykawka 100, albo 50 µl (produkcji Hamilton, albo SGE).
OZNACZANIE ROZKA
ADU MASY MOLEKULARNEJ
Próbkę polimeru przeznaczonego do badania rozkładu masy cząsteczkowej rozpuszcza
się w fazie ruchomej (w tetrahydrofuranie). Określoną objętość tego roztworu wstrzykuje się
do kolumny chromatograficznej typu HPLC, wypełnionej kulistymi cząstkami kopolimeru
styren  diwinylobenzen o wysokim stopniu usieciowania. Kolumna umożliwia selektywne
rozdzielenie substancji różniących się masą cząsteczkową. Wylot kolumny jest połączony z
detektorem refraktometrycznym, którego sygnał jest proporcjonalny do stężenia oraz do masy
czÄ…steczkowej substancji eluowanych z kolumny. Otrzymany pik chromatograficzny zostaje
podzielony kilka do kilkunastu fragmentów o zbliżonych powierzchniach. Każdemu z
fragmentów zostaje przypisany czas retencji, odpowiadający położeniu  środka ciężkości
odpowiedniego fragmentu. Uzyskane wartości czasu retencji poszczególnych fragmentów
piku są porównywane są z odpowiadającymi im wartościami czasu retencji i logarytmu masy
cząsteczkowej na przygotowanej wcześniej krzywej kalibracyjnej, uzyskanej dla  nisko-
dyspersyjnych standardów polimerów. Wagowy udział poszczególnych frakcji o
określonych masach molekularnych w próbce badanego polimeru wyznacza się w
przybliżeniu na podstawie udziałów powierzchni poszczególnych fragmentów piku do
całkowitej jego powierzchni. W celu dokładnego określenia wagowego rozkładu stężenia
należy, dodatkowo, zastosować metodę normalizacji ze współczynnikami korekcyjnymi,
określonymi na podstawie wykresu cM = f(AM), gdzie: cM  to stężenie roztworu nisko-
dyspersyjnego polimeru o średniej masie molekularnej M, AM  to powierzchnie
odpowiedniego piku próbki kalibracyjnej.
WARUNKI ROZDZIELANIA
Przepływ fazy ruchomej  0,8 ml / min
Temperatura pokojowa
Ciśnienie  ok. 30 atm.
11
WYKONANIE ĆWICZENIA
1. Wzorcowanie
a). Sporządzić roztwory nisko  dyspersyjnych standardów polimerów o średnich
masach molekularnych: 2750000 Da, 580 Da w THF (stężenie końcowe roztworu ok. 2 mg /
ml) oraz 1260000 Da, 120000 Da, 30300 Da, 2450 Da (stężenie końcowe ok. 3 mg / ml);
b).Ustawić stałą prędkość przepływu eluentu (THF)  0,8 ml / min.
c).Ustabilizować warunki rozdzielania po zapewnieniu wypełnienia kanału
odniesienia detektora RI aktualnie stosowanym eluentem (konieczne uzyskanie stabilnej linii
podstawowej detektora  wahania wskazań na wyświetlaczu mniejsze od 0,2 jednostek
względnych);
d). Po ustaleniu warunków oznaczania, nastrzyknąć kolejno roztwory wzorcowych
polimerów w THF;
e).Zarejestrować chromatogramy i odczytać czas retencji oraz powierzchnię piku
każdego wzorca.
2. Wykonanie oznaczenia rozkładu masy molekularnej próbki polimeru
a). Zważyć ok. 0,2 g polimeru o nieznanej masie cząsteczkowej (np. styropian, fragment
sztućca, albo obudowy polistyrenowej) do kolby miarowej o poj. 10 ml i dopełnić do
kreski THF.
b). Po ustabilizowaniu warunków oznaczania, identycznych jak te, które stosowano
podczas wzorcowania, dozować do kolumny roztwór próbki i rozpocząć zbieranie
danych.
c). Z uzyskanego chromatogramu odczytać czas retencji (czas położenia maksimum
piku) oraz czas elucji poczÄ…tku i koÅ„ca oraz czas poÅ‚ożenia ok. ź, 1/3, ½, 2/3, ¾
powierzchni piku analizowanego polimeru.
OPRACOWANIE WYNIKÓW
1. Sporządzić wykres zależności czasu retencji od log M wzorcowych polimerów
(krzywa kalibracyjna);
2. Na podstawie wartości czasu retencji poszczególnych fragmentów piku badanego
polimeru, wyznaczyć z równania krzywej kalibracyjnej odpowiadające im wartości
masy cząsteczkowej oraz orientacyjny przebieg krzywej rozkładu masy cząsteczkowej
badanego polimeru przy założeniu, że czułość detektora RI nie zależy od masy
czÄ…steczkowej (metoda normalizacji  prostej );
3. Na podstawie zależności powierzchni pików standardów polimerowych o różnych
masach cząsteczkowych od ich stężenia w próbce dozowanej do kolumny wyznaczyć
skorygowany przebieg krzywej rozkładu masy cząsteczkowej badanego polimeru z
zastosowaniem metody normalizacji ze współczynnikami korekcyjnymi (znana
zależność funkcyjna cM = f(AM).
Uwaga !
Kalibracja z zastosowaniem nisko-dyspersyjnych standardów polistyrenu jest często
wykorzystywana także do wyznaczania rozkładu masy cząsteczkowej innych polimerów,
niż polistyren. Wówczas wyniki mogą mieć, jednak, tylko orientacyjny charakter. W celu
otrzymania wyników dokładnych należy zastosować do kalibracji nisko  dyspersyjne
standardy tego samego typu polimeru, którego rozkład masy cząsteczkowej jest badany,
12
albo wykorzystać takie metody detekcji, które pozwalają na wyznaczenie bezwzględnej
wartości masy molekularnej.
PRZYGOTOWANIE PRÓBKI (USUNI
CIE FRAKCJI WOSKÓW Z ZASTOSOWANIEM
SPE), KONTROLA OBECNOÅšCI SACHAROZY I OZNACZENIE ZAWARTOÅšCI
PODSTAWOWYCH CUKRÓW W MIODZIE METOD
HPLC  RID / NH2
Próbkę miodu o masie 0,5 g rozpuścić w 5 cm3 wody. Roztwór miodu przesączyć przez
kolumienkę SPE typu C18 w celu usunięcia wosków i steroli. Kolumienkę przed użyciem
należy kondycjonować ok. 10 ml fazy ruchomej (acetonitryl : woda 80:20 v/v). Po
naniesieniu badanego roztworu na kolumienkę, należy dodatkowo przepłukać ją 10 ml wody
do HPLC. Tak przygotowany roztwór rozcieńczyć 8  krotnie i poddać analizie
chromatograficznej.
WARUNKI ROZDZIELANIA
Przepływ fazy ruchomej  1.2 ml / min
Temperatura pokojowa
Ciśnienie  ok. 90 atm.
WYKONANIE ĆWICZENIA
1. Wzorcowanie
a). Sporządzić roztwory cukrów (glukoza, fruktoza, sacharoza) o stężeniu ok. 4mg/ml oraz
2 mg/ml każdego z wzorców
b). Ustawić stałą prędkość przepływu eluentu (acetonitryl :woda 80:20v/v)  1,2 ml / min.
c). Ustabilizować warunki rozdzielania po zapewnieniu wypełnienia kanału odniesienia
detektora RI aktualnie stosowanym eluentem (konieczne uzyskanie stabilnej linii
podstawowej detektora  wahania wskazań na wyświetlaczu mniejsze od 0,2 jednostek
względnych);
d). Po ustaleniu warunków oznaczania, nastrzyknąć kolejno roztwory wzorcowych cukrów
e). Zarejestrować chromatogramy oraz odczytać powierzchnię piku każdego wzorca.
3. Wykonanie oznaczenia
a). Wprowadzić do aparatu odpowiednią objętość roztworu miodu przygotowanego zgodnie z
procedurą opisaną powyżej
b) Zarejestrować chromatogramy oraz odczytać powierzchnie wszystkich pików
OPRACOWANIE WYNIKÓW
a). Sporządzić wykres zależności stężenia wyrażonego w mg / ml od powierzchni
wyznaczonej dla każdego wzorca cukru tj. glukozy, fruktozy i sacharozy
b). Na postawie uzyskanych krzywych kalibracyjnych wyznaczyć zawartość poszczególnych
cukrów w próbkach miodu wyrażoną w % masowych
c). Wyznaczyć całkowitą zawartość cukrów w próbce, wyrażoną w % masowych, przez
zsumowanie zawartości poszczególnych cukrów w próbce.
13
LITERATURA
Praca zbiorowa pod redakcją M. Kamińskiego  Chromatografia cieczowa , CEEM, Gdańsk,
2004;
D. Berek, M. Dressler, M. Kubin, K. Marcinka  Chromatografia żelowa PWN
Warszawa 1989.
14