Spektroskopia emisyjna
Fluorescencja i Fosforescencja
Reguły wyboru przejścia między termami
cząsteczkowymi
=0, 1
S=0
g u g g u u
+ + - - + -
Reguła Francka-Condona
Najbardziej prawdopodobne są
przejścia do takich stanów
oscylacyjnych wyższego stanu
elektronowego, dla których
cząsteczka ma taką geometrię,
jak w stanie równowagi dla
podstawowego stanu
elektronowego.
 =6  =5 lub
 =2  =20 lub
 =18  =0
Losy stanów wzbudzonych elektronowo
Proces w wyniku którego cząsteczka oddaje
energię wzbudzenia w postaci fotonu
nazywany jest zanikiem promienistym
Częściej jednak zachodzi proces zwany
zanikiem bezpromienistym:
(zamiana energii wzbudzenia w energię
ruchów termicznych otoczenia  czyli ciepło)
Rozpraszanie energii  wygaszanie emisji
Bezpromieniste w formie wzbudzenia drgań, wzrostu
temperatury, kontaktu z rozpuszczalnikiem. Taki
proces obecny jest zawsze.
" Gaszenie wewnętrzne - zmiany strukturalne
wewnątrz cząsteczkowe
" Gaszenie zewnętrzne - oddziaływanie cząsteczki w
stanie wzbudzonym z inną cząsteczką lub absorpcja
zarówno promieniowania wzbudzającego jak i
emitowanego przez inne chromofory obecne w
próbce.
Zanik promienisty
Fosforescencja
Fluorescencja
Fluorescencja
Fluorescencja  emisja promieniowania przez
naświetlaną substancję, która jest związana z
powrotem cząsteczek do stanu podstawowego o
tej samej multipletowości spinowej co stan
wzbudzony
Oba stany są na ogół singletami
Promieniowanie emitowane spontanicznie w
procesie fluorescencji zanika natychmiast po
wyłączeniu promieniowania wzbudzającego
Fluorescencja
Geometria cząsteczki nie ulega zmianie w trakcie
emisji więc może zostać obsadzony jeden z
wyższych poziomów oscylacyjnych podstawowego
stanu elektronowego
Pasmo fluorescencji wskazuje strukturę oscylacyjną
odzwierciedlającą odległości poziomów
oscylacyjnych podstawowego stanu elektronowego.
Jest ono na ogół przesunięte w kierunku niższych
częstości. Wynika to z bezpromienistego (utrata
energii na rzecz otoczenia ) zaniku wzbudzenia
oscylacyjnego na wyższym poziomie elektronowym
przed powrotem cząsteczki do stanu podstawowego
Mechanizm fluorescencji S1 S0
1. Absorpcja promieniowania
wzbudza przejścia siglet-
Singlet (S1)
singlet, którym towarzyszy
wzbudzenie poziomów
oscylacyjnych
2. Następuje bezpromienista
utrata energii na rzecz
otoczenia
Singlet (S0)
3. Emisja promieniowania
następuje z podstawowego
poziomu oscylacyjnego
wzbudzonego stanu
elektronowego
Typowe wzbudzenie fluorescencyjne
C-C wiązanie
Wysoka energia oscylacyjna
Wysoka
energia,
krótkie fale
Wzrost energii potencjalnej
C=C wiązanie
Niska energia oscylacyjna
Typowa emisja fluorescencyjna
Wzrost energii potencjalnej
Ciepło
C-C wiązanie
Wysoka energia
oscylacyjna
C-C wiązanie
Niska energia oscylacyjna
Dłuższe fale,
niższa energia
C=C wiązanie
światła
Niska energia oscylacyjna
Fluorescencja
Fluorescencja
Widmo absorpcyjne (a)
wykazuje strukturę
oscylacyjną charakterystyczną
dla stanu wzbudzonego
Widmo fluorescencyjne (b)
ukazuje strukturę
charakterystyczną dla
niższego stanu. Jest
przesunięte do niższych
energii
Przejścia oscylacyjne 0-0
Energia
pokrywają się
0-0 Przejście
Fluorescencja
Przesunięcie Stokesowskie
W 1852 roku na podstawie takich obserwacji zostało sformułowane
prawo, od nazwiska odkrywcy, nazwane prawem Stokesa,
które mówi, że długość fali promieniowania fluorescencyjnego
jest zawsze większa od długości fali promieniowania
wzbudzającego fluorescencję.
Różnica energii pomiędzy pikiem absorpcji a pikiem emisji to
przesunięcie Stokesa
Przesunięcie Stokesa 25 nm
Fluoresceina
520 nm
495 nm
Intensywność fluorescencji
Widmo fluoresceiny
Fluorescencja
Fluorofory są składnikami cząsteczki, które
absorbują energie
Są to na ogół pierścienie aromatyczne
Charakterystyka fluorescencji
1. Ze względu na to, że cząsteczka może być na różnych
stanach rotacyjnych, oscylacyjnych i elektronowych 
piki są SZEROKIE
2. Każde widmo jest charakterystyczne dla danej
cząsteczki
3. Przed powrotem do swojego podstawowego stanu,
elektron pozostaje w stanie wzbudzonym przez
ok. 10  8 sekund.
4. Ze względu na to, że stan wzbudzony jest WYSOCE
REAKTYWNY  może reagować z inną cząsteczką
5. Światło rozchodzi się we wszystkich kierunkach
Wydajność kwantowa fluorescencji
Q = ilość fotonów emitowanych/ilość fotonów absorbowanych
Tryptofan
Charakterystyczne pasmo absorpcji i emisji.
2
Maksimum
Intensywność
150
intensywności
Fluorescencji
A
(Q)
100
50
200 300
400
 max
Fluorescencja
Fluorescencję obserwuje się dla:
Sztywnych struktur
Delokalizowanych elektronów
Intensywnych pasm absorpcyjnych UV
(Ą Ą* przejścia, Try -5700 m-1 cm-1)
Krótkich czasów wzbudzenia (<10  9 sec).
Wewnętrzne fluorofory w białkach to Tryptofan
(Try), Tyrozyna (Tyr) i Fenyloalanina (Phe)
Try i Tyr emisja znacznie silniejsza niż Phe,
Zasady DNA ,nukleotydy
Zastosowanie
" Podobne jak spektroskopii UVVIS
" Analityczne
" Strukturalne  lokalne konformacje (aromatyczne
aminokwasy), struktura trzeciorzędowa białek,
denaturacja.
" Kompleksowanie, tworzenie wiązań.
" Chemiluminescencja.
" Mikroskopia fluorescencyjna.
" Fluorescencja jest znacznie wrażliwsza na zmianę
środowiska fluoroforu niż spektroskopia absorpcyjna w
zakresie UV/Vis.
Metody pomiaru fluorescencji
Widmo emisji- wzbudzająca długość fali  stała, pomiar intensywności
fluorescencji (emisji) w zależności od długości fali  widmo
Widmo wzbudzenia  pomiar intensywności fluorescencji dla różnych
długości fal wzbudzenia , podobne do widm absorpcyjnych.
próbka
Przepuszczone
Io 1
promieniowanie
y
ródło
światła Monochromator
Emisja
2
Detektor
y
ródła wzbudzające
Lampy
Ksenon
Ksenon/Rtęć
Lasers
Argon (Ar)
Krypton (Kr)
Hel Neon (He-Ne)
Hel Cadm (He-Cd)
Krypton-Argon (Kr-Ar)
Mikroskop fluorescencyjny
Niektóre substancje obecne
w komórkach i tkankach
mają zdolność do własnej
fluorescencji: porfiryny,
chlorofil, hemoglobina,
witamina A.
Barwniki fluorescencyjne
używane są do znakowania
interesujących nas molekuł,
poprzez wiązanie się z nimi,
w utrwalonych i żywych
komórkach
(fluoresceina, rodamina, DAPI)
DNA w jądrze wybarwione DAPI
Zasady interpretacji widm fluorescencyjnych białek
" W białkach fluoryzują tylko 3 aminokwasy: Try, Phe, Tyr
" Jeśli położenie maksimum emisji Try przesuwa się w kierunku fal
krótszych i intensywność rośnie to oznacza, że aminokwas znajduje
się w środowisku mniej polarnym
" W roztworze polarnym przesunięcie oznacza, że tryptofan znajduje
się wewnątrz struktury białkowej.
" Identyczne przesunięcie w roztworze niepolarnym wskazuje na taka
zmianę struktury, że Try znajduje się na powierzchni
" Jeśli obecne są zewnętrzne wygaszacze (jon jodkowy, azotany) i
obserwuje się zanik fluorescencji oznacza to, że tryptofan znajduje się
na powierzchni. W przypadku braku wygaszania aminokwas jest
wewnątrz struktury niedostępnej dla wygaszacza.
Zasady interpretacji widm fluorescencyjnych białek
Emisję Try wygaszają zprotonowane grupy
karboksylowe stąd można ocenić sąsiedztwo tego
aminokwasu
Jeśli wolny aminokwas zmienia intensywność
fluorescencji w obecności substratu a w białku
substrat nie oddziałuje oznacza to, że substrat
wprowadza zmiany konformacyjne , w których Try
zostaje ukryty wewnątrz struktury
Jeśli substancja wiąże się z białkiem i fluorescencja
tryptofanu maleje to można wnioskować albo o
zmianie konformacyjnej albo, że Try znajduje się
bardzo blisko centrum wiążącego
Fosforescencja T1 S0
Emisja promieniowania
związana jest z dezaktywacją
cząsteczek, znajdujących się
w stanie o innej multipletowości
niż stan podstawowy.
A
P
F
F
Mechanizm fosforescencji
Absorpcja promieniowania wzbudza przejście
singlet-singlet, któremu towarzyszy
wzbudzenie poziomu oscylacyjnego
W trakcie bezpromienistego wygaszania
oscylacyjnego może dojść do przejścia
interkombinacyjnego (konwersji
międzysystemowej) z krzywej stanu
singletowego na krzywą stanu trypletowego
spowodowanego oddziaływaniem spin-orbita.
Mechanizm fosforescencji
Przejście to jest ułatwione obecnością wspólnego
poziomu oscylacyjnego elektronowych stanów
wzbudzonych
Stan trypletowy cząsteczki bezpromieniście przechodzi
na zerowy poziom oscylacyjny i pozostaje na nim tak
długo aż złamanie reguły S=0 pozwoli na powrót do
stanu podstawowego i emisję promieniowania
elektromagnetycznego
Pozostawanie cząsteczek w stanie wzbudzonym
przejawia się nieraz długotrwałym świeceniem substancji
po ustaniu naświetlania
Mechanizm fosforescencji T1 S0
1. Absorpcja promieniowania
wzbudza przejście singlet-
singlet
2. Przejście interkombinacyjne
z krzywej stanu
singletowego na krzywą
stanu trypletowego
(przemiana wzbroniona
T S)
3. Stan trypletowy cząsteczki
bezpromieniście przechodzi
na zerowy poziom
oscylacyjny
4. Cząsteczka w stanie
wzbudzonym przejawia
nieraz długotrwałe
świecenie
Doświadczalna różnica pomiędzy
fluorescencją i fosforescencją.
I
Fluorescencja zanika
natychmiast, gdy
usuniemy z
ródło
wzbudzenia, podczas
gdy fosforescencja trwa
przez dłuższy okres
czasu a jej
intensywność zanika
T
powoli
Intensywność emisji
Diagram Jabłońskiego (1933)
Diagram Jabłonskiego (dla
naftalenu) w uproszczeniu
przedstawia obraz względnego
położenia poziomów elektronowych
cząsteczki.
IC: Konwersja wewnętrzna
ISC: Konwersja międzysystemowa
Schemat Jabłońskiego
S stany singletowe
T stany trypletowe
Wzbudzone stany oscylacyjne
A absorpcja
F fluorescencja
P fosforescencja
IC konwersja
wewnętrzna
ISC konwersja
interkombinacyjna
Stan elektronowy podstawowy
Energia
Czasy w jakich zachodzą procesy
dezaktywacji cząsteczki
Absorpcja: 10-15 s
Relaksacja wibracyjna: 10-12 - 10-10 s
Czas życia w pierwszym stanie wzbudzonym
S1 10-10 - 10-7 s, fluorescencja
Konwersja wewnętrzna: 10-11 - 10-9 s
Konwersja międzysystemowa: 10-10 - 10-8 s
Czas życia stanu wzbudzonego T1 10-6  1s,
fosforescencja
Reguła Kashy
Obserwowana fluorescencja lub fosforescencja
niemal wyłącznie pochodzi od przejść z
najniższego stanu wzbudzonego o danej
multipletowości tzn. ze stanu S1 lub T1.
Wynika to z dużej szybkości bezpromienistej
dezaktywacji (1012 s-1) , znacznie większej niż
szybkość przejść promienistych rzędu 109 s-1
Charakterystyka zachodzących
procesów w czasie wzbudzenia
Konwersja wewnętrzna
Jest to bezpromieniste przejście pomiędzy
dwoma elektronowymi stanami o tej samej
multipletowości (2S+1). W roztworze proces
ten zachodzi jako relaksacja wibracyjna z
wysokich stanów wibracyjnych do
podstawowego wibracyjnego. Dzieje się tak
na skutek kolizji z cząsteczkami
rozpuszczalnika
Charakterystyka zachodzących
procesów w czasie wzbudzenia
Kiedy cząsteczka zostaje wzbudzona do wyższego
stanu wibracyjnego pierwszego wzbudzonego
elektronowego to poprzez procesy wibracyjnej
relaksacji lub konwersji wewnętrznej i wibracyjnej
relaksacji gdy są to stany elektronowe wyższe
przechodzi do stanu podstawowego oscylacyjnego
pierwszego stanu wzbudzonego elektronowego w
czasie około 10-13 - 10-11 s.
Przejście ze stanu elektronowego 1 do 0 jest już
mniej prawdopodobne ze względu na największa
różnicę energii.
Luminiscencja
Zjawisko to, zwane jarzeniem lub niekiedy
zimnym świeceniem polega na emitowaniu
światła, które powstaje kosztem innych
rodzajów energii niż energia cieplna.
Rodzaje luminescencji
Fotoluminescencja (świecenie spowodowane
promieniowaniem UV lub widzialnym VIS).
Fotoluminescencję dzieli się na:
fluorescencję i fosforescencję
" Fluorescencja jest świeceniem krótkotrwałym,
trwającym nie dłużej niż 10-8 s
" Fosforescencja to świecenie długotrwałe,
dochodzące do kilku godzin a nawet dni
Fotoluminescencja
Fotoluminescencję wykazuje wiele substancji,
jak choćby organiczne barwniki stosowane w
odblaskowych flamastrach czy luminofory
stosowane w świetlówkach-rurach
fluorescencyjnych.
Rodzaje luminescencji
Termoluminescencja  luminescencja
następuje po uprzednim naświetleniu
substancji i następnie jej ogrzaniu.
Mamy tu do czynienia z gromadzeniem
energii świetlnej i wypromieniowaniu jej gdy
tego chcemy- w momencie podgrzania.
Rodzaje luminescencji
Chemiluminescencja to świecenie wywołane
reakcjami chemicznymi, np. podczas
utleniania fosforu białego lub luminolu.
Luminofory nieorganiczne
Siarczki takie jak siarczek cynku ZnS i siarczek kadmu.
Cechuje je wysoka wydajność świetlna. Luminofory
siarczkowe są dobrymi katodoluminoforami, elektrolu-
minoforami i rentgenoluminoforami
Tlenosiarczek itru aktywowany europem okazał się bardzo
dobrym luminoforem czerwonym, stosowanym w telewizji
kolorowej
Luminofory z grupy halofosforanów wapnia znalazły
zastosowanie w świetlówkach. Mają dobrą wydajność
świetlną, są aktywowane manganem.
Wolframian wapnia aktywowany srebrem i tantalan itru
aktywowany niobem są dobrymi rentgenoluminoforami
stosowanymi do folii wzmacniających w rentgeno-
diagnostyce
Luminofory nieorganiczne
Luminofory siarczkowe (siarczki metali)
najwolniej gasnące-siarczki wapniowców
CaS, SrS: Cu, Bi, Pb.
kadmu i cynku
ZnS, CdS: Ag, Cu, Co, Mn
tlenosiarczkowe
Y2O2S: Eu
Luminofory organiczne-przykłady
-fluoresceina
-eozyna
-uranina
-niektóre polimery
Przykłady fosforów i luminoforów
Materiał luminescencyjny: NaI(Tl), np. licznik
scyntylacyjny, detekcja promieni X oraz gamma
po absorpcji kwantu elektron przechodzi do pasma
przewodnictwa NaI, emisję światła (410 nm) powoduje
przejście na poziom domieszkowy talu.
Fosfory siarczkowe- ZnS:Ag; ZnS:Cu; CdS:Ag
kiedyś popularne w farbie świecącej w budzikach
składniki luminoforów telewizyjnych,
ponieważ ZnS jest półprzewodnikiem, łatwiej następuje
przeniesienie e- w paśmie przewodnictwa na domieszkę.
Wydajność przenoszenia energii w izolatorach (fosforany)
jest mniejsza.