Ćwiczenie 1 i 2
Identyfikacja i różnicowanie Staphylococcus
Szczepy:
1. Micrococcus luteus
2. Micrococcus luteus ATCC 4698
3. Staphylococcus aureus ATCC 25923
4. Staphylococcus epidermidis ATCC 14990
5. Staphylococcus epidermidis 136 (izolat kliniczny)
6. Staphylococcus aureus PSK 63 (izolat kliniczny)
7. Staphylococcus warneri
8. Staphylococcus haemolyticus
9. Staphylococcus capitis ATCC 27840
10. Staphylococcus aureus ATCC 43300
11. Staphylococcus aureus ATCC 6538
Podłoża i testy:
1. agar LB  wykrywanie katalazy
2. agar z krwiÄ…
3. podłoże Chapman a
4. Baird Parker Medium
5. podÅ‚oże Müller-Hintona
6. podłoże z DNA (wykrywanie DNA-zy)
7. bulion z mannitolem
8. bulion z solÄ… sodowÄ… fenoloftaleiny (do wykrywania fosfatazy alkalicznej)
9. agar z dodatkiem 10% mleka
10. surowica królicza (do wykrywania koagulazy)
11. zestaw diagnostyczny do identyfikacji gronkowca złocistego Microgen Staph
12. krążki nowobiocyna, bacytracyna
13. Testy Api Staph
1
Wykonanie ćwiczenia
1. Badania mikroskopowe
Należy wybarwić preparaty metodą Grama
2. Wykonać posiew metodą sektorowo-redukcyjną na agarze LB, podłożu Chapman a i
Baird-Parker a. Płytki z agarem z krwią i podłożem na DNA-zę podzielić na sektory (4
lub 6) na każdym z nich wysiać badane szczepy. Posiane płytki inkubować w
temperaturze 37ºC.
3. Wysiać badane szczepy na skosy agaru odżywczego z dodatkiem 10% mleka. Hodować w
temperaturze pokojowej przez kilka dni, obserwować kolor pigmentu produkowanego
przez badane szczepy.
Wytwarzanie barwnika przez Staphylococcus zależy od składu podłoża (stymulują go
takie składniki jak: mleko, glicerol) oraz warunków hodowli (światło i temperatura 27-30
ºC).
4. Do probówek z bulionem zawierającym mannitol wsiać po uszku ezy badanych szczepów
gronkowców, jednÄ… probówkÄ™ z pożywkÄ… zostawić jako kontrolÄ™. Inkubować w 37 ºC.
Zmiana zabarwienia z zielonego na żółte świadczy o fermentacji mannitolu.
5. Podłoże do wykrywania fosfatazy zawiera bulion z dodatkiem 1% soli sodowej
difosforanu fenoloftaleiny (w 0.066 M buforze fosforanowym). ZwiÄ…zek ten jest
hydrolizowany przez fosfatazy i uwalniana jest do podłoża fenoloftaleina (bezbarwna w
pH 8,3; a czerwona w pH 10).
Do probówki należy wsiać ezÄ™ badanego szczepu bakterii, inkubować w temp. 37ºC przez
16 h. Na kolejnych ćwiczeniach do probówek dodać 1-2 krople 10% NaOH.
Wynik dodatni: podłoże zabarwia się na kolor amarantowo-czerwony.
6. Oznaczanie wytwarzania koagulazy metodą probówkową.
Zasada testu:
Koagulaza jest zewnątrzkomórkowym białkiem, które wiąże się do protrombiny tworząc
kompleks zwany stafylotrombiną, wtedy fibrynogen jest przekształcany w fibrynę
(powstaje skrzep)
Wykonanie:
Do oznaczeń stosuje się osocze królika rozcieńczone pięciokrotnie płynem
fizjologicznym. Do 0,5 ml osocza dodać za pomocą ezy hodowle gronkowca z podłoża
agarowego. Inkubować w temperaturze 37ºC, wynik testu tzn. wystÄ…pienie wyraz
nego
skrzepu odczytać po 4 h.
Uwaga:
2
Ze względu na możliwość rozpuszczenia powstałego skrzepu fibryny przez stafylokinazę
(bakteryjny aktywator plazminogenu o aktywności proteolitycznej), wynik należy
odczytać do 24 h.
7. Wykrywanie czynnika skupiania (CF-clumping factor) i białka A
MICROGEN® Staph jest szybkim testem lateksowym do potwierdzenia identyfikacji
Staphylococcus aureus, działającym na zasadzie aglutynacji szkiełkowej.
Zasada testu:
Cząsteczki lateksowe są pokryte fibrynogenem (do którego wiąże się czynnik skupiania
CF) i IgG (które wiążą się z białkiem A). Po zmieszaniu z zawiesiną S. aureus cząsteczki
lateksowe błyskawicznie reagują tworząc zauważalne agregaty. Brak zauważalnej
aglutynacji świadczy o wyniku ujemnym.
Wybrać 1 - 2 izolowane kolonie rosnÄ…ce przez 18 - 24 godz. w temp. 35 - 37°C na
podłożu do izolacji wstępnej, takim jak agar z 5% krwi.
Wykonanie:
A. Wymieszać lateks MICROGEN® Staph przez delikatne odwracanie buteleczki i dodać
1 kroplę do kółka na czystej, suchej karcie reakcyjnej.
B. Pobrać jałową ezą jedną kolonię badanego szczepu i zawiesić w kropli odczynnika
lateksowego na karcie. Rozprowadzić na powierzchni kółka pałeczką do mieszania.
C. Delikatnie obracać kartę przez 2 minuty i obserwować, czy pojawia się aglutynacja.
D. Po odczycie wrzucić zużyte karty i pałeczki do roztworu odpowiedniego środka
dezynfekcyjnego.
Uwagi:
üð Badać tylko czyste, pojedyncze kolonie, ponieważ mieszane kolonie mogÄ… dawać
błędne wyniki.
üð Hodowle starsze od 30-godzinnych mogÄ… dawać autoaglutynacjÄ™.
üð PodÅ‚oża o wysokiej zawartoÅ›ci soli, takie jak Mannitol Salt Agar (Chapman),
hamują wytwarzanie białka A, co może prowadzić do fałszywie ujemnych
wyników.
üð PozytywnÄ… wynik uzyskuje siÄ™ dla innych niż S. aureus koagulazo-dodatnich
gronkowców np. S. intermedius i S. hyicus (te dwa ostatnie gatunki rzadko izoluje
się z materiałów od ludzi, częściej od zwierząt)
3
8. Wytwarzanie katalazy przez gronkowce sprawdzić na płytkach LB
odżywczym przez nakroplenie 3% wody utlenionej, pojawienie się bąbelków gazu
świadczy o obecności enzymu.
Katalaza jest enzymem wytwarzanym przez większość bakterii tlenowych.
Unieszkodliwia ona nadtlenek wodoru powstajÄ…cy w czasie metabolizmu tlenowego,
katalizując jego rozkład do wody i tlenu.
9. Oznaczyć wrażliwość na wybrane antybiotyki metodą dyfuzyjno-krążkową wg przepisu
producenta.
10. Dla wybranych szczepów wykonać testy Api Staph według przepisu producenta.
Podłoże Baird-Parker
Skład podłoża (g/l):
Pepton K 10,00
Ekstrakt drożdżowy 1,00
Ekstrakt wołowy 5,00
L-glicyna 12,00
Pirogronian sodu 10,00
Chlorek litu 5,00
Agar 15,00
Końcowe pH 7.2 ą 0.2
Sposób przygotowania:
58,0 g podÅ‚oża zawiesić w 1000 ml wody destylowanej. Sterylizować w 121ºC przez 15
minut. Po ochÅ‚odzeniu podÅ‚oża do 45 Ä… 1ºC, dodać na każde 100 ml podÅ‚oża 1 ml 1%
roztworu tellurynu potasu + 5 ml gotowej emulsji żółtka, lub 5 ml gotowej emulsji żółtka z
tellurynem potasu.
Opis:
Podłoże Baird-Parkera służącym do izolacji i różnicowania gronkowców, szczególnie
Staphylococcus aureus w produktach spożywczych i innych materiałach. Jest ono podłożem
wybiórczym ze względu na obecności w podłożu chlorku litu i tellurynu potasu, który hamuje
wzrost mikroflory towarzyszącej. Obecność pirogronianu sodu i glicyny selektywnie
stymuluje wzrost S. aureus. Telluryn hamuje wzrost większości koliform i jest również
redukowany przez S. aureus do metalicznego tellurynu - stÄ…d czarne zabarwienie kolonii.
Dodatek żółtka jaja umożliwia wykrycie dwóch reakcji typowych dla S. aureus tj. produkcję
lecytynazy  opalizująca strefa wokół kolonii i produkcja lipazy  przezroczysta strefa na
4
zewnątrz strefy opalizującej (wymienione właściwości lityczne nie muszą występować
jednocześnie).
Na tym podłożu kolonie S. aureus są średnicy 1-3 mm, czarne, z wąskim opalizującym
brzegiem otoczone 2-5 mm strefą przejaśnienia. S. saprophyticus i inne koagulazo-ujemne
gronkowce tworzą mniejsze (0,5 - 2 mm) czarne kolonie, ich wzrost jest słaby
Micrococcus sp.  małe kolonie, brązowe do czarnego zabarwienia, bez strefy przejaśnienia.
Podłoże Chapman a - agar z mannitolem
Skład podłoża (g/l):
Pepton 10,00
Ekstrakt wołowy 1,00
Chlorek sodu 75,00
D-Mannitol 10,00
Czerwień fenolowa 0,025
Agar 15,00
KoÅ„cowe pH 7.4 Ä… 0.2 w 25ºC
Sposób przygotowania:
111,0 g podÅ‚oża zawiesić w 1000 ml wody destylowanej . Sterylizować w temperaturze 121ºC
przez 15 minut.
Opis:
Agar z mannitolem wg Chapmana służy do izolowania i wykrywania gronkowców
chorobotwórczych w artykułach spożywczych i innych materiałach. Jest to podłoże
wybiórcze, ze względu na wysoki dodatek soli (7,5% NaCl) w podłożu, są w stanie rosnąć na
nim organizmy halofilne, w tym gronkowce. Podłoże pełni również funkcje różnicującą,
pozwalając na stwierdzenie zdolności wykorzystania mannitolu przez mikroorganizmy.
Bakterie mające zdolność wykorzystywania mannitolu z wytworzeniem kwasów, powodują
spadek pH środowiska hodowli, co stwierdza się dzięki obecności indykatora pH - czerwieni
fenolowej.
Mikroorganizmy tworzące zazwyczaj duże, kremowe do pomarańczowej barwy kolonie,
otoczone wyraz
ną żółtą strefą to mannitolo-dodatnie gronkowce.
Mikroorganizmy tworzące drobne, białe do różowej barwy kolonie, przy braku zmiany koloru
podłoża to mannitolo-ujemne gronkowce np. (S. epidermidis).
5
DNase Test Agar (Agar z DNA)
Skład podłoża (g/l)
Bacto Trypton 20,0
Chlorek sodu 5,0
Kwas dezoksyrybonukleinowy 2,0
Agar 15,0
pH 7,3 Ä…0,2
Opis:
Kwas dezoksyrybonukleinowy o dużej masie cząsteczkowej umożliwia wykrycie
dezoksyrybonukleazy (DNAzy), która powoduje depolimeryzację DNA. Podłoże jest
stosowane głównie do identyfikacji gronkowców, jednak może być także wykorzystane do
wykrywania aktywności DNA-zy u innych bakterii (np. Serratia marcescens).
Po okresie inkubacji badanych szczepów na podłożu płytkę zalewa się 1 N HCl, który strąca
spolimeryzowany DNA, podłoże staje się mętne. Jeśli drobnoustroje wytwarzają DNA-zę
widoczna jest przejrzystą strefę wokół wzrostu bakterii.
Agar z krwiÄ… (Agar Columbia + 5% krwi baraniej)
Skład podłoża (g/l)
Pepton K 10,00
Enzymatyczny hydrolizat mięsny 5,00
Trzustkowy hydrolizat serc 3,00
Ekstrakt drożdżowy 5,00
Skrobia kukurydziana 1,00
Chlorek sodu 5,00
Agar 12,00
KoÅ„cowe pH 7.3 Ä… 0.2 w 25ºC
Do 95 ml schÅ‚odzonego do okoÅ‚o 45 50ºC podÅ‚oża dodać 5 ml krewi baraniej.
Opis:
Agar Columbia zawiera dużą ilość składników odżywczych gwarantujących wzrost
mikroorganizmów o podwyższonych wymaganiach pokarmowych. Obecność krwi w podłożu
niesie z sobą dodatkowo czynniki wzrostowe i jest podstawą do określania typu hemolizy
charakterystycznej dla gronkowców, streptokoków i innych mikroorganizmów.
6