Należy wziąć pod uwagę: czułość metody detekcji, powtarzalność,
stopień trudności,
cenę.
Dokładnie zaplanować:
1. Miejsce znakowania  selektywność  często jest ogromnie istotne, aby tylko jedna
konkretna grupa została wyznakowana (np. FRET); czasem chcemy wprowadzić
znaczniki w wiele miejsc (większa czułość, łatwiejsza detekcja).
- dostępność tego miejsca w formie natywnej biocząsteczki
dla znacznika (czy nie będzie konieczne rozwijanie cząsteczki).
2. Wybór sposobu sprzęgania  stabilne czy z możliwością przecięcia
3. Wybór samego znacznika, jego stabilność
4. Skalkulować ilość potrzebnych reagentów tak, aby po oczyszczeniu i
przetestowaniu wystarczyło do doświadczeń
Najlepszymi kandydatami do modyfikacji są reszty aminokwasowe ulegające
jonizacji: Asp. Glu, Lys, Arg, Cys, His, Tyr. W formie nieuprotonowanej łańcuchy
boczne tych aminokwasów mogą funkcjonować jako silne nukleofile w reakcjach
addycji.
Grupy zdolne do jonizacji mogą występować w białku w formie uprotonowanej i
nieuprotonowanej.
pH = pKa + log{[zasada]/[kwas]}
Grupa w pKa jest w 50% zjonizowana.
W pH większym (lub mniejszym) o jedną jednostkę od pKa grupa będzie w 91%
nieuprotonowana (lub w 91% uprotonowana).
Dwie jednostki pH powyżej lub poniżej pKa => 99%
Grupy karboksylowe w pH poniżej ich wartości pKa występują w formie
uprotonowanej i nie są wtedy obdarzone ładunkiem.
W pH> pKa występują w formie nieuprotonowanej i są obdarzone ładunkiem
ujemnym.
Ta sama prawidłowość dotyczy grupy  OH tyrozyny
Grupy aminowe  pH< pKa => uprotonowane i obdarzone ładunkiem.
R-S- > R-NH2 > R-COO- = R-O-
Najsilniejszym nukleofilem jest grupa sulfhydrylowa cysteiny, zwłaszcza w formie
zjonizowanej.
Kolejne: grupy aminowe w niezjonizowanej formie nieuprotonowanej: ą-aminy, �-
aminy łańcuchów bocznych Lys, aminy drugorzędowe pierścienia imidazolowego
histydyny i pierścienia indolowego tryptofanu, grupy guanylowe Arg.
Najsłabszymi nukleofilami są grupy zawierające tlen: C-końcowa grupa
karboksylowa, reszty karboksylowe łańcuchów bocznych Asp i Glu, grupa fenolanowa
Tyr.
Zgodnie z teoretycznymi wartościami pKa reakcje podstawienia nukleofilowego
angażujące aminy pierwszorzędowe lub grupy SH reszt Cys nie powinny efektywnie
zachodzić poniżej pH ok. 8.5. W praktyce reakcje zachodzą z dużą wydajnością w pH
niewiele wyższym od neutralnego.
Grupy �-aminowe Lys w białku, wykazujące teoretyczna wartość pKa ok. 10, mogą
występować w znaczącej frakcji w nieuprotonowanej formie nawet w pH=7.2 => mogą
wydajnie ulegać modyfikacji
Pochodne jodooctanowe reagują przede wszystkim z grupami SH w białkach, ale
reakcja ta nie jest całkowicie specyficzna. Pochodne jodooctanowe mogą reagować
także z azotem pierścienia imidazolowego (His), tioeterami Met, z grupami �-
aminowymi Lys i N-terminalnymi aminami.
Relatywna reaktywność pochodnych jodooctanowych z grupami funkcjonalnymi
białek:
-SH > N imidazol > tioeter > gr. aminowa
Jeżeli jodooctan jest obecny w odpowiedniej ilości względem liczby grup SH i pH
jest lekko alkaliczne, będzie zachodziła wyłącznie modyfikacja Cys.
Imidy kwasu maleiminowego (maleimidy), np. N-ethyl-maleimid (NEM)
Są uznawane za specyficzne względem grup SH, zwłaszcza w pH poniżej 7, kiedy
inne nukleofile są uprotonowane. W roztworach o pH lekko kwasowym i bliskim 7
reakcje NEM z tiolami są 1000-krotnie szybsze niż z grupami aminowymi (zakres pH
6.5-7.5)
Tiole reagują z podwójnym wiązaniem i w rezultacie powstaje stabilne wiązanie
tioeterowe, które nie ulega zerwaniu w warunkach fizjologicznych.
Przebieg reakcji może być śledzony spektrofotometrycznie (zanik absorpcji przy
300 nm)
Związki zawierające wiązanie S-S
Reakcja wymiany polega na ataku siarki z grupy tiolowej na siarkę w disiarczku,
zerwaniu istniejącego disiarczku i utworzeniu nowego mieszanego disiarczku.
Powstałe wiązania łatwo mogą być zerwane przy użyciu związków redukujących.
DZI
KI TEMU związki sprzęgnięte mogą być uwolnione in vivo (np. uwalnianie
toksyny z koniugatów immunotoksyn po uwolnieniu toksyna może penetrować
komórkę docelową i wywoływać jej śmierć).
Reakcje wymiany disiarczków mogą zachodzić w różnorodnych warunkach:
pH od kwaśnego po zasadowe, różnorodne składniki buforów
Disiarczki pirydylu są najbardziej popularnym typem związków funkcjonujących w
oparciu o reakcję wymiany disiarczków, używanych do sieciowania lub modyfikowania
białek.
" Disiarczek pirydylu z łatwością reaguje z wolną grupą sulfhydrylową dając
pojedynczy mieszany disiarczek. Jest to możliwe dzięki temu, że grupa
funkcyjna disiarczku pirydylu zawiera grupę  opuszczającą , ulegającą
przemianie w niereaktywny związek.
Uwalniany związek nie zawiera grupy SH. Posiada on charakterystyczne
właściwości spektralne i dzięki temu można tę reakcję monitorować
spektrofotometrycznie.
TNB-tiole  grupa  opuszczająca  kwas 5-tio-2-nitrobenzoesowy
Przykładem związku tego typu jest odczynnik Ellmana, 5,5  dithio-bis (kwas 2-
nitrobenzoesowy) (DTNB), zwiazek wykorzystywany do ilościowego oznaczania
zawartości wolnych grup SH w białkach.
Uwalniany w rekcji TNB posiada intensywnie żółte zabarwienie i reakcja może być
monitorowana spektrofotometrycznie.
 = 412 nm
� = 1.36 x 104 M-1cm-1 w pH = 8.0
GRUPY AMINOWE
Grupy reaktywne zdolne do reagowania z grupami aminowymi są najczęściej
spotykanymi grupami funkcyjnymi reagentów sieciujących i modyfikujących białka.
Reakcje wiązania z grupami aminowymi oparte są o dwa typy reakcji:
1. acylacja
2. alkilacja
Większość tego typu reakcji zachodzi bardzo szybko, z dużą wydajnością.
Izotiocyjaniany
Reagują z nukleofilami takimi, jak aminy, SH, jony fenolanowe łańcuchów
bocznych Tyr. Stabilne produkty są uzyskiwane jedynie w przypadku amin
pierwszorzędowych.
Są to związki umożliwiające selektywną modyfikację łańcuchów bocznych Lys i N-
teminalnych grup aminowych.
Izotiocyjaniany reagują najwydajniej w pH zasadowym, gdy docelowe grupy
aminowe są zdeprotonowane. Często prowadzi się reakcje w 0.1 M buforze
węglanowym, pH=9.0
UWAGA:
Grupa izotiocyjanianowa jest relatywnie niestabilna w roztworach wodnych.
Izocyjaniany
Są bardziej reaktywne od izotiocyjanianów, ale są jeszcze bardziej niestabilne
Estry NHS  N-hydroksy bursztynianimidowe estry
Są najpowszechniej używanymi związkami acylującymi.
Reagenty zawierające NHS reagują z nukleofilami z uwolnieniem grupy NHS i
utworzeniem acylowanego produktu.
Reakcja z grupami SH, OH lub azotem pierścienia imidazolowego prowadzi do
powstania produktów niestabilnych w środowisku wodnym.
Reakcja z pierwszorzędowymi oraz drugorzędowymi aminami daje stabilne
wiązania amidowe lub imidowe.
Stabilność estrów NHS a reaktywność grup aminowych
Półokres trwania estrów NHS wynosi około kilku godzin w pH fizjologicznym w
środowisku wodnym.
ALE  reaktywność amin jest większa w wyższym pH.
W pH zasadowym stabilność estrów znacznie spada : w pH=8.6, 4oC półokres
trwania wynosi zaledwie 10 min.
Aby uzyskać maksymalną wydajność modyfikacji należy używać relatywnie
wysokich stężeń białek.
Imidoestry
Grupa imidoestrowa jest jedną z najbardziej specyficznych grup funkcyjnych
względem pierwszorzędowych amin przeprowadzającą reakcję acylacji. W
przeciwieństwie do innych związków sprzęgających wykazuje jedynie nieznaczne
powinowactwo względem innych grup nukleofilowych w białkach. Optymalne pH
reakcji: 8-9, ale mogą działać w zakresie 7-10.
Powstałe wiązanie jest stabilne w pH kwaśnym; w wysokich wart. pH- cięcie
GRUPY KARBOKSYLOWE
Jest ograniczona ilość związków reaktywnych względem grup karboksylowych, gdyż
grupa karboksylowa jest dość słabym nukleofilem.
Pochodne grup karboksylowych uzyskuje się poprzez odpowiednie aktywowane
związki pośrednie, które reagują z docelowymi grupami funkcyjnym, w wyniku czego
powstają acylowane produkty.
Carbonyldiimidazol (CDI)
CDI reaguje z kwasem karboksylowych w środowisku niewodnym tworząc wysoce
reaktywne N-acyloimidazole. Wydajność tej reakcji jest bardzo wysoka dzięki
uwalnianiu cząsteczki CO2.
Aktywny intermediat może następnie reagować z aminami tworząc wiązanie
amidowe lub grupami hydroksylowymi  wiązania estrowe.
Reakcję tę wykorzystuje się w syntezie peptydów.
CDI funkcjonuje jako związek sieciujący typu  0-length , gdyż w wyniku reakcji
jest uwalniania grupa imidazolowa.
Karbodiimidy
Funkcjonują one jako związki sieciujące typu  0-length . Są zdolne do aktywacji
grup karboksylowych do sprzęgania z grupami aminowymi.
Mogą być wykorzystane do sprzęgania białek lub w syntezie peptydów
Związki specyficzne względem reaktywnych atomów węgla
Wiele związków zawiera miejsca, w których atomy wodoru przy atomie węgla łatwo
mogą zostać zastąpione. Takie atomy wodoru są zwykle związane z układami
aromatycznymi.
Donor elektronu aktywuje pewne miejsce pierścienia i czyni je podatne na reakcje
podstawienia. A
atwo może dojść do ataku elektrofilowego na taki atom węgla, z
wytworzeniem nowego wiązania kowalencyjnego.
Pochodne diazoniowe
W pH=8.0 grupa diazoniowa reaguje głównie z resztami histydyny, atakując azot
pierścienia imidazolowego.
W pH wyższym mogą być modyfikowane łańcuchy boczne tyrozyny.
Uzyskuje się intensywnie zabarwione produkty.
Reakcja jodynacji
Polega na substytucji atomu wodoru w reaktywnych miejscach przez atom
radioaktywnego jodu I125.
Reakcja ta zachodzi w obecności silnego czynnika utleniającego.
WPROWADZANIE GRUP FUNKCYJNYCH DO BIAA
EK
Odczynnik Trauta (2-imidotiolan)
Rozpuszczalny w wodzie.
Reaguje z pierwszorzędowymi aminami w zakresie pH 7 -10.
Przebieg reakcji można śledzić spektrofotometrycznie. 2-imidotiolan absorbuje
światło max = 248 nm. W wyniku reakcji dochodzi do spadku intensywności sygnału.
Odczynnik Trauta jest często wykorzystywany do otrzymywania immunotoksyn.
Białka modyfikowane odczynnikiem Trauta są bardzo podatne na utlenianie i mogą
tworzyć disiarczki.
Dodanie EDTA do stężenia 0.1 M znacznie obniża utlenianie zależne od metali.
Jest grupa związków modyfikujących, które wprowadzają tzw.  chronione grupy
sulfhydrylowe. Zmodyfikowane białko może być dzięki temu przechowywane przez
dłuższy czas. Aktywacja grupy sulhydrylowej zachodzi bez udziału związków
redukujących, co pozwala na zachowanie nienaruszonych natywnych disiarczków w
białku. Jest to istotne zwłaszcza gdy disiarczki są niezbędne do zachowania aktywności
białka (np. niektóre białkowe toksyny).
SATA (N-bursztynoimidylo S-acetylotiootan)
SATA jest często używane do konstrukcji koniugatów przeciwciało-enzym.
Większość przeciwciał poliklonalnych może być modyfikowane SATA (nawet 6
cząsteczek SATA/cząsteczkę przeciwciała) bez widocznego spadku powinowactwa do
antygenu. Niektóre przeciwciała monoklonalne mogą być wrażliwe na modyfikację
SATA.
Często wykorzystuje się SATA do koniugacji z awidyną lub streptawidyną.
Aktywacja grup sulfhydrylowych zachodzi
w obecności nadmiaru hydroksyloaminy
Modyfikacja grup karboksylowych cystaminą
Cystaminajest mała cząsteczką zawierającą disiarczek, zakończoną
pierwszorzędowymi aminami.
Karbodiimid najpierw aktywuje
grupę karboksylową
Białko wyznakowane cystaminą można połączyć z innym białkiem zawierającym grupę
sulfhydrylową w reakcji wymiany disiarczku.
Cystamina może być także wykorzystana do połączenia 2 cząsteczek za pomocą swoich
końcowych reszt aminowych. Środkowy disiarczek jest zachowany  można rozdzielić
cząsteczki związkiem redukującym.
Wprowadzanie grup karboksylowych
Wiele grup funkcyjnych, np. grupy aminowe, sulfhydrylowe, reszty histydyny i
metioniny, może ulec modyfikacji z wytworzeniem grupy karboksylowej.
Wprowadzenie grupy karboksylowej zmienia ładunek netto białka : zmiana pI; często
wiąże się to nawet z utratą aktywności białka.
Bezwodniki kwasów organicznych
Reagują z pierwszorzędowymi aminami, a także z grupami OH seryny i tyrozyny,
grupami SH i pierścieniem imidazolowymreszt His.
Jodooctan
Może reagować z wieloma grupami funkcyjnymi w białku: grupami SH reszt Cys,
azotem pierścienia imidazolowegoreszt His, grupą tioeterowąMet i
pierwszorzędowymi aminami.
Jodooctanz reguły jest używany do blokowania grup reaktywnych.
Wprowadzanie pierwszorzędowych grup
aminowych
W większości przypadków białka zawierają wystarczającą ilość grup aminowych
odpowiednich do reakcji modyfikacji lub sprzęgania. Zdarza się jednak, że pewne
peptydy oraz białka mają zbyt mało wolnych grup aminowych.
Takim przykładem jest peroksydaza chrzanowa (HRP)  tylko 2 wolne grupy aminowe.
Wprowadzenie dodatkowych grup aminowych zwiększa efektywność sprzęgania.
Modyfikacje grup karboksylowych diaminami
Diaminy  związki zawierające pierwszorzędowe grupy aminowe na obu końcach
cząsteczki. W reakcji z grupą karboksylową powstaje wiązanie amidowe, na końcu
 wolna grupa aminowa.
Uwaga! Modyfikacja diaminami maże mieć ogromny wpływ na całkowity ładunek
białka i zmienia pI białka. Może mieć to istotny wpływ na aktywność białka.
Blokowanie grup funkcyjnych
Cele:
1. Ukierunkowanie reakcji koniugacji względem konkretnej grupy funkcyjnej
2. Zapobieganie niekontrolowanej polimeryzacji cząsteczek
3. Zapobieganie utlenienia grup SH
4. Zabezpieczanie grup funkcyjnych podczas reakcji sprzęgania bifunkcjonalnymi
związkami sieciującymi
5. Zakańczanie reakcji sprzęgania lub modyfikacji.
Blokowanie grup aminowych
Octan sulfo-NHS
Wysoka reaktywność względem grup aminowych w pH 7-9. prowadzi do acylacji
amin; reakcja nieodwracalna.
Nie używać w buforach zawierających Tris, glicynę lub imidazol. Zalecane bufory
fosforanowe, boranowe, węglanowe.
Bezwodnik kwasu octowego
Acetylacja grupy aminowej w białku jest relatywnie specyficzna jeżeli jest prowadzona w
nasyconym roztworze octanu sodu. W nadmiarze jonów octanowych pochodne O-
acetylotyrozyny są niestabilne. Pochodne tyrozyny gwałtownie hydrolizują w zasadowym pH,
nawet przy braku jonów octanowych.
Dodanie hydroksyloaminy także powoduje rozpad pochodnych O-acetylotyrozyny.
Blokowanie grup sulfhydrylowych
Są dwa typy związków blokujących: odwracalne i nieodwracalne. Nieodwracalne
prowadzą do wytworzenia wiązania tioeterowego. Odwracalne blokują poprzez
wytworzenie wiązania S-S i mogą być usunięte odpowiednim związkiem
redukującym.
N-etylomaleimid
Związek alkilujący reagujący z grupami SH  powstaje stabilne wiązanie tioeterowe.
Reaguje specyficznie z grupami SH w pH 6.5-7.5
Pochodne jodooctanowe
Jodoacetamid  wykazuje najwyższą reaktywność względem grup SH. Przy właściwie
dobranym stosunku jodoacetamidu względem grup SH i w lekko zasadowym pH,
zachodzi wyłącznie modyfikacja cystein.
Odczynnik Ellmana
Związek odwracalnie blokujący grupy SH.
Blokowanie grup karboksylowych
Związki zawierające grupę aminową, m.in. Tris lub etanoloamina z udziałem
karbodiimidu.
Fotoreaktywne grupy funkcyjne
Fototeaktywna grupa jest stabilna do momentu naświetlenia światłem UV (o
odpowiedniej intensywności).
Pod wpływem UV dochodzi do aktywacji grupy, staje się ona reaktywna względem
grup funkcyjnych w białkach.
Wydajność fotoreaktywnych związków sieciujących nie jest duża, zwykle ok. 10%.
W większości przypadków grupami reaktywnymi są azydki pochodnych fenolowych.
SFAD  zawiera azydek perfluorofenylu, charakteryzujący sie wydajnością ok. 70%.
Przy stosowaniu tych związków należy unikać związków redukujących zawierających
grupy SH, gdyż może dojść do redukcji grupy azydowej do aminowej.
Bufory  nie zawierające amin.
PEROKSYDAZA CHRZANOWA (HRP)
Peroksydazy są enzymami katalizującymi utlenianie różnych substratów.
Optymalna aktywność pH=7.6
Hamowane przez cyjanki, azydki.
ZALETY:
1. wysoka czułość reakcji. Znane jest wiele substratów dla HRP: kolorymetryczne,
fluorescencyjne, chemiluminescencyjne. Enzym charakteryzuje się wysoką liczbą
obrotów.
2. Jest relatywnie niewielkim enzymem (40 kDa), co umożliwia bardzo dobrą
penetrację do komórek
3. Koniugatyprzeciwciał z HRP są lepsze niż IgG-APlub IgG-�-Gal ze względu na
wyższą specyficzną aktywność enzymatyczną (więcej HRP/ mol IgG) i
immunologiczną reaktywność (mniejsza zawada przestrzenna ze względu na
rozmiar HRP).
WADY:
niespecyficzne barwienie spowodowane obecnością komórkowych peroksydaz
wrażliwość na degradację przez mikroorganizmy
wrażliwość na środki antybakteryjne (np. azydek sodowy)
szkodliwość niektórych produktów reakcji (potencjalne mutageny lub
karcinogeny).
�-GALAKTOZYDAZA z Escherichia coli
Hydrolizuje pochodne galaktopiranozydów.
NaCl jest aktywatorem, Mg2+ - kofaktorem enzymu.
Optimum pH 7.0-7.5  dzięki temu nie ma zakłóceń ze strony endogennych �-galaktozydaz,
których optimum pH wynosi 5.5-6.0 (u człowieka) lub niższe.
WADY:
Brak różnorodności substratów.
" Biotynylacja białek i peptydów
Biotyna  mała witamina (244 Da) wykazująca niezwykle mocne oddziaływanie z awidyną,
glikoproteiną występującą m. in. w białku jaja oraz streptawidyną, białkiem ze Streptomyces
avidynii.
Ponieważ biotyna jest relatywnie niedużą cząsteczką, można ją przyłączyć do wielu białek bez
upośledzenia ich funkcji. Do jednej cząsteczki białka można przyłączyć wiele cząsteczek
biotyny, które mogą reagować z awidyną, co znacznie wzmacnia sygnał.
Oddziaływanie biotyna-awidyna jest najsilniejszym znanym oddziaływaniem
niekowalencyjnym między białkiem a ligandem. Zachodzi bardzo szybko.
Oddziaływanie biotyna-awidyna jest odporne na skrajne wartości pH, rozpuszczalniki
organiczne, pewne czynniki denaturujące, np. 3 M GuaCl.
Biotynę można uwolnić traktując 8 M GuaCl w pH=1.5 lub podczas autoklawowania.
Najpowszechniej używanymi odczynnikami do biotynylacji są estry z N-
hydroksybursztynimidem lub N-hydroksysulfobursztynimidem . W większości przypadków
można założyć, że na powierzchni białka są wolne pierwszorzędowe reszty aminowe, nadające
się do biotynylacji.
ALE!
- pierwszorzędowe aminy mogą być bardzo istotne dla aktywności białka! utrata
aktywności
- niektóre przeciwciała zawierają miejsca wiążące antygen, które są bogate w reszty
Lys utrata zdolności wiązania antygenu
W takiej sytuacji należy sprzęgać poprzez inne grupy funkcyjne, np. reszty SH.
Przeciwciała można zredukować w łagodnych warunkach, np. używając 2-
merkaptoetyloaminy. Wtedy ulegają redukcji wiązania S-S w rejonie zawiasowym. Reakcję
przeprowadza się w obecności EDTA, które przeciwdziała utlenianiu zależnemu od jonów
metali. W niektórych przypadkach zalecane jest przedmuchiwanie buforu azotem.
Zaletą sprzęgania poprzez grupy SH jest możliwość bardziej precyzyjnego umiejscowienia
znacznika.
WADY:
Grupy SH rzadko są dostępne, najczęściej są zaangażowane w tworzenie wiązań S-S.
Konieczne jest uprzednie zredukowanie białka, a następnie usunięcie czynnika redukującego
przed reakcją sprzęgania.
W niektórych przypadkach konieczne jest wprowadzenie grupy SH.
Kolejną alternatywą jest sprzęganie poprzez reszty cukrowcowe.
" Zastosowanie systemu biotyna-awidyna, biotyna -streptawidyna
Wiązanie biotyny przez awidynę jest bardzo mocne, ale awidyna wykazuje tendencję do
niespecyficznego wiązania innych związków ze względu na swój wysoki punkt izoelektryczny
(pI=10) oraz zawartość reszt cukrowcowych:
" oddziaływania jonowe,
" oddziaływania z miejscami wiążącymi węglowodany na powierzchni komórek.
Inne białko wykazujące wysokie powinowactwo do biotyny, STREPTAWIDYNA, wykazuje
większą specyficzność względem biotyny;
" punkt izoelektryczny jest w zakresie pH 5-6
" nie jest glikoproteiną
Zarówno awidyna, jak i streptawidyna, mogą zostać przyłączone do innych białek lub mogą
zostać wyznakowane związkami umożliwiającymi detekcję. Wiązanie to nie zakłóca zdolności
do wiązania biotyny.
Często przyłączanymi enzymami są HRP oraz AP ( w technice ELISA, WB)
Inne białka: ferrytyna (barwne), fikobiliproteiny (fluorescencyjne)  w technikach
mikroskopowych w celu zabarwienia i zlokalizowania określonych antygenów lub receptorów
w komórkach lub tkankach.
Częstym zastosowaniem dla systemu biotyna-awidyna są oznaczenia immunologiczne.
1. Specyficzność przeciwciał zapewnia specyficzne rozpoznanie i związanie docelowej
cząsteczki.
2. Jeżeli cząsteczki przeciwciał są wyznakowane cząsteczkami biotyny, zapewnia to
wiele miejsc wiązania dla awidyny lub streptawidyny.
3. Jeżeli awidyna (streptawidyna) jest związana z cząsteczką enzymu, fluoroforu, itd.
powstaje czuły system detekcji.
Najbardziej popularnym znacznikiem jest FLUORESCEINA.
Wydajność kwantowa wolnej fluoresceiny: 0.75
ALE: intensywność fluorescencji spada w pewnych buforach,
po naświetleniu, w pH poniżej 7.0, także często po
sprzężeniu z białkiem.
Mimo to fluoresceina daje wystarczająco dobry sygnał do
detekcji.
" Analogi fluoresceiny
Ze względu na podatność fluoresceiny na photobleaching opracowano fluorofory
charakteryzujące się większą stabilnością, mniejszą zależnością od pH, zachowujące spektralne
własności fluoresceiny.
Są to np. Alexa Fluor 488, BODIPY FL, Oregon Green 488, Oregon Green 514, Rhodamine
Green (Molecular Probes).
" Rodamina
" Texas Red
Jest pochodną rodaminy o nazwie sulforodamina 101
(Texas Red jest nazwą zastrzeżoną dla Molecular Probes).
Wydajność kwantowa Texas Red jest wyższa niż innych
pochodnych rodaminy. Fluorescencja TR jest przesunięta
w stronę światła czerwonego i dzięki temu widma
emisyjne TR i fluoresceiny pokrywają się tylko w mini-
malnym stopniu => doskonała para do podwójnego
barwienia.
" Kumaryna
Pochodne 7-amino-4-metylokumaryny wykazują bardzo dobre właściwości fluorescencyjne.
Pochodna AMCA - 7-amino-4-metylokumaryno-3-octan charakteryzuje się niebieską
fluorescencją: wzbudzenie 345-350 nm; emisja 440-460 nm. Wykazuje dużą stabilność i
odporność na photobleaching. W zakresie pH 3-10 intensywność fluorescencji nie ulega
zmianom.
" Pochodne BODIPY
Jest to relatywnie nowa klasa znaczników fluorescencyjnych
(Molecular Probes) . Cząsteczka podstawowa może być
modyfikowana w pozycjach1,3,5,7 i 8. Modyfikacje te zmieniają własności
spektralne cząsteczki i zapewniają też obecność grup funkcyjnych do sprzęgania.
Związki te charakteryzują się wysokimi wartościami molowego współczynnika absorpcji
i wysoką wydajnością kwantową ( zwykle ok. 0.8); nie są wrażliwe na zmiany pH. Pasmo
emisyjne jest wąskie  dobra detekcja.
WADY: małe wartości przesunięcia Stokesa (10-20 nm) (interferencja wzbudzenia i emisji).
" Pochodne Cascade Blue
Znaczniki fluorescencyjne wykazujące silną fluorescencję w zakresie niebieskim.
Cascade Blue  nazwa zastrzeżona dla Molecular Probes.
Charakteryzuje się wysoką wartością molowego współczynnika absorpcji i dobrą wydajnością
kwantową (ok. 0.54). Jest bardzo dobrze rozpuszczalny w wodzie i jest fotostabilny.
Może być używany z Lucifer Yellow i Texas Red w podwójnym lub potrójnym znakowaniu.
Wzbudzenie: 2 maxima: 375 i 400 nm. Emisja  410 nm.
Cascade blue i Luciffer Yellow mogą być równocześnie wzbudzane swiatłem o długościach fal
krótszych niż 400 nm  detekcja dwukolorowa przy 410 i 530 nm
" Lucifer Yellow
Pochodne tego znacznika są powszechnie używane do cytochemicznego barwienia, zwłaszcza
w neurofizjologii.
Znacznik można wprowadzić do komórek przez szok osmotyczny, mikroiniekcję; reakcje z
białkami mogą zachodzić wewnątrzkomórkowo.
exmax: 426-428 nm; emmax: 530-535 nm; wydajność kwantowa ok 0.25
Koniugaty z Luciffer Yellow są widoczne w żyjącej komórce w stężeniach, które nie
są toksyczne. Koniugaty mogą migrować między komórkami  możliwość obserwacji.
" Lucifer Yellow
Pochodne tego znacznika są powszechnie używane do cytochemicznego barwienia, zwłaszcza
w neurofizjologii.
Znacznik można wprowadzić do komórek przez szok osmotyczny, mikroiniekcję; reakcje z
białkami mogą zachodzić wewnątrzkomórkowo.
exmax: 426-428 nm; emmax: 530-535 nm; wydajność kwantowa ok 0.25
Koniugaty z Luciffer Yellow są widoczne w żyjącej komórce w stężeniach, które nie
są toksyczne. Koniugaty mogą migrować między komórkami  możliwość obserwacji.
" Alexa-fluor
Seria nowych znaczników fluorescencyjnych (Molecular Probes) emitujących w zakresie
widzialnym. Widma absorpcyjne i emisyjne części znaczników Alexa-Fluor pokrywają się z
widmami powszechnie używanych fluoroforów (np. fluoresceiny, tetrametylorodaminy, Texas
Red), ale charakteryzują się fotostabilnością, niską wrażliwością na zmiany pH środowiska,
wysokimi wartościami molowego współczynnika absorpcji. Poza tym są dobrze rozpuszczalne
w wodzie. Koniugaty z Alexa-Fluor także są dobrze rozpuszczalne i nie wykazują tendencji do
agregacji.
" Radioaktywne izotopy
Modyfikacja białka radioaktywnym elementem zapewnia ogromną czułość detekcji.
Najczęściej używanymi izotopami są 14C, 32P, 35S, 3H, 125I i 131I.
Niestabilne izotopy węgla, fosforu, siarki i wodoru są emiterami korpuskularnego
promieniowania �.
Radioaktywne izotopy jodu są emiterami promieniowania ł.
Wysokoenergetyczne promieniowanie ł może być wykrywane bezpośrednio bez potrzeby
stosowania koktajli scyntylacyjnych. Użycie izotopów jodu zapewnia najwyższą czułość
detekcji (wśród wymienianych izotopów).
" Zastosowanie radioaktywnych izotopów jodu
131
I  był to pierwszy izotop jodu stosowany do znakowania cząsteczek biologicznych.
Izotop ten rozpada się, emitując zarówno promieniowanie � jak i ł. Aktywność specyficzna
może sięgać wartości 6550 Ci/mmol => ogromna czułość ALE używanie z
ródła promieniowania
o tak dużej energii stwarza ogromne ryzyko i wymaga bardzo zaawansowanych środków
ochronnych.
125
I  energia emitowana przy rozpadzie wynosi 1/10  1/3 energii izotopu 131. Poza tym
półokres trwania izotopu 125 jest znacznie dłuższy niż 131 (60 dni dla I-125; 8 dni dla I-131).
Wprowadzanie radioaktywnego jodu do cząsteczek białek:
(1) bezpośrednie piętnowanie cząsteczki docelowej przy użyciu czynnika utleniającego
(najczęściej stosowane),
(2) pośrednie piętnowanie poprzez wyznakowanie cząsteczki intermediatu, który
następnie zostaje przyłączony do białka.
Jod w wodzie tworzy reaktywny jon H2OI+, który jest zdolny do modyfikacji łańcuchów
bocznych tyrozyny i grup imidazolowych histydyny. Reakcja ta zachodzi wydajnie w obecności
czynnika utleniającego.
Najczęściej używanymi związkami utleniającymi są :
chloramina T (N-chlorotoluenosulfonamid) lub IODO-GEN (1,2,4,6-tetrachloro-3ą, 6ą 
difenyloglikuryl). W większości przypadków użycie tych związków nie powoduje uszkodzeń
znakowanych białek, ale należy ściśle kontrolować czas reakcji, aby nie dopuścić do
nadmiernego napiętnowania i utlenienia białek.
IODO-GEN (Pierce)
Związek jest nierozpuszczalny w roztworach wodnych, należy go związać z powierzchnią
naczynia do znakowania przed użyciem. W formie związanej może być przechowywany w
desykatorze próżniowym.
Reakcję zatrzymuje się usunięcie fazy wodnej zawierającej znakowane białko. ALE część
odczynnika zawsze może się odkleić od powierzchni naczynia!
W celu bezwzględnego zatrzymania reakcji należy np. przefiltrować mieszaninę reakcyjną na
złożu Sefadex G-25.
Znakowanie dwufunkcyjnych związków sieciujących
Jest grupa związków sieciujących, które zawierają aktywne pierścienie aromatyczne, z
miejscami do jodynacji. Wyznakowane związki sieciujące mogą być użyte do badania
oddziaływań między cząsteczkami biologicznymi.
Przykładem mogą być związki sieciujące umożliwiające tzw. przeniesienie znacznika.
1. Białko, którego partnerów chcemy zidentyfikować, wiążemy ze związkiem
sieciującym, wyznakowanym I-125 i zwierającym disiarczek. Druga grupa
funkcyjna tego związku sieciującego powinna być aktywowana światłem.
2. Wprowadzamy partnera (partnerów) dla testowanego białka, zapewniamy
odpowiednie warunki do oddziaływania.
3. Naświetlamy mieszaninę światłem UV. Aktywowana druga grupa funkcyjna wiąże się z
oddziałującym partnerem.
4. Użycie związku redukującego przetnie związek sieciujący. Pietno znajdzie się przy
partnerze.
Obecnie znane są trzyfunkcyjne związki sieciujące, umożliwiające przyłączenie znacznika
fluorescencyjnego lub biotyny, zamiast wprowadzania znacznika radioaktywnego.
" Inne znaczniki izotopowe
35
S  często używana do znakowania białek przy immunoprecypitacji lub do oznaczania
stabilności białek w żywych komórkach. Wprowadzana do białek podczas translacji w postaci
metiony 32S.
32
P  może być znacznikiem białek ulegających fosforylacji. Donor: znakowane ł-ATP.
" Znakowanie cząsteczkami toksyn
Wiele prowadzonych badań dotyczy specyficznego dostarczania substancji cytotoksycznych
do komórek nowotworowych w celu ich specyficznego zabicia.
Oczekiwanym rezultatem byłoby specyficzne wyeliminowanie komórek nowotworowych, bez
ujemnych skutków chemioterapii.
Do toksyn powszechnie używanych w badaniach należą: rycyna (z Riccinus communis),
abryna (Abrin precatorius), modecyna, gelonina (Gelonium multiflorum), toksyna błonicza
(Corynebacterium dyphtheriae), czynnik z jadu kobry (CVF), restriktocyna (Aspergillus
restrictus), momordyna (Momordica charantia) i inne białka inaktywujące rybosomy (RIPs).
Najpopularniejszymi toksynami używanymi do konstrukcji immunotosyn są: rycyna, abryna,
modecyna i toksyna błonicza. Trzy roślinne toksyny posiadają aktywność lektyn do wiązania
reszt �-galaktozydowych i mogą być hamowane przez cukry: galaktozę i laktozę. Mają bardzo
duże powinowactwo do receptorów cukrowcowych na powierzchni komórek.
Rycyna, abryna i modecyna składają się z 2 podjednostek o bardzo podobnych strukturach i
aktywności.
Podjednostki są połączone mostkiem disiarczkowym, który jest istotny w regulacji
mechanizmu cytotoksyczności.
 A
ańcuch A  efektomer - własności inaktywujące rybosomów.
A
ańcuch B  haptomer - zawiera miejsce wiązania cukru.
Toksyna niezdysocjowana (A-B) wykazuje cytotoksyczny efekt na komórki, ale nie hamuje
aktywności rybosomów w systemach bezkomórkowych.
Toksyna zredukowana (podjednostki A i B są oddzielone) nie wykazuje cytotoksycznego
efektu, ale hamuje aktywność rybosomów w systemach bezkomórkowych.
DLACZEGO?
Cząsteczka toksyny wiąże się poprzez miejsce rozpoznające cukry łańcucha B z odpowiednim
glikolipidem lub glikoproteiną błonową. Po związaniu się z komórką, łańcuch A wnika do
wnętrza komórki na zasadzie transportu aktywnego do pęcherzyków endocytarnych (lub
innym własnym sposobem). We wnętrzu komórki łańcuch A przedostaje się do cytoplazmy i
tam inaktywuje podjednostkę 60S rybosomu. A
ańcuch A działa na zasadzie enzymatycznej  1
cząsteczka może zabić komórkę (1500 rybosomów/min/1 cząst.A)
Toksyna błonicza jest także białkiem dwu-podjednostkowym, ale jest początkowo
syntetyzowana jako pojedynczy polipeptyd. Na skutek modyfikacji potranslacyjnej dochodzi
do przecięcia łańcucha i powstają dwie podjednostki połączone mostkiem disiarczkowym.
A
ańcuch A przeprowadza ADP-rybozylację aminoacylotransferazy II => inaktywacja enzymu.
A
ańcuch B  rozpoznawanie receptora powierzchniowego komórki docelowej.
Praca z tymi toksynami jest BARDZO NIEBEZPIECZNA! Zdarzały sie przypadki
śmiertelne wśród pracowników oczyszczających te trucizny z nasion. Nawet kurz z mielonych
nasion uważany jest za niebezpieczny.
Wszelkie doświadczenia powinny być prowadzone pod wyciągami lub w komorach
laminarnych.
Gelonina zawiera tylko jeden łańcuch polipeptydowy o aktywności hamującej rybosomy. Nie
może sama wnikać do komórki, ale po sprzęgnięciu z łańcuchem B np. rycyny, wykazuje pełną
cytotoksyczność. Podobnie inne toksyny: PAP z nasion Phylotacca americana. Te toksyny o
wiele bezpieczniejsze w użyciu, są stabilne, łatwe do oczyszczania.