ZIARNIAKI GRAM-DODATNIE
Klasyfikacja Gram-dodatnich ziarenkowców:
1. Rodzina: Micrococcaceae
" Rodzaj: Micrococcus, Stomatococcus, Staphylococcus, Planococcus
2. Rodzina: Deinococcaceae (cztery gatunki)
3. Grupa: fakultatywne beztlenowce i mikroaerofile katalazo-ujemne:
" Rodzaj: Streptococcus, Pediococcus, Enterococcus, Aerococcus, Lactococcus, Gemella,
Leucomostoc
4. Grupa ścisłych beztlenowców
" Rodzaj: Peptococcus, Coprococcus, Peptostreptococcus, Sarcina, Ruminococcus
Z klinicznego punktu widzenia z drobnoustrojów tlenowych największe znaczenie mają
rodzaje: Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus.
Rodzaj Staphylococcus
Do rodzaju Staphylococcus należy 31 gatunków i 8 podgatunków, które mogą być podzielone na
dwie podstawowe grupy tj.:
" gronkowce koagulazo-dodatnie: S. aureus, S. intermedius (jak dotąd chorobotwórczy tylko
dla zwierząt, rzadko spotykany u ludzi) i niektóre szczepy S. hyicus
" gronkowce koagulazo-ujemne
Najważniejszy i najbardziej wirulentny gatunek to S. aureus. Liczne zewnątrzkomórkowe substancje
jakie wytwarzają gronkowce złociste hemolizyny, leukocydyna; koagulaza, stafylokinaza,
hialuronidaza, nukleazy, proteazy, lipazy, toksyna epidermolityczna, enterotoksyny, toksyna wstrzÄ…su
toksycznego, toksyna pirogenna) oraz szereg składników ich powierzchni (białko A, otoczka,
peptydoglikan, kwasy tejchojowe) są czynnikami różnorodnej chorobotwórczości tych bakterii.
Gronkowce nie posiadajÄ… jednego wyraz
nie zdefiniowanego czynnika zjadliwości. Za
chorobotwórczość jest odpowiedzialny zespół cech.
Stałą cechą S. aureus jest wytwarzanie koagulazy i ciepłostałej DNAzy, co jest wykorzystane w
diagnostyce tych drobnoustrojów.
Gronkowce koagulazo-ujemne (CNS - ang. Coagulase Negative Staphylococci) stanowiÄ…
komensalną i fizjologiczną florę skóry i błon śluzowych człowieka. Są to drobnoustroje typowo
oportunistyczne - mogą być przyczyna zakażeń jeżeli mechanizmy obronne gospodarza ulegną
osłabieniu lub gdy dostaną się do tkanek. Gatunkiem najczęściej izolowanym z zakażeń jest S.
epidermidis (zakażone zastawki sercowe, różne protezy, cewniki śródnoczyniowe i inne tzw.
biomateriały), S. saprophyticus jest przyczyna infekcji dróg moczowych (dominuje u młodych
kobiet), S. haemolyticus, S. lugdunensis, S. schleiferi mogą wywoływać infekcje zbliżone do infekcji
wywoływanych przez S. epidermidis.
Diagnostyka Staphylococcus sp.
Podłoża:
" agar wzbogacony
" bulion wzbogacony
" podłoże agarowe z krwią (agar wzbogacony krwią baranią) - krwinki są
hemolizowane przez Ä… i ² hemolizyny (obserwacja hemolizy po 24h inkubacji); gronkowce
tworzą kolonie białe, szare lub złocistopomarańczowe, gładkie, okrągłe, wilgotne, kopulaste
" podłoże Chapmana z mannitolem i NaCI (wybiórczo-różnicujące); wysokie stężenie
NaCI (7,5%) jest czynnikiem wybiórczym, który hamuje wzrost większości Gram-
ujemnych i Gram-dodatnich, oprócz gronkowców mogą na tym podłożu wzrastać bakterie
wykazujÄ…ce tolerancjÄ™ na NaCI takie jak Bacillus i Corynebacterium, Micrococcus,
Enterococcus, grzyby drożdżopodobne;
" różnicująca właściwość tego podłoża jest wynikiem obecności mannitolu, niektóre gatunki
gronkowców np. S. aureus fermentują mannitol tworząc żółte kolonie otoczone żółtą
obwódką, drobnoustroje nie fermentujące mannitolu np. S epidermidis w większości
przypadków są małe i otoczone czerwoną lub purpurową obwódką
" podłoże Baird-Parkera (wybiórczo-różnicujące) służy do namnażania szczepów
Staphylococcus aureus szczególnie izolowanych z produktów żywnościowych i leków.
Jest bogate w składniki odżywcze: trzy peptony, glicynę i pirogronian sodu, który pobudza
wzrost szczepów zmienionych podczas produkcji żywności. Wybiórczość podłoża w
stosunku do Staphylococcus aureus zapewnia chlorek litu. Telluryn potasu (czynnik
wybiórczy) ulega redukcji, powodując czarne zabarwienie kolonii. Obecność żółtka jaja
kurzego pozwala wykryć lipazę wytwarzaną przez niektóre szczepy Staphylococcus aureus,
wokół nich pojawia się przejaśnienie a niekiedy drobna precypitacja. Na tym podłożu mogą
się rozwijać również drobnoustroje inne niż gronkowce np. Enterococcus, Listeria,
proteus, Pseudomonas, grzyby drożdżopodobne, lecz żaden z tych drobnoustrojów nie
wytwarza jaśniejszej otoczki
Testy różnicujące gronkowce od innych ziarniaków Gram-dodatnich
" Test na wytwarzanie katalazy - dla odróżnienia od enterokoków, które są katalazo-ujemne.
" w podłożu płynnym do 5ml hodowli bulionowej dodajemy 1ml 3% H2O2. Szczepy
koagulazo (+) powodujÄ… uwolnienie tlenu z H2O2 co objawia siÄ™ burzeniem hodowli.
Oznaczanie kontrolne polega na dodaniu H2O2 do niezaszczepionego podłoża.
" w podłożu stałym: nakropienie na kolonię 3% H2O2. Kontrola - nakropienie samego
podłoża (nie wykonuje się na podłożach z krwią).
" Tolerancja tlenu - posiew na podłoża tlenowe i beztlenowe do odróżnienia od
mikrokoków, które są wyłącznie tlenowe
" Test na oznaczanie zdolności do wykorzystania cukrów z wytworzeniem kwasu w
warunkach tlenowych i beztlenowych - odczyn O-F (oxidatiors-fermentation test).
Wykorzystuje się w tym celu zmodyfikowane podłoże Hugh - Leifsona z glukozą [ inne niż
przy Gram (-)]. Do dwóch probówek z podłożem posiewamy oczko hodowli aż do dna
probówek. Jedną z probówek pokrywamy następnie warstwą jałowej parafiny (w tym
przypadku przed posiewem podłoże należy zregenerować). Inkubacja 5 dni, odczyt
codziennie. Jeśli cukier jest wykorzystywany z wytworzeniem kwasu - następuje
zmiana zabarwienia z ciemno - fioletowego na żółty. Brak zmiany zabarwienia świadczy o
niewykorzystaniu cukru Gronkowce cechują się beztlenowym rozkładem glukozy (zmiana
zabarwienia podłoża na żółte w otwartej i pokrytej parafiną probówce) w odróżnieniu od
mikrokoków, które utleniają glukozę (zmiana zabarwieniapodłoża na żółte w  otwartej"
probówce) lub są asacharolityczne (brak zmiany zabarwienia w obu probówkach).
" Oznaczenie wrażliwości na furazolidon - odróżnienie wrażliwych na furazolidon gronkowców
od opornych mikrokoków. Test wykonuje się metodą dyfuzyjno-krążkową.. Zawiesinę
drobnoustrojów o gęstości 0,5 wg skali MacFarlanda posiewa się wymazówką na podłoże
Mueller-Hintona (grubość 3,5 - 4 mm), nakłada się krążek wysycony furazolidonem,
preinkubacja w temp. pokojowej 15 min, inkubacja w 35-37°C 18-24h.
" Oznaczanie oksydazy cytochromowej. Oksydaza cytochromowa katalizuje w obecności
tlenu utlenianie zredukowanych cytochromów, występuje u drobnoustrojów bezwzględnie
tlenowych np. Micrococcus sp. Wykrywanie oksydazy cytochromowej oparte jest na
zastosowaniu odczynników, które są bezbarwne lecz po utlenieniu staja się barwne.
" Odczynniki: 1-Ä…-naftol (1% r-r w C2H5OH 96 %), 2 - chlorowodorek p-aminodwumetyloaniliny
(1% r-ó w wodzie). Oznaczenie mężna wykonać dodając odczynniki do zawiesiny bakterii
w wodzie lub poprzez naniesienie bakterii z hodowli stałej na krążek bibuły wysycony
odczynnikami. W obecności oksydazy z dodawanych odczynników powstaje błękit
indofenolu, co objawia siÄ™ wystÄ…pieniem intensywnie niebieskiego zabarwienia w ciÄ…gu
30s - 2 min.
Testy różnicujące gronkowce wewnątrzrodzajowo
" Oznaczanie wytwarzania koagulazy - test ten służy do różnicowania S. aureus od innych
gronkowców (poza S. aureus koagulazę wytwarza kilka innych gatunków lecz występują one
głównie u zwierząt). Koagulaza jest to enzym, który ścina osocze. Występuje ona w
dwóch formach. Pierwsza to koagulaza związana dumping factor) - związana ze ścianą
komórkową, wykrywana jest testem szkiełkowym. Koagulaza związana działa
bezpośrednio na fibrynogen tworząc nierozpuszczalny skrzep fibryny (grudki).
Druga forma to wolna koagulaza, która jest wydzielana przez komórki i 'wykrywana
jest w teście probówkowym. Koagulaza zewnątrzkomórkowa reaguje z  coagulase-
reacting factor (CRF) tworząc coagulase-CRF complex, substancje, która jest klinicznie
nie do odróżnienia od trombiny. Ten kompleks następnie działa na fibrynogen i powstaje
nierozpuszczalny skrzep fibryny.
" Test szkiełkowy. Przeprowadza się z zastosowaniem osocza króliczego (odpowiednio
przygotowane z cytrynianem sodu lub preparat gotowy w formie liofilizowanej). Na szkiełku
podstawowym umieścić obok siebie dwie krople roztworu soli fizjologicznej, w obu
kroplach zawiesić badane bakterie (gęstość homogennej zawiesiny powinna w
przybliżeniu odpowiadać wyglądowi mleka - gęsta zawiesina). Do jednej kropli dodać
oczko ezy osocza i delikatnie wymieszać: W ciągu kilkunastu sekund powinny pojawić
siÄ™ wyraz
ne kłaczki - wynik dodatni. Zawiesina bakterii bez dodanego osocza powinna
pozostać homogenna. Pojawienie się kłaczków w zawiesinie bez osocza świadczy o
autoaglutynacji bakterii i nie może być podstawą do przyjęcia wyniku ani dodatniego ani
ujemnego.
" Test probówkowy. Stosuje się osocze królicze (odpowiednio przygotowane z cytrynianem
sodu lub preparat gotowy w formie liofilizowanej). Do 0,5 ml zawiesiny badanych
gronkowców dodać 0,5 ml osocza. W identyczny sposób przygotować kontrole ze
szczepami koagulazo-ujemnym i koagulazo-dodatnim. Inkubować w temp. 37°C. Wynik
testu należy odczytywać po 1, 3 , 6, 24 h. Wynik dodatni -wyraz
ny skrzep.
" Slidex Staph Kit - zestaw do diagnostyki gronkowców in vitro (szybka identyfikacja S.
aureus). Test ten jest połączeniem testu lateksowego z testem hemaglutynacji i służy do
wykrywania obecności czynnika zlepnego (dumping factor), białka A i innych antygenów
swoistych dla S. aureus.
" Odczynniki: R1 - odczynnik przeciw S. aureus (anti S. aureus reagent), krwinki czerwone
uczulone fibrynogenem i lateks uczulony IgG (anti-S. aureus, monoklonalna), mertiolat
sodu, azydek sodu. Odczynnik R2 - odczynnik kontrolny, nieuczulone krwinki czerwone i
nieuczulony lateks, mertiolat sodu, azydek sodu.
" Wymieszać odczynnik testowy R1 i kontrolny R2. Na czyste szkiełko podstawowe
nanieść kroplę odczynnika R1 i R2, do każdej kropli dodać po kilka kolonii bakterii,
wymieszać każdą kroplę (ok. 10 s), poruszać delikatnie ruchem kolistym (ok. 20 s). Wynik
dodatni - aglutynacja w ciÄ…gu 30 s wykazujÄ…ca widoczny zlep uczulonych krwinek
czerwonych i/lub lateksu przy ujemnej kontroli (z odczynnikiem R2). Wynik ujemny -
jednorodna zawiesina zarówno w kropli z odczynnikiem R1 jak i z R2
" Oznaczenie wrażliwości na nowobiocynę. Badanie wykonuje się identycznie jak oznaczanie
wrażliwości na furazolidon.
" Oznaczanie DNAzy.
Mikrotesty - systemy, zestawy
API STAPH jest biochemicznym systemem identyfikacji gronkowców i mikrokoków w oparciu o 19
testów różnicujących (wytwarzanie kwasu z 14 węglowodanów, redukcja azotanów do azotynów,
wytwarzanie fosfatazy zasadowej, wytwarzanie acety-metylo-karbinolu, dihydrolaza argininy,
ureaza). API STAPH składa się z pasków zawierających odwodnione substraty testowe w
pojedynczych probówkach. Substraty rozpuszcza się przez dodanie do każdej mikrobrobówki
zawiesiny testowanego szczepu. Następnie inkubuje się 18 h (w niektórych przypadkach 48h) w
temperaturze 30-37°C. Odczyt i interpretacja zgodnie z informacjami podanymi przez
producenta.
ATB - ID 32 STAPH jest systemem umożliwiającym identyfikację rodzajów Staphylococcus,
Micrococcus, Stomatococcus, Aerocoecus składającym się ze standaryzowanych testów
biochemicznych. Szereg biochemiczny ID 32 STAPH składa się z 32 zagłębień, z których 26 służy
do wykonywania testów, każde zagłębienie zawiera suche substraty. Po 24 h inkubacji zachodzące
reakcje odczytuje siÄ™ w automacie ATB lub wizualnie. IdentyfikacjÄ™ przeprowadza siÄ™ przy
pomocy tabeli identyfikacyjnej, Książki Kodów lub odpowiedniego oprogramowania.
Inne: RAPID ATB STAPH, System SCEPTOR G+, Staph-track, Minitek Gram-Positive System,
Microscan G+ System, Wek GPI card, Auto Microbic System.
Diagnostyka wybranych ziarniaków Gram (+) katalazo(-): Streptococcus sp. i
Enterococcus sp.
Ziarniaki Gram-dodatnie katalazo-ujemne (ZGDKU) występują powszechnie w środowisku
naturalnym (gleba, woda, rośliny, powietrze), w produktach żywnościowych pochodzenia
roślinnego i zwierzęcego. Mogą kolonizować skórę i/lub błony śluzowe człowieka i uczestniczyć w
zakażeniach z różną lokalizacją.
Rosną na podłożach stosowanych w diagnostyce laboratoryjnej. Należą do drobnoustrojów
mezofilnych, optymalna temperatura wzrostu - 30 - 44°C. RosnÄ… w obecnoÅ›ci tlenu, w warunkach
mikroaerofilnych , jak i beztlenowych. Nie wytwarzają przetrwalników, wiele jest opornych na
wysychanie i przeżywają w powietrzu, glebie i innych składnikach środowiska. W preparatach
barwionych układają się w dwoinki, tetrady, łańcuszki, mogą występować także pojedynczo lub
tworzyć nieregularne skupiska.
Do ziarniaków Gram-dodatnich katalazo-ujemnych zaliczamy następujące rodzaje:
" Streptococcus - mikroflora górnych dróg oddechowych; duże znaczenie kliniczne
" Enterococcus - mikroflora przewodu pokarmowego; duże znaczenie kliniczne
" Gemella - mikroflora górnych dróg oddechowych; rzadko izolowane z materiałów klinicznych
" Aerococcus - środowisko naturalne, produkty zwierzęce; rzadko izolowane z materiałów
klinicznych
" Leuconostoc - środowisko naturalne, znaczenie w przemyśle mleczarskim, przy produkcji
marynat, win; rzadko izolowane z materiałów klinicznych
" Pediococcus - środowisko naturalne, wykorzystywane w przemyśle browarniczym" i
spożywczym (piwo, wino, sery, kiełbasy, produkty warzywne); bakterie kwasu
mlekowego; rzadko izolowane z materiałów klinicznych
" Lactococcus - występują w żywności, przewodzie pokarmowym u ludzi, wykorzystywane
w przemyśle spożywczym; bakterie kwasu mlekowego; rzadko izolowane z materiałów
klinicznych.
ZGDKU charakteryzują się zróżnicowaną wrażliwością na antybiotyki. Wszystkie są naturalnie
oporne na amidynopenicyliny, monobaktamy i stare chinolony. Bakterie z rodzaju Streptococcus sÄ…
naturalnie oporne na aminoglikozydy, z rodzaju Enterococcus sÄ… naturalnie oporne na
aminoglikozydy, penicyliny, cefalosporyny, polimyksyny, linkozamidy. Pediococcus i Leuconostoc
wykazują naturalną oporność wysokiego stopnia na wankomycynę.Naturalna zmniejszona
wrażliwość na penicyliny występuje wśród ziarniaków z rodzajów Lactococcus, Leuconostoc i
Aerococcus.
W diagnostyce ZGDKU wykorzystuje się następujące cechy:
" zdolność do wytwarzania hemolizy na podłożu agarowym z dodatkiem 5% krwi baraniej;
hemoliza beta - całkowita - całkowity rozkład krwinek czerwonych, strefa hemolozy
wyraz
nie odgraniczona od reszty niezhemolizowanego podłoża, wielkość strefy często
przekracza parokrotnie średnicę kolonii, alfa -częściowa - częściowe rozpuszczenie
krwinek, zazielenienie podłoża, niewielka przejrzystość, wielkość strefy hemolizy alfa jest
zwykle mniejsza niż hemolizy beta, gamma - brak hemolizy
" wzrost w 45°C
" wzrost w bulionie z 6,5% NaCI
" wzrost w bulionie o pH 9,6
" hydroliza L-pirrolidonyl - beta- naftylamidu przez aminopeptydazÄ™ pyrplidonylowÄ… (PYR) w
wyniku czego powstaje naftylamid czerwonego koloru po dodaniu 0,01% odczynnika
clnnamaldehydu
" hydroliza eskuliny - w wyniku rozkładu powstaje dekstroza i eskuletina, która reaguje z
cytrynianem żelaza dając brązowo-brunatny produkt
" rozpuszczalność w żółci (identyfikacja S. pneumoniae) - sole żółci uczynniają enzymy
autolityczne poprzez działanie na powierzchnię komórki w wyniku czego następuje liza
komórki
" zdolność wzrostu w obecności żółci
" test CAMP (identyfikacja Streptococcus gr. 6) - czynnik CAMP (Co-cytolizyna B) jest
ciepłostałą wydzielaną zewnątrzkomórkowo proteiną, która działa synergistycznie z
toksyną beta gronkowców. Po posiewie na podłożu z krwią S. agalactiae i prostopadle
do niego S. aureus wytwarzającego beta- hemolizynę wystąpi charakterystyczny trójkąt
hemolizy
" wrażliwość na bacytracynę (identyfikacja S. pyogeneś) - krążee" wysycony bacytracyną
(substancja o działaniu przeciwdrobnoustrojowym produkowana przez bakterie Gram-
dodatnie) w stężeniu 0,04 j
" wrażliwość na optochinę (identyfikacją S. pneumoniae) - krążek wysycony optochiną w
stężeniu 5 źg
" obecność antygenu grupowego (wielocukru C) - po ekstrakcji enzymatycznej antygeny
polisacharydowe znajdujące się w ścianie komórkowej paciorkowca uwidaczniają się w
reakcji aglutynacji czÄ…steczek lateksu uczulonych swoistymi, grupowymi immunoglobulinami
króliczymi
Rodzaj Streptococcus
Rodzaj Streptococcus skupia liczne gatunki charakteryzujące się odmiennymi właściwościami
fenotypowymi i
genotypowymi oraz różną chorobotwórczością.
Według ostatniej klasyfikacji dzielony jest na sześć grup filogenetycznych (I-VI) na podstawie
różnic w sekwencji podjednostki 16S rRNA.
Na przestrzeni lat wprowadzano różne schematy klasyfikacyjne streptokoków.
1. Podział uwzględniający typy hemolizy na podłożu agarowym z 5% krwią baranią:
" paciorkowce beta-hemolizujące - wytwarzające hemolizyny, które całkowicie rozkładają
krwini czerwone
" paciorkowce alfa-hemolizujące - wytwarzające hemolizyny, które częściowo rozkładają
krwini czerwone
" paciorkowce niehemolizujÄ…ce (gamma-hemolizujÄ…ce) - nie wytwarzajÄ…ce hemolizyn
2. Klasyczny podział na grupy serologiczne wg Rebeki Lancefield (1933)
Podział ten uwzględnia różnice węglowodanów (immunologicznie czynny wielocukier C)
wchodzących w skład ściany komórkowej. Grupy serologiczne oznaczone są dużymi literami
alfabetu od A do W. Jest szczególnie przydatny dla klasyfikacji paciorkowców beta-
hemolizujÄ…cych.
3. Podział praktyczny
" paciorkowce ropotwórcze
o Grupa A - Streptococcus pyogeneś. Na podłożu z krwią wywołują hemolizę typu beta
o Grupa B - Streptococcus agalactiae. Na podłożu z krwią wywołują hemolizę typu
beta, mogą też występować szczepy o typie hemolizy alfa lub gamma
o Grupa C - S. equi; ssp. equi (hemoliza beta;, S. equi ssp zooepidermicus
(hemoliza beta), S. equisimilis (hemoliza beta). S. dysgalactiae (hemoliza alfa).
o Streptococcus pneumoniae (hemoliza alfa). Szczepy tego rodzaju nie maja
antygenu grupowego (wielocukru C)
" paciorkowce jamy ustnej (do niedawna nazywane  grupa viridans" - zieleniÄ…ce)
o Grupa S. mutans (hemoliza gamma)
o Grupa S. salivarius (hemoliza gamma)
o Streptococcus bovis (hemoliza gamma; grupa serologiczna D)
o Grupa S. milleriQub S. anginosus); (hemoliza gamma, alfa, beta; grupa serologiczna
A, C, F, G)
o Grupa S. sanguis (lub S. oralis); (hemoliza alfa; grupa serologiczna H, W)
o Streptococcus mitis (hemoliza alfa; grupa serologiczna O - biołyp 1 oraz K - biotyp 2)
o inne - S. acidominimus, S. uberis
" paciorkowce wybredne (wymagają do wzrostu witaminy B6 lub innych związków
np.: L-cysteiny, glutationu, tioglikolanu) - S. defektivus, S. adjacens
Podłoża
Paciorkowce należą do drobnoustrojów wybrednych. Rosną słabo lub nie rosną na podłożach
zwykłych. Rosną dobrze na podłożach wzbogaconych takich jak: podłoże tryptozowo sojowe (TSA),
wyciąg mózgowo sercowy (BHI), bulion Todd-Hewitfa, Columbia agar/bulion z dodatkim krwi
lub surowicy, agar wzbogacony z dodatkiem krwi, bulion cukrowy. Podłoża wybiórcze:
" agar z krwiÄ… i z fioletem krystalicznym; fiolet krystaliczny powoduje zahamowanie
wzrostu innych niż paciorkowce drobnoustrojów
" podłoża wybiórcze dla S. pyogenes - z dodatkiem neomycyny, trimetoprimu i
sulfametoksazolu (STX), kolistyny - dodanie antybiotyków hamuje wzrost innych niż S.
pyogenes drobnoustrojów występujących w górnych drogach oddechowych
Charakterystyka
Paciorkowce to Gram-dodatnie bakterie kształtu kulistego lub owalnego, w preparacie układają się
w pary lub tworzą łańcuszki. Nie wytwarzają przetrwalników i poza nielicznymi wyjątkami nie
wykazują ruchu. Fermentują glukozę do kwasu mlekowego. Są tlenowcami lub względnymi
beztlenowcami. Na podłożu agarowym z krwią tworzą kolonie małe (0,5 - 1 mm), najczęściej
wypukłe, gładkie, błyszczące, matowe lub śluzowe, często otoczone strefą hemolizy. Jednakże
morfologia kolonii paciorkowców jest różnorodna. S. pyogenes tworzy kolonie małe, przez
roczyste,
otoczone relatywnie dużą strefą beta-hemolizy. Kolonie S. agalactiae są większe, bardziej płaskie,
kremowe, śluzowe i otoczone mniejszą strefą hemolizy, często możliwą do zaobserwowania po
usunięciu kolonii. Kolonie S. pneumoniae są początkowo wypukłe, starsze kolonie mają wklęsły
środek powstający na skutek działania enzymów autolitycznych, strefa hemolizy alfa przybiera
zabarwienie brązowo-zielone. Paciorkowce grupy  viridans" tworzą kolonie małe, opalizujące,
otoczone wyraz
nÄ… strefÄ… hemolizy alfa o zabarwieniu zielonym.
Diagnostyka paciorkowców oparta jest na ustaleniu typu hemolizy. Identyfikacja paciorkowców
beta-hemolizujących polega na przeprowadzeniu testów serologicznych i klasyfikacji do grup
A, B, C, D, F, G. Paciorkowce alfa lub gamma-hemolizujÄ…ce identyfikuje siÄ™ surowicami anty
D i anty B. W celu dalszej identyfikacji przeprowadza siÄ™ testy fizjologiczne i biochemiczne.
Najczęściej wykonywane testy przedstawiono w poniższych tabelach.
W diagnostyce paciorkowców wykorzystywane są również zestawy komercyjne oparte na testach
biochemicznych np.: test API 20S (test 24 godzinny), Rapid STR (test 4 godzinny). Do wykazania
obecności paciorkowców (ich antygenów) bezpośrednio w materiale badanym wykorzystuje się
lateksowe testy aglutynacyjne ( S. pyogenes, S. agalactiae, Grupa C paciorkowców, S.
pneumoniae), test koaglutynacji (S. pyogenes) oraz testy immunoenzymatyczne (S. pyogenes, S.
agalactiae).
Identyfikacja paciorkowców hemolizujących grup A-G - Slidex Strepto-kit
Po ekstrakcji enzymatycznej antygeny polisacharydowi znajdujące się w ścianie paciorkowca
uwidaczniajÄ… siÄ™ w reakcji aglutynacji czÄ…stek lateksu uczulonych swoistymi grupowymi
immunoglobulinami króliczymi.
Wykonanie:
2-3 kolonie zawiesić w 0,4 ml enzymu ekstrahujÄ…cego w temp. 37°C przez 10-15 minut. Po jednej
kropli lateksu nanieś na pola dodać 1 kroplę przygotowanej zawiesiny. Wymieszać patyczkiem.
Wynik dodatni aglutynacja w ciÄ…gu 2 minut.
Antybiogram według wytycznych NCCLS
Test Camp:
Na płytce z podłożem Agar Columbia z 5% krwią baranią posiewamy pionowo S. aureus (musi
dawać hemolizę) poziomo posiewamy S. pyogenes. Obserwujemy wzmożoną hemolizę.
Różnicowanie paciorkowców beta-hemolizujących
Drobnoustrój Test CAMP PYR
Wrażliwość na Wrażliwość Antygen
bacytracynÄ™ naSTX grupowy
S. pyogenes wrażliwy oporny A - -
S. agalactiae oporny oporny B -
+
Różnicowanie S. pneumoniae i grupy  viridans"
Drobnoustrój Wrażliwość na optochinę Rozpuszczalność w żółci
S. pneumoniae wrażliwy +
Grupa  viridans" oporne -
Rodzaj Enterococcus
Do lat osiemdziesiątych enterokoki zaliczano do grupy D paciorkowców. Inne paciorkowce
należące do grupy D określano jako  nonenterococci" (S. bovis, S. equinuś). Przyczyną podziału
paciorkowców grupy D na dwie Kategorie była przede wszystkim ich różnica we wrażliwości na
antybiotyki betalaktamowe (enterokoki wykazują wyższe wartości MIC). W połowie lat
osiemdziesiątych na podstawie badań genetycznych utworzono nowy rodzaj Enterococcus.
Aktualnie do rodzaju Enterococcus należy ponad 20 gatunków, z których u ludzi wykazano co
najmniej 10. Najczęściej izolowanym gatunkiem jest E. faecalis (>95% izolatów), drugim co do
częstości występowania jest E. faecium. Do rzadko izolowanych od ludzi należą następujące
gatunki: E. avium, E. durans, E. gallinarum, E. hirae, E. raffinosus, E. casseliflavus, E. flavescens, E.
dispar.
Charakterystyka
Do rodzaju Enterococcus należą ziarniaki Gram-dodatnie, katalazo-ujemne. W preparatach
barwionych komórki układają się w pary lub łańcuszki. Są względnymi beztlenowcami. Rosną na
podłożach zwykłych. Na podłożu agarowym z krwią powoduję hemolizę alfa, niektóre szczepy
mogą wytwarzać hemolizę gamma lub beta. Wywołują one u ludzi zakażenia przewodu
moczowego, szczególnie dotyczy to pacjentów hospitalizowanych, zakażenia ran i tkanek
miękkich, zakażenia wewnątrzbrzuszne, zakażenia w obrębie miednicy, zapalenie wsierdzia,
opon mózgowo-rdzeniowych, zakażenia wszczepów i protez.
Podłoża
Do hodowli drobnoustrojów z rodzaju Enterococcus stosowane są podłoża:
" agar wzbogacony z dodatkiem 5% krwi baraniej
" podłoże tryptozowo sojowe
" wyciąg mózgowo sercowy
" D-Coccosel agar - podłoże wybiórcze dla mikroorganizmów rosnących w obecności
żółci (czynnik wybiórczy). Na tym podłożu może rosnąć większość pałeczek Gram-
ujemnych, Staphylococcus sp, grupa D Streptococcus i Enterococcus sp. lecz jedynie
grupa D Streptococcus i Enterococcus sp hydrolizują eskuiinę (czynnik różnicujący) do
eskuletiny, która reaguje z zawartym w podłożu cytrynianem żelazowo-amcnowym dając
brÄ…zowo-czamy produkt
Identyfikacia enterokokow do rodzaju uwzględnia następujące cechy:
" wygląd kolonii i rodzaj hemolizy na podłożu agarowym z krwią baranią
" wygląd drobnoustrojów w preparacie barwionym metodą Grama
" wytwarzanie katalazy wzrost w bulionie z 6,5% NaCI
" wzrost w podłożu płynnym o pH 9,6
" wzrost w 45°C wzrost na podÅ‚ożu z żółciÄ… hydroliza eskuliny
" hydroliza L-pyrrolidonyl-beta-naftylamidu (PYR)
" przynależność do grupy serelogicznej D
W celu identyfikacji enterokokow do gatunku wykorzystuje się następujące cechy:
" fermentacja cukrów i alkoholi (mannitol, sorbitol, sorboza, arabinoza, rafinoza, sacharoza,
laktoza)
" hydroliza argininy
" tolerancja tellurynu potasu (0,04% w podłożu stałym)
" wykorzystanie pirogronianu
" ruch
" wytwarzanie barwnika
" wzrost w 10°C
Do identyfikacji bakterii z rodzaju Enterococcus stosowane sÄ… biochemiczne testy komercyjne
wykorzystywane w diagnostyce paciorkowców.
Różnicowanie Enterococcus spp. i paciorkowców grupy D
Testy Enterococcus spp. Paciorkowce grupy D
Wzrost w bulionie z 6,5% NaCI
+ -
Wzrost w podłożu płynnym o pH 9,6
+ -
Hydroliza eskuliny
+ +
Wzrost na podłożu z żółcią
+ +
Hydroliza L-pyrrolidonyl-beta-naftylamidu (PYR)
+ -
Antygen grupowy
D D
Typ hemolizy alfa, beta, gamma alfa, gamma