ENZYMOLOGIA

wykład 3

04.03.2009r.

3. Hydrolazy

Enzymy katalizujące reakcje hydrolizy, czyli rozkładu wiązań z udziałem cząsteczki wody.

Jest to jedyna klasa enzymów, która nie wymaga obecności koenzymów.

W zależności od rodzaju aktywowanych wiązań rozróżniamy hydrolazy m.in.:

• rozkładające wiązania estrowe - esterazy:

• lipazy (hydrolazy estrów karboksylowych),

• fosfatazy (hydrolazy monoestrów fosforanowych)

• hydrolizujące wiązania glikozydowe - glikozydazy (np. amylazy, celulaza)

• hydrolizujące wiązania peptydowe - peptydazy (np. trypsyna, pepsyna, chymotrypsyna)

• rozkładające wiązanie C-N inne niż peptydowe, np. w amidach - amidohydrolazy

PRZYKŁAD:

galaktohydrolaza β-D-galaktozydu - nazwa systematyczna

β-D-galaktozydaza, laktaza - nazwa potoczna

EC 3. 2. 1. 23. - numer klasyfikacyjny

kolejność w podklasie

hydrolizowane wiązanie dokładniej: 0- lub S-glikozydowe

hydrolizowane wiązanie: wiązanie glikozydowe

klasa enzymu

• produkcja mleka przy nietolerancji laktozy, hydroliza laktozy do glukozy i galaktozy

• polepsza rozpuszczalność, zmniejsza koncentrację sacharydów w produktach koncentratów z mleka i serwatki (łatwa produkcja lodów, deserów)

• glukoza słodsza od laktozy

• rozkład glukozy przyspiesza fermentację mleka w technologii napojów fermentowanych, twarogów, serów

PRZYKŁAD:

inwertaza (sacharaza, β-fruktofuranozydaza

hydrolizuje wiązanie α-1,4-glikozydowe i powstaje α-D-glukoza i β-D-fruktoza

• produkcja miodu sztucznego, cukru inwertowanego

• otrzymywanie fruktozy

Fruktoza:

• najlepiej rozpuszczalna w wodzie - słodzenie soków (nie krystalizuje w czasie przechowywania)

• higroskopijna - zapobiega utracie wilgoci z żywności, np. owoce kandyzowane

• syropy fruktozowe (dla diabetyków)

3. Liazy

Enzymy katalizujące odwracalne lub nieodwracalne rozerwanie różnych wiązań bez udziału wody, przy czym z substratu, na który działa enzym, odłączane są pewne grupy (np. CO₂, H₂O, NH₃, aldehydy).

Ze względu na rodzaj rozszczepianych wiązań wyróżniamy m.in. liazy:

• rozrywające wiązanie C-C - dekarboksylazy - uwalniają CO₂ z substratów

- aldolazy - uwalniają aldehydy z substratu

• działające na wiązanie C-O - dehydratazy - odłączają cząsteczkę wody

- hydratazy - przyłączają i odłączają cząsteczkę wody

• rozszczepiające wiązanie C-N - deaminazy - odłączają NH₃

Do klasy tej należą SYNTAZY, które nie wymagają nakładu energii do syntezy wiązań.

PRZYKŁAD:

karboksyliaza 2-oksokwasów

dekarboksylaza pirogronianowa

EC 4. 1. 1. 1. - numer klasyfikacyjny

kolejność w podklasie

odszczepiana grupa: grupa COO^-

rozszczepiane wiązanie: wiązanie C-C

klasa enzymu

3. Izomerazy

Klasa enzymów katalizujących przekształcenia wewnątrzcząsteczkowe. Może to być przegrupowanie atomów bądź grup. Skład chemiczny związku nie ulega zmianie.

Należą tutaj enzymy katalizujące różne reakcje izomeryzacji, m.in.:

• racemazy i epimerazy - odpowiedzialne za zmianę konfiguracji przy węglu asymetrycznym (wzajemne przekształcenia konfiguracji L i D lub formy α i β)

• mutazy - odpowiedzialne za przemieszczenie grup wewnątrz cząsteczki

• izomerazy cis-trans - izomeria geometryczna (cis-trans)

• izomerazy odpowiedzialne za wewnątrzcząsteczkowe przemiany oksydoredukcyjne (przesunięcie atomów H⁺)

PRZYKŁAD:

ketolo-izomeraza D-ksylozy

izomeraza ksylozowa (glukozowa)

EC 5. 3. 1. 5. - numer klasyfikacyjny

kolejność w podpodklasie

dokładniej przekształcenie: przemiana aldoza - ketoza

typ przekształcenia: przegrupowanie atomów H

klasa enzymu

3. Ligazy, zwane potocznie syntetazami

Są to enzymy katalizujące syntezę - powstanie nowych wiązań: C-O, C-S, C-N, C-C.

Wszystkie reakcje katalizowane przez ligazy zachodzą z udziałem ATP lub innego związku makroergicznego.

Syntetazy katalizujące dołączenie do substratu CO₂ - nazywamy potocznie karboksylazami.

PRZYKŁAD:

ligaza octan: CoA (AMP)

syntetaza acetylo-CoA

EC 6. 2. 1. 1. - numer klasyfikacyjny

kolejność w podklasie

substraty syntezy: kwas - tiol

powstające wiązanie: C-S

klasa enzymu

KINETYKA REAKCJI ENZYMÓW

Kinetyka - badanie szybkości, z jaką przebiega reakcja oraz czynników wpływających na tą czynność reakcji. Nie zajmuje się naturą chemiczną zmian.

Kinetyczny opis aktywności enzymów jest konieczny do zrozumienia działania enzymów.

Powtórzyć z biochemii:

Czynniki:

• stężenie enzymów i substratu

• występowanie i stężenie kofaktorów, inhibitorów i aktywatorów

• temperatura

• stężenie H⁺ (pH)

(oddziaływania allosteryczne, modyfikacje kowalencyjne, aktywacja proteolityczna)

Wpływ stężenia enzymu na szybkość reakcji enzymatycznej

Oznaczanie aktywności enzymatycznej wykonuje się na początku reakcji enzymatycznej, ponieważ może dojść do:

• hamowania aktywności enzymatycznej produktem na drodze hamowania zwrotnego,

• denaturacji białka enzymatycznego.

Wpływ temperatury

Działa na cząsteczki S i E.

↑ temp. => ↑ En. kinetycznej cz. S

Cząsteczki substratu szybciej się poruszają, zderzają się częściej, więcej z nich może osiągnąć stan przejściowy.

W pewnym momencie osiągnięta zostaje temp. optymalna dla działania enzymu.

Temperatura optymalna - temperatura, przy której szybkość reakcji enzymatycznej biegnie z maksymalną szybkością, a nie ma miejsca jeszcze denaturacja białka enzymatycznego.

Zbyt wysoka temperatura powoduje drgania w cząsteczkach enzymu i dochodzi do rozerwania wiązań w enzymie.

Reguła van Hoffa

Wzrost temperatury o 10°C powoduje:

• 2-3-krotny wzrost szybkości reakcji nieenzymatycznej

• 1-2-krotny wzrost szybkości reakcji enzymatycznej

„Optimum temperatury” zależy od czasu przyjętego do obliczenia szybkości reakcji.

Termostabilność enzymu możemy określić podając najwyższą temperaturę, w której jeszcze nie dochodzi do termicznej inaktywacji enzymu.

Badanie wpływu temperatury na aktywność enzymu:

• przygotowuje się mieszaninę reakcyjną S + E, pH, bufor; mieszaninę przenosi się do określonej temperatury i reakcja enzymatyczna zachodzi właśnie w takiej określonej temperaturze, następnie zatrzymujemy reakcję i mierzymy szybkość reakcji enzymatycznej.

Badanie termostabilności białka:

• Badanie temperatury, w której enzym zachowuje aktywność.

• Białko enzymatyczne poddaje się traktowaniu różnymi temperaturami - badamy, jak ten enzym zachowuje się w różnych temperaturach.

• Białko enzymatyczne przenosi się do temperatury optymalnej i dodaje pozostałe składniki reakcyjne.

• Reakcja enzymatyczna biegnie w temperaturze optymalnej.

„Optimum temperatury” zależy od czasu przyjętego do obliczenia szybkości reakcji.

Wpływ pH

pH środowiska wpływa na:

wiązanie substratu przez E, aktywność katalityczną E, stan jonizacji substratu, zmiany w strukturze przestrzennej E.

pH wpływa na stopień zdysocjowania (uprotonowania):

• grup funkcyjnych centrum aktywnego,

• grup funkcyjnych, które uczestniczą w katalizie,

• grup funkcyjnych substratu, które uczestniczą w wiązaniu do enzymu,

• grup funkcyjnych leżących w pobliżu centrum aktywnego, które decydują o konformacji tego centrum aktywnego.

Optymalne pH działania - wartość pH, przy której szybkość katalizowanej reakcji jest maksymalna.

Krzywe zależności v/pH mogą być też prostolinijne.

Niewielkie odchylenie pH od wartości optymalnych powoduje nagły spadek szybkości reakcji enzymatycznej.

Krzywe zależności między pH a aktywnością enzymów

Krzywe zależności v/pH mogą też być prostolinijne

Gdy wartość pH znacznie różni się od optymalnego może dojść do denaturacji białka enzymatycznego.

Wpływ pH na szybkość reakcji enzymatycznej

Obie grupy muszą mieć ładunek - wtedy dochodzi do aktywacji enzymu!!!

Hiperboliczna krzywa wysycenia enzymu substratem

a - kinetyka reakcji I rzędu (linia prosta - zależność wprost proporcjonalna pomiędzy badanymi czynnikami)

b - kinetyka mieszana zależność nieproporcjonalna

c - kinetyka reakcji zerowego rzędu (szybkość reakcji osiąga Vmax - reakcja przebiega zgodnie z kinetyką zerowego rzędu)

V_o - początkowa szybkość reakcji enzymatycznej

[So] - początkowe stężenie substratu w czasie zerowym

Vmax - szybkość katalizy przy pełnym wysyceniu enzymu substratem

Km - charakteryzuje daną aktywność enzymu

- jest to takie stężenie substratu [mol/l], przy którym reakcja biegnie z szybkością równą połowie szybkości maksymalnej

- jest to takie stężenie substratu, przy którym połowa miejsc aktywnych jest obsadzona substratem

- dla większości enzymów wartości leżą w przedziale od 10^-1 do 10^-7 M

Vmax zależne od aktualnego stężenia enzymu.

V_o - określa szybkość tworzenia produktu lub też ubytku substratu we wczesnym etapie reakcji, gdy stężenie substratu nie uległo zmianie i jest równe stężeniu początkowemu

1. znane jest stężenie substratu

2. unika się błędów spowodowanych postępującą inaktywacją enzymu

3. nie trzeba uwzględniać zjawiska inhibicji

4. nie trzeba brać pod uwagę wpływu reakcji odwracalnej

Podczas oznaczania aktywności enzymatycznej prowadzimy reakcję zerowego rzędu.

KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNEJ 1 SUBSTRATOWEJ NIEODWRACALNEJ - model Michaelisa-Menten uzupełniony przez Briggsa-Hildane'a

ZAŁOŻENIA:

1. konieczność utworzenia odwracalnego kompleksu ES, który może dysocjować z powrotem do E i S lub przekształcić się w P, P nie może przekształcić się w S

k₁, k₂, k₃ - stałe szybkości poszczególnych reakcji

ES = k₁[E][S] - szybkość tworzenia kompleksu ES

ES = (k₂ + k₃)[ES] - szybkość rozpadu kompleksu ES

2. założenie ustalającego się po kilku milisekundach stanu stacjonarnego -> stężenie [ES] jest niezmienne

k₁[E][S] = k₂[ES] + k₃[ES] = [ES](k₂ +k₃)

K_m - stała Michaelisa

Ks - stała dysocjacji kompleksu ES do E i S

- właściwa miara siły tworzenia kompleksu ES, czyli powinowactwa enzymu do substratu

Ks - miara powinowactwa E do S, ale tylko w pewnych warunkach (tylko wtedy, kiedy k₂ > k₃)
= k₂/k₁ = Ks

Równanie Michaelisa-Menten opisuje zależność początkowej szybkości reakcji w stanie stacjonarnym od początkowego stężenia substratu

V_o - początkowa szybkość reakcji enzymatycznej

V_max - szybkość maksymalna reakcji

[S_o] - początkowe stężenie substratu

K_m - stała Michaelita-Menten

Vmax i Km to podstawowe parametry

Wpływ stężenia substratu na szybkość reakcji enzymatycznej

Jeżeli Km jest wysoka to powinowactwo S do E jest niskie!!!

INHIBICJA AKTYWNOŚCI ENZYMÓW umożliwia:

• identyfikację reszt istotnych dla aktywności enzymów

• poznanie mechanizmów działania enzymów

• działanie leków i czynników toksycznych

• mechanizm kontroli aktywności enzymów

PODZIAŁ INHIBICJI

1. Nieodwracalna

2. Odwracalna - kompetycyjna

- niekompetycyjna

- akompetycyjna

- mieszana

1. INHIBICJA KOMPETYCYJNA (WSPÓŁZAWODNICZĄCA)

• inhibitor kompetycyjny zmniejsza szybkość katalizy enzymatycznej przez zmniejszenie liczby cząsteczek enzymu wiążących substrat,

• inhibicję kompetycyjną można znieść przez zwiększenie stężenia substratu

• V_max nie ulega zmianie, zwiększa się K_m

PRZYKŁADY:

1. działanie malonianu na dehydrogenazę bursztynianową

COOH COOH

CH₂ CH₂

CH₂ COOH

COOH

bursztynian malonian (inhibitor kompetycyjny)

Przykład ten jest wyjątkowym przypadkiem. Inne przypadki inhibitorów konkurencyjnych wykazują zazwyczaj mieszane działanie, inhibitora konkurencyjnego i akompetycyjnego.

2. hamowanie syntezy białka przez analogi aminokwasów białkowych (aminokwasy niebiałkowe), np. niektóre leki, niektóre pestycydy, antybiotyki

3. hamowanie oksydazy polifenolowej przez kwas para-hydroksybenzoesowy (brązowienie warzyw i owoców)

Wykres Michaelisa-Menten

2. INHIBICJA NIEKOMPETYCYJNA (NIEWSPÓŁZAWODNICZĄCA)

INHIBITOR NIEKOMPETYCYJNY

• wiąże się w miejscu katalitycznym (nie w miejscu wiązania substratu) lub poza nim, wywołując zmiany konformacyjne niekorzystne dla miejsca katalitycznego

• inhibitor nie jest strukturalnie podobny do substratu, nie może wiązać się w miejscu wiązania substratu, tylko w miejscu katalitycznym lub poza nim => obniża szybkość maksymalną katalizy

• zmniejsza szybkość katalizy enzymatycznej poprzez zmniejszenie liczby obrotów enzymu (obniża stężenie funkcjonalnego enzymu, pozostała część funkcjonalnego enzymu zachowuje się jak bardziej rozcieńczony roztwór enzymu)

• inhibitor niekompetycyjny nie wpływa na przyłączanie substratu do enzymu - nie wpływa na powinowactwo E do S

• nie zmienia K_m, obniża V_max

Nie można znieść inhibicji niekompetycyjnej zwiększając stężenie substratu, lecz poprzez związanie inhibitora przez inny związek

PRZYKŁADY:

1. działanie jonów metali ciężkich, np. Cu²⁺, Hg²⁺, Ag²⁺, które wiążą się z gr. -SH cysteiny w miejscu katalitycznym lub poza nim (tworzą się merkaptydy)

2. działanie cyjanków, azydków i fluorków, które wiążą jony metali np. Fe²⁺ lub Fe³⁺ (tworzą one kompleksy z jonami Fe podobne do żelazicyjanków i żelazocyjanków)

3. działanie czynników chelatujących dwuwartościowe kationy, np. EDTA (etylenodiaminotetraoctan) wiążący jony Mg²⁺.

W wielu przypadkach dla inhibitorów nieodwracalnych otrzymuje się parametry kinetyczne (K_m, V_max) charakterystyczne dla inhibitorów odwracalnych niekompetycyjnych, stąd wiele zamieszania np. co do działania cyjanków.

Wykres Michaelisa-Menten

V_max nie może być osiągnięta nawet przy dużym stężeniu substratu

V_max' maleje proporcjonalnie do wzrostu stężenia inhibitora (im wyższe stężenie inhibitora tym niższa V_max')

3. INHIBICJA AKOMPETYCYJNA

INHIBITOR AKOMPETYCYJNY

• wiąże się w innym miejscu niż miejsce wiązania substratu, wiąże się do kompleksu ES tworząc nieaktywny katalitycznie kompleks ESI

• związanie substratu przez enzym odsłania miejsce wiązania inhibitora

• obniża V_max i K_m

• nie można go znieść przez zwiększenie stężenia substratu

Ten typ inhibicji jest dość rzadki i może dotyczyć niektórych enzymów multimerycznych, katalizujących reakcje z udziałem wielu substratów.

Wykres Michaelisa-Menten

4. INHIBICJA MIESZANA

• inhibitor może wiązać się do E lub kompleksu ES

• nie ważne założenie o niezależności miejsc wiązania S i I, tak jak w inhibicji niekompetycyjnej

• inhibitor może się wiązać w centrum aktywnym (miejscu wiązania substratu lub miejscu katalitycznym) lub poza nim

• inhibitor wpływa jednocześnie na wiązanie substratu, jak również liczbę obrotów enzymu

INHIBICJA NIEODWRACALNA

• inhibitor zwykle tworzy kowalencyjnie wiązanie z grupą funkcyjną enzymu lub wiąże się tak silnie, że jego dysocjacja jest bardzo powolna

• w przypadku inhibicji nieodwracalnej nie może być stosowana zależność Michaelisa-Menten

PRZYKŁADY:

1. działanie gazów paraliżujących układ nerwowy, które polega na inaktywacji acetylocholinoesterazy
   
   
   
   

2. działanie czynników modyfikujących grupy -SH cysteiny w enzymie

[E]

V

V

[°C]

ES

E + S

E + P

+

I

ES

brak reakcji

K_I

OH

OH

O

O

+ H₂O

OH

HOOC

katechol

o-chinon

kwas para-hydroksybenzoesowy

(B)

(A)

+ 1/2O₂

[S_o]

V_o

K_m'

K_m

V_max

K_m (K_m^spp) nowa tzw. pozorna wartość K_m­ wyznaczona w obecności inhibitora jest wyższa w porównaniu z rzeczywistą K_m

Aktywność względna

[pH]

trypsyna

5 8 10

4 6 8 10

esteraza cholinowa

4 6 8

[pH]

papaina

(substrat = benzoiloargininoamid)

[pH]

E

ES

E + P

+ I

EI

K_I

+ S

+ I

+ S

K_I

E + P

ESI

[S_o]

V_o

K_m= K_m'

V_max'

V_max' (V_max^spp) nowa tzw. pozorna wartość V_max­ wyznaczona w obecności inhibitora jest niższa w porównaniu z rzeczywistą V_max

V_max

V_max'/2

V_max/2

E

ES

E + P

+ S

+ I

K_I

E + P

ESI

[S_o]

V_o

K_m

V_max'

V_max' (V_max^spp) nowa tzw. pozorna wartość V_max­ wyznaczona w obecności inhibitora jest niższa w porównaniu z rzeczywistą V_max

V_max

V_max'/2

V_max/2

K_m'

E

ES

E + P

+ I

EI

K_i

+ S

+ I

K_I

E + P

ESI

E + P

K_i ≠ K_I

K_i - stała dysocjacji EI

K_I - stała dysocjacji ESI

CH₂OH

enzym

+

H

H₃C C CH₃

O

F P O

O

H₃C C CH₃

H

DIPF dizopropylofluorofosforan

CH₂O

enzym

+

H

H₃C C CH₃

O

P O

O

H₃C C CH₃

H

nieaktywna

HF

CH₂ S

enzym

+ HI

O

CH_2­ C NH₂

CH₂SH

enzym

+

O

ICH_2­ C NH₂

Zależność wprost proporcjonalna

2x większe stężenie E => 2x szybsza reakcje

ALE

Substrat w nadmiarze!

---