BIOTECHNOLOGIA 4 WYKŁAD
E.coli - szczep EPEC - urzęsienie perytrychalne
E.coli K12- najbardziej znana. Skrót laboratoryjny mikroba, który od lat 50-tych jest modelem badawczym w labach mikrobiologicznych. E. coli K12 była pierwszym zmapowanym organizmem na drodze fizycznej, złożono na niej mapę sekwencyjną, pierwszy organizm,gdzie znajdowano mutanty auksotroficzne, zastosowano na niej transformację.
Yersinia pestis - również znana ludzkości, ale... jest chorobotwórcza, pałeczka dżumy.
Pchła jest jej przenosicielem. Pchła związana ze szczurami.
Jest BARDZO PODOBNA do E.coli... różni się tylko małym szczególikiem... jeden element w składzie tej bakterii - plazmid pYV. Występuje we wszystkich patogennych odmianach Yersinia. Mniej chorobotwórcza - Yersinia enterocolitica - patogen układu pokarmowego, człowiek - jedyny żywiciel.
Yersinie enterocolitica zakaża przewód pokarmowy i przyczynia się do trwałych biegunek.
Shigella - sporo gatunków, wszystkie chorobotwórcze.. .wszystkie podobne pod względem kształtu i właściwości do Yersinia. Ich patogenność wynika z obecności różnych plazmidów.
Wracając do Y. Pestis - pYV jest ciekawy pod względem biologicznym... nie jest plazmidem przenoszonym, w przeciwieństwie do czynnika F!
Może się przenosić najwyżej transformacją nie ma w sobie genów tra.
Geny u Y. Pestis - Had 1 - białko powierzchniowa. Znajduje się na powierzchni pałeczek. Jest najważniejszą adhezyna bakteryjna. Aby bakteria mogła coś zaatakować, musi przylegnąć do jakiejś powierzchni. Nazywa się to internalizacją - bakteria przylega i dzieli się. Proces ten jest potrzebny do tworzenia biofilmów.
Aby stworzyć biofilm w działalności chorobotwórczej, jak i biotechnologicznej - w obu przypadkach muszą występować systemy adhezyn na powierzchni komórki.
Inwazyna - kodowana przez chromosom bakteryjny.
Białka Hop - produkty genów hop1 hop2 hop3 itd... Są to białka powierzchniowe, które są niezbędne do tego, aby proces internalizacji się odbył. W składzie plazmidu pYV jest jeszcze jeden ciekawy element genetyczny - region wapniozależny.
System regulacyjny tego plazmidu i wytwarzanie białek Hop zależy od stężenia wapnia w środowisku przebywania mikroba.
Limitowanie ilości wapnia wyzwala intensywną produkcję białek Hop. Objawia się to tym, że w hodowli bakteryjnej podczas wzrostu hodowli w podłożu płynnym zachodzi proces sklejania komórek i powstają kulki - zespoły bakteryjne w postaci kulek.
Shigella dysenteriae - jest gram-, wygląda jak E. coli. Jest patogenem wewnątrzkomórkowym, powoduje krwawe biegunki. Jest pobierana przez makrofagi. Kępki Peyera.
Znajdują się tam całe zespoły makrofagów. Bakteria ta przez komórki nabłonkowe przechodzi do makrofagów, ale nie daje się ona strawić. Większość bakterii jest trawiona przy pomocy wodniczki pokarmowej i zwykle bakterie są trawione. Jeżeli jest to wyspecjalizowany patogen, jak Salmonella, to jest to też patogen wewnątrzkomórkowy. Zanim zostanie strawiona, błyskawicznie się dzieli i makrofag się rozpada. Shigella zaś wykształca cały system determinantów patogenezy, kodowany na plazmidach, które powoduj, że bakteria ta rozpuszcza błonę wodniczki. Bakteria staje się wolna w cytoplazmie. W cytoplazmie może ona sobie żyć i dzieli się, ale w pewnym momencie wytwarza cały szereg białek powierzchniowych, które mają powinowactwo do włókienek aktynowych makrofaga. Włókienka aktynowe przesuwają się do bieguna komórki i na końcu, na jednym z biegunów następuje systematyczne dosyntetyzowanie włókienek aktynowych. Ta synteza powoduje, że komórka jest przesuwana w przeciwnym kierunku.
Komórka jest przesuwana do jakiegoś bieguna makrofaga. Wypychana jest wypustka cytoplazmatyczna rozpoznawana przez następną komórkę makrofaga i jest pożerana. Tak może się to odbywać wiele razy. Dochodzi do zakażenia całego nabłonka. Rozprzestrzenianie się międzykomórkowe jest warunkiem zakażenia. Zatrzymanie rozprzestrzeniania międzykomórkowego zatrzymuje chorobę.
Gram+
Staphylococcus - A zwłaszcza S. aureus to te bakterie, które są przyczyną zakażeń szpitalnych. Żyje na skórze, na powierzchni ciała, jest przyczyną zakażeń ran, działa z zaskoczenia - kiedy ma okazję.
Bakterie łączą się w grona.
Przyczyną łączenia się tych bakterii jest cały system białek powierzchniowych,
Podobnie jak Shigella zachowuje się Listeria monocytogenes. Z powodu tego, że jest mniej agresywna (ale wciąż groźna, bo atakuje osoby osłabione).
Żyje w produktach mlecznych w chłodnych temperaturach.
Zakażenie bakteriami nie jest takie proste. Aby się zakazić i być chorym trzeba być albo osłabionym, albo otrzymać dawkę ponadprogową.
Ma ona taki sam cykl życiowy jak Shigella, potrzebuje makrofaga. W komórce uwalnia się z wodniczki, żyje w cytoplazmie.
Bakteria ta jest w wielu labach modelem do stworzenia szczepionki nowej generacji. Przez to, że ma cykl życiowy, to gdy mocno się osłabi tę bakterię, może stać się ona żywym wektorem do przenoszenia produktów do systemu immunologicznego, co żywi nadzieje, że może stać się szczepionką nowej generacji.
Mycobacterium tuberculosis - prątki Kocha: Bardzo trudno barwi się podstawowymi metodami.
Cykl życiowy długi, rozwija się sporo. Rozwój choroby jest kilkumiesięczny. Jest to choroba narządowa, trudna też do leczenia.
Dużo się o niej mówi, mówi się nowej formie szczepień przeciwko gruźlicy. Gruźlica wraca - od wschodu.
Szczepionka oparta na bakteriach nie chorobotwórczych, ale podobnych do Mycobacterium, jak M.brevis (wynaleziona szczepionka przez USA) w naszej szerokości geograficznej zadziałała.
Wraca ponoć nowa odmiana i trzeba uważać.
Neisseria gonorrhoeae: podobna do dwoinki zapalenia płuc wizualnie. Bakteria ta dała kierunek biotechnologii ku poszukiwaniu enzymów restrykcyjnych. Ma zorganizowane systemy restrykcyjno-modyfikacyjne. Wiele enzymów restrykcyjnych z procesów biotechnologicznych pochodzi z Neisseria.
Antoni Van Levenhook - opisał pierwszy bakterie za pomocą prostych przyrządów. Były to polepszone lupy. Dwa szkiełka powiększające wzajemnie obraz.
Bakterie, które widział Koch poruszały się. Ruch bakterii może być bierny, bo porusza się ona zawsze w środowisku wodnym.
Bakteria może się poruszać ruchami Browna.
U bakterii występuje cały system elementów napędzających komórkę bakteryjną, jak np. rzęski.
Bakterie są przeważnie monotrychalne, jak E. coli np.
Kiedy jest kilka rzęsek i umieszczone są na jednym z biegunów -urzęsienie lofotrychalne. Kiedy cała komórka jest urzęsiona równomiernie, mówimy o urzęsieniu peritrychalnym.
Zakłada się, że rzęski pracują jak wiosła - razem w sposób skoordynowany.
W skład rzęski wchodzi błona rzęskowa i cylinder cytoplazmatyczny.
Są to elementy białkowe. Produkty plazmidów zawierających system tra. Tylko te plazmidy kodują rzęski, by ta komórka miała zjawisko ruchu.
Ekonomia ruchu bakterii
Dussbery (1997, 1998) wyprowadził równanie pozwala na obliczenie względnego pożytku dla ruchu aktywnego i pasywnego
Najmniejsza bakteria może mieć średnicę 0.64 mikrometra
Najmniejsza ruchliwa bakteria ma średnicę 0.8 mikrometra
Im większe bakterie, tym wpływ dyfuzji jest mniejszy i wzrasta względem korzyści z pływania aktywnego.
Bardzo mała urzęsiona bakteria i średnica 0,4 mikrometra. 10 rzęsek 10x dłuższych od długości komórki zużywałaby na budowę rzęski 50% węgla komórkowego.
Dla komórki o długości 1 mikrometra względny koszt 10 rzęsek, to już 2% ilość węgla komórkowego, a dla 6 mikrometrów to około 0,2%
Dla umiarkowanie dużej bakterii koszty aktywnego systemu transportu są już trywialne w porównaniu z korzyścią, jaka przynosi zwiększona dostępność do substancji wzrostowych.
Ekonomika ruchu zależy od wielkości bakterii.
Jak działa rzęska?
Trzeba rozumieć strukturę ściany komórkowej, zarówno u gram+ jak i gram-.
Ściana komórkowa składa się z 2 elementów dwuwarstwowych - błona podstawowa (białko, lipid, lipid białko) i warstwa dwuwarstwowa podobnie wyglądająca - warstwa lipopolisacharydowa. NA to się nie zwraca uwagi, ale są to 2 błony dwuwarstwowe... tylko dzięki takiemu podejściu można zrozumieć jak działa rzęska.
Silnik ten jest tak zbudowany, jak wyznacza to ściana komórkowa. Musi się składać z dwóch rodzajów pierścieni - wewnętrznych i zewnętrznych. Pierścienie wewnętrzne osadzone są w błonie cytoplazmatycznej.
Pierścienie wewnętrzne są umieszczone w peptydoglikanie, a zewnętrzne w LPS. Elementy budowy rzęski to tzw. ciało podstawowe.
W błonie komórkowej przy pierścieniach wewnętrznych istnieje struktura LPS-u połączonego z elementem tłuszczowym, która wygląda jak tryby. Stąd powstał model w muzeum molekuł - że pierścień jest nakręcany przez elementy dwóch błon dwuwarstwowych.... ale nie jest to prawda!
Okrężny ruch może być zgodny lub odwrotny do wskazówek. Gdy urzęsienie jest polarne (osadzone na biegunie) wtedy mamy rotację albo zgodną, albo przeciwną do wskazówek - wtedy mamy ruch do przodu lub do tyłu.
W przypadku urzęsienia perytrychalnego jest sytuacja, że rzęski mogą się sklejać w jeden bicz. Wtedy wszystkie falują w jednym kierunku. Jeśli każda rzęska jest oddzielnie, komórka się nie rusza, ale w przypadku połączenia i ruchu odwrotnego do uchu wskazówek zegara komórka porusza się w drugą stronę. Jeśli kręcimy w prawo, jedziemy do przodu - w lewo - cofamy się :)
Parametry techniczne:
E.coli
częstotliwość obrotów rzęski - 100Hz
zasilanie gradientem stężenia H+
prędkość 100-30 mikrometrów na sekundę.
Inne
częstotliwość obrotów 1500 Hz
zasilanie pompą Na+
prędkość kilkaset mikrometrów/sekundę.
Prędkości odpowiadające od 60-180 km/h.
Momentalne przełączenie kierunków pracy [w takiej skali brak jest bezwładności]
Wydajność przemiany energii - 100%! nie ma strat energii przy ruchu
Zasada działania rzęski:
Obrót. Elementem podstawowym tego silnika jest rotor [białko FliG]. Białka, które to podtrzymują nazywają się stator [białko MotA]
U bakterii gram-, pierścienie są bardzo rozdzielone. Pierścienie zewnętrzne od wewnętrznych na nóżce są oddzielone o tyle, o ile 2 błony są od siebie oddzielone.
W przypadku bakterii gram+, gdy jest jedna gruba ściana komórkowa, pierścienie są blisko siebie i pousadzane w błonie podstawowej.
Gdy w środowisku pojawia się np. substancja odżywcza, bakteria uruchamia system ruchu w kierunku rosnącego gradientu tego czegoś.
Substancje chemiczne, do których bakterie podążają to atraktanty. Substancje chemiczne, od których uciekają to repelenty.
Atraktanty to związki korzystne dla bakterii. Będą to aminokwasy, cukry, mniej lub bardziej złożone substancje odżywcze. Repelenty - toksyny.
Ważną rolę pełnią receptory białkowe chemotaktyczne.
Znane są 4 typy:
I, II - dla aminokwasów
III - cukry
IV - peptydy.
Są to białka, które ulegają fosforylacji i defosforylacji. W kolejnym etapie zachodzi chemotaktyczne przekazywanie sygnałów do efektorów. Każdy z nich daje energię do napędzenia rzęski, a więc protony lub pompa sodowa w zależności od mikroba.
Atraktant wiąże się z pierwszym białkiem chemotaksji MCP - methyl accepting proteins. Następnie jest przenoszenie białek z atraktantem przez błonę cytoplazmatyczną.
Najważniejsze białka chemotaktyczne to CheB i CheY
Białko CheB usuwa grupy metylowe przy białkach metylujących atraktanty.
W tym momencie atraktant łączy się z białkiem CheY, który włącza pompę protonową.
Aby nastąpił ruch rzęski, atraktant musi być związany i zmetylowany. Przeniesienie do wnętrza komórki, uruchomienie systemu białek chemotaktycznych i uruchomienie przez CheY systemu pompy protonowej lub sodowej w systemie motorka rzęski.
Ruch zgodny ze wskazówkami zegara (w prawo) jest łatwiejszy do wyjaśnienia, bo zależy od atraktanta.
Gorzej wyjaśnić cofanie się.
Oprócz tych mechanizmów jest jeszcze ruch nazywany śluzowym.
Ruch śluzowy potrzebny jest po to, by gromadzić się w skupiskach i robić biofilmy.
Praca w zespole jest bardziej korzystna.
Tworzenie biofilmów korzystne dla transferu horyzontalnego genów.
Są w komórce pewne dysze, nazywane są dyszami wylotowymi. Są to otwory w błonie zewnętrznej
Przez te dysze porcjami wywalany jest śluz i służy do do odpychania się bakterii od podłoża. Jest to ruch niezależny, w lewo, w prawo.
Gdy bakterie spotykają się ze sobą następuje ułatwiony transfer horyzontalny.
U bakterii występują 3 podstawowe procesy płciowe: transformacja, transdukcja i koniugacja.
Przenoszenie plazmidu F u bakterii.
Za pomocą koniugacji przenoszony może być cały plazmid lub chromosom.
Plazmid przenoszony jest wtedy, gdy nie jest zintegrowany z chromosomem i jest wolny.
Chromosom typu Hfr przenoszony jest przez 90 minut, bo plazmid F w chromosomie ciągnie za sobą chromosom podczas koniugacji.
Jest przypadek, że plazmid F wbudowany w chromosomie może się z niego z jakiegoś powodu wybudować i zawierać element chromosomalny. Do takich przykładów plazmidów należy plazmid F`. Jest to plazmid pochodzący z wycięcia się plazmidu F z chromosomu i pobraniu elementów chromosomu bakteryjnego. Jeśli są to elementy systemu laktozowego.
Jeżeli są to geny biorące udział w metabolizmie laktozy, to takie coś nazywa się F' lac. Taki F' lac przenosi tylko plazmid.. ale w tym plazmidzie jest element chromosomalny laktozowy.
Jest to bardzo wydajny plazmid, częstość rekombinacji ogromna. Prawie wszystkie plazmid przechodzą z dawcy do biorcy.
W przypadku krzyżówek Hfr częstości są mniejsze, bo koniugacje się urywają, tudzież następuje defekt i częstość jest mniejsza.
W plazmidzie musi być układ genetyczny, który będzie pilie syntetyzować. Pilia płciowa musi znaleźć swój receptor w komórce biorcy. Tym receptorem jest białko OmpA. Jest to zewnętrzne białko porynowe, które jest akceptorem dla pilii płciowych. U wielu bakterii przy koniugacji to białko stanowi element, pod który przyczepia się pilia płciowa.
Przenoszenie jednej nici DNA odbywa się z jednoczesną replikacją.
Transformacja - jest podstawową metodą inżynierii genetycznej.
Transdukcja - sposób przenoszenia przy użyciu bakteriofagów. Może być specyficzna lub nie.
Specyficzna jest wtedy, gdy fag wbudowuje się w stałe miejsce i ten element jest przenoszony do komórki biorcy.
Są też transdukcje niespecyficzne- ogólne. Przenoszenie przypadkowych kawałków DNA.
Jest też transfekcja - od biorcy do dawcy przy udziale DNA bakteriofaga izolowanego z niego. Jest to więc transformacja przy udziale mieszanki fagowo-bakteryjnej.
Biotechnologia, wykład IV, strona 6