TRANSKRYPCJA U PROCARYOTA

Podstawowe zasady transkrypcji

Transkrypcja - ogólne informacje

• Jest syntezą jednoniciowego RNA na matrycy DNA

• Jest katalizowana przez polimerazę RNA, wymagającą obecności matrycy dsDNA i prekursorowych rybonukleotydów: ATP, GTP, CTP i UTP

• Synteza RNA przebiega w kierunku od 5' 3', a jego sekwencja odpowiada sekwencji nici DNA nazywanej nicią sensowną (z U zamiast T)

• Druga nić nazywa się nicią antysensowną lub nicią matry­cową, ponieważ stanowi matrycę, z której zasadami rybonukleotydy tworzą pary w trakcie syntezy RNA

Inicjacja

• Polimeraza RNA jest enzymem odpowiedzialnym za transkrypcję

• Aby zainicjować syntezę RNA, wiąże się ona ze specyficznymi sekwencjami DNA, zwanymi promotorami Sekwencje te znajdują się po lewej stronie końca 5' regionu kodującego białko i zawierają krótkie, zachowawcze sekwencje DNA, wspólne dla różnych promotorów

• Polimeraza RNA wiąże się z dsDNA, w miejscu sekwencji promotorowej, powodując miejscowe rozplecenie DNA

• Różnice między promotorami różnych genów decydują o różnicach w wydajności inicjacji transkrypcji i biorą udział w jej regulacji

• Krótkie sekwencje zachowawcze w promotorach są miejscami wiązania polimerazy lub innego białka wiążącego się z DNA w celu inicja­cji lub regulacji transkrypcji

• Pozycja pierwszej zasady syntetyzowanego RNA nazywa się miejscem startu i oznacza się ją jako pozycję +1

• Polimerazę RNA i jej kofaktory, gdy zajmą swoje miejsce na matrycy DNA, często nazywa się kompleksem transkrypcyjnym

Elongacja

• Polimeraza RNA wiąże kowalencyjnie rybonukleotydy z końcem 3' tworzącego się łańcucha RNA, a zatem polimeraza RNA wydłuża powstający łańcuch w kierunku 5'3'

• W trakcie tego procesu enzym przesuwa się wzdłuż antysensownej nici DNA (matrycy) w kierunku 3'5' W trakcie przesuwania się enzymu, DNA ulega miejscowemu rozpleceniu

• Nici DNA rozdzielają się, eksponując nić matrycową, co umożli­wia tworzenie par z zasadami rybonukleotydów i kowalencyjne przy­łączenie rybonukleotydów do końca 3' rosnącego łańcucha RNA

• Polimeraza RNA prowadzi tę reakcję z szybkością około 40 zasad na sekundę w 37°C

Terminacja

• Terminacja transkrypcji odbywa się w miejscu specyficznej sekwencji DNA, określanym jako miejsce terminacyjne

• Sek­wencje te często zawierają regiony względem siebie komplementarne, które mogą tworzyć w produkcie — RNA — drugorzędową strukturę typu ramię-pętla lub spinka do włosów

• Powoduje ona zatrzyma­nie się polimerazy i transkrypcji

• Niektóre sekwencje terminacyjne mogą zatrzymywać transkrypcję bez obecności dodatkowych czynników, a inne wymagają dodatkowego czyn­nika, białka rho (ρ)

• W reakcji terminacji hybryda RNA-DNA ulega roz­dzieleniu

Polimeraza RNA Escherichia Coli

Polimeraza - informacje ogólne

• Składa się z co najmniej pięciu podjednostek: alfa (α), beta (β), beta prim (β'), omega (ω) i sigma (σ).

• W komplet­nej polimerazie, zwanej holoenzymem, znajdują się 2 podjednostki α i po jednej z pozostałych podjednostek.

• Do inicjacji trans­krypcji potrzebny jest cały enzym. Czynnik σ nie jest potrzebny do elongacji i po inicjacji jest uwalniany z kompleksu transkrypcyjnego.

• Pozostała reszta enzymu, która przemieszcza się wzdłuż DNA, nazywana rdzeniem enzymu, ma strukturę α₂ββ'ω.

• Polimeraza RNA z E. coli syntetyzuje RNA z wydajnością około 40 nt na sekundę w 37°C i do swojej aktywności wymaga obecności jonów Mg²⁺.

• Enzym ma kształt cylindryczny. Wielkość tego cylindra sugeruje, że enzym może się wiązać bezpośrednio z 16 pz DNA, a cała polimeraza wiąże się z regionem DNA o długości około 60 pz.

• Większość polimeraz RNA składa się, podobnie jak polimeraza E. coli, z wielu podjednostek, jednak nie zawsze jest to konieczne, ponieważ polimerazy RNA kodowane przez bakteriofagi T3 i T7 są pojedynczymi łańcuchami polipeptydowymi, znacznie mniejszymi od bakteryjnych enzymów złożonych z wielu podjednostek. Syntetyzują one bardzo wydajnie RNA (200 nukleotydów w czasie 1 sekundy w 37°C) i rozpoznają swoiste dla siebie, specyficzne miejsca wiązania na DNA.

Podjednostka α

• Kodowana jest przez gen rpoA

• Niezbędna do złożenia się rdzenia białkowego

• W trakcie infekcji E. coli fagiem T4 podjednostka a ulega modyfikacji przez rybozylację argininy z udziałem ADP-rybozy, czego efektem jest zmniejszenie powinowactwa do promotorów, co wskazuje, że podjednostka α może odgrywać rolę w ich rozpoznawaniu.

Podjednostka β

• Sta­nowi ona centrum katalityczne polimerazy RNA

• Wykazano, że ryfampicyna i streptolidyginy wiążą się z podjednostką β

• Mutacje zwiększające oporność bakterii na ryfampicynę i streptolidyginy występują w genie rpoB, kodującym podjednostkę β.

• Podjed­nostka β ma dwie domeny, odpowiedzialne za inicjację transkrypcji i za elongację.

Podjednostka β'

• Jest ona kodowana przez gen rpoC

• Podjednostka β' wiąże 2 jony Zn²⁺, które przypuszczalnie uczestniczą w katalitycznej funkcji polimerazy

• Z podjednostką tą wiąże się polianion heparyna

• Heparyna inhibuje transkrypcję in vivo, a także współzawodniczy z DNA o miejsce wiązania, co sugeruje, że podjednost­ka β ' jest odpowiedzialna za wiązanie polimerazy z matrycą DNA.

Czynnik sigma

• Najpowszechniejszym czynnikiem sigma u E. coli jest σ⁷⁰ (o masie cząste­czkowej 70 kDa)

• Przyłączenie czynnika σ zmienia rdzeń polimerazy RNA w holoenzym

• Czynnik sigma pełni istotną rolę w procesie rozpoznawa­nia promotora, ale nie jest konieczny do elongacji

• Bierze udział w roz­poznawaniu promotora, zmniejszając powinowactwo rdzenia enzymu do niespecyficznych miejsc DNA 10⁴ razy i równocześnie zwiększa jego powinowactwo do promotora.

• Wiele prokariotów (łącznie z E. coli) posiada liczne czynniki σ, które są zaangażowane w rozpoznawanie specy­ficznych klas sekwencji promotorowych

• Gdy łańcuch RNA osiągnie długość 8-9 nt, czynnik σ zostaje uwolniony z holoenzymu polimerazy RNA Wówczas rdzeń enzymu przesuwa się wzdłuż DNA, syntetyzując tworzącą się nić RNA

• Uwolniony czynnik σ może utworzyć kompleks z następnym rdzeniem enzymu i ponownie inicjować trans­krypcję. W komórkach czynnik σ stanowi tylko 30% ilości kompleksów rdzenia enzymu, a zatem tylko 1 /3 kompleksów polimerazy może wystę­pować w formie holoenzymu

Promotor rozpoznawany przez σ⁷⁰ E. coli

Sekwencje promotorowe

• Polimeraza RNA wiąże się ze specyficznymi miejscami inicjatorowymi (promotorami) po stronie 5' sekwencji transkrybowanej

• Najczęściej występującym czynnikiem σ u E. coli jest σ⁷⁰

• Promotory scharakteryzowano najpierw poprzez mutacje zwiększające i zmniejszające szybkość transkrypcji genów, takich jak zawarte w operonie lac

• Promotor jest usytuowany po stronie 5' miejsca startu transkrypcji, zaczyna się w pozy­cji oznaczonej -1

• Zgodnie z tym, sekwencje promotorowe są oznaczane liczbą ze znakiem ujemnym, wskazującą na odległość od miejsca startu transkrypcji. Istotne dla funkcji promotora są tylko bardzo krótkie sekwencje zachowawcze

Wielkość promotora

• Promotor rozpoznawany przez σ⁷⁰ składa się z 40-60 pz

• Region od pozycji około -55 do +20 wiąże się z polimerazą, a od -20 do +20 jest silnie chroniony przed aktywnością nukleazową DNazy I, co sugeruje jego silną asocjację z polimerazą, która blokuje dostęp nukleazy do DNA

• Mutageneza sekwencji promotorowych wykazała, że są one aż do pozycji około -40 bardzo istotne dla funkcji promotora

• Szcze­gólnie ważne w przypadku E. coli są dwie sekwencje o długości 6 pz, znajdujące się w pobliżu pozycji -10 i -35.

Sekwencja -10

• Najbardziej zachowawczą w promotorach σ⁷⁰ jest sekwencja 6 pz

• Jest ona usytuowana, w odniesieniu do miejsca startowego, w pobliżu pozycji -10

• Sekwencję tę czasami nazywa się kasetą Pribnowa

• Jej sekwencja zgodna jest następująca: TATAAT

• Dwie pierwsze zasady (TA) i końcowa T są najbardziej zachowawcze

• Ten heksanukleotyd jest oddzielony od miejsca startu transkrypcji odcinkiem o długości 5-8 pz

• Sekwencja -10 jest miejscem inicjacji rozplatania DNA przez polimerazę

Sekwencja -35

• W rejonie -35, występuje heksamerowa zachowawcza sekwencja zgodna: TTGACA

• Jest to najbardziej zachowawcza sekwencja występująca w wydajnych promoto­rach

• Najsilniej zachowawcze są pierwsze trzy pozycje tego heksametru

• W 90% wszystkich promotorów sekwencja ta jest oddzielona od kasety -10 odcinkiem o długości 16-18 pz.

Miejsce startu transkrypcji

• Miejscem startu transkrypcji w 90% wszystkich genów jest puryna

• G występuje znacznie częściej w tym miejscu niż A

• Po każdej stronie nukleotydu miejsca startu często znajdują się zasady C i T

Wydajność promotora

• Pomiędzy sekwencjami różnych promotorów istnieją znacz­ne różnice, a ich wydajność transkrypcyjna może różnić się nawet 1000-krotnie

• Funkcje różnych regionów paromotorowych:

• sekwencja -35 stanowi region rozpoznawania, który zwiększa zdolność rozpoznawania czynnika σ polimerazy RNA i oddziaływania z nią

• region -10 odgrywa istotną rolę w rozplataniu DNA

• sekwencja w pobliżu miejsca startu ma wpływ na inicjację

• Sekwencja pierwszych 30 zasad podlegających transkrypcji ma rów­nież wpływ na transkrypcję

• Kontroluje ona szybkość opuszczania pro­motora przez polimerazę RNA, co pozwala na tworzenie się kolejnego kompleksu inicjującego, a tym samym wpływa na ogólną szybkość transkrypcji i siłę promotora

• Znaczenie rozplecenia nici DNA dla inicjacji transkrypcji wynika z efektu ujemnego superzwinięcia matrycy DNA

• Superzwinięcie na ogół wzmaga inicjację transkrypcji

• Niektóre sekwencje promotorowe nie są wystarczająco podo­bne do sekwencji zachowawczych, by w normalnych warunkach powodo­wać szybką transkrypcję odcinków kodujących

• Przykładem tego jest pro­motor lac, P_lac, który wymaga dodatkowego czynnika aktywującego, zwanego białkiem receptorowym (CRP)cyklicznego AMP (cAMP)

• CRP wiąże się z DNA w pobliżu sekwencji proomotorowej, co wzmaga wiązanie polimerazy i inicjację transkrypcji

• Inne promo­tory, na przykład genów związanych z szokiem termicznym, zawierają odmienne promotorowe sekwencje zgodne, które mogą być rozpozna­wane tylko przez polimerazę związaną z czynnikiem σ, różniącym się od zwykłego czynnika σ⁷⁰.

Inicjacja, elongacja i terminacja transkrypcji

Wiązanie promotora

• Rdzeń polimerazy RNA, α₂ββ'ω, charakteryzuje się niespecyficznym ogólnym powinowactwem do DNA, tworząc z nim tzw. luźne połączenia.

• Kiedy czynnik σ dołącza do rdzenia enzymu zmieniając go w holoenzym, powinowactwo do niespecyficznych miejsc DNA zmniejsza się 20 000 razy.

• Obecność czynnika σ równocześnie zwię­ksza 100-krotnie wiązanie holoenzymu z właściwymi miejscami promotorowymi

• Ogółem - czynnik σ zwiększa w bardzo istotnym stopniu specyficzność wiązania holoenzymu z miejscami promotorowymi

• W ge­nomie E. coli holoenzym odszukuje promotory i wiąże się z nimi bardzo szybko. Proces ten jest na tyle szybki, że nie może się odbywać na drodze powtarzającego się wiązania i oddysocjowania od DNA

• Polega on na przesuwaniu się polimerazy wzdłuż DNA aż do napotkania sekwencji promotorowej

• W miejscu promotorowym polimeraza rozpo­znaje dwuniciowe sekwencje DNA -35 i -10.

• Podstawowy kompleks poli­merazy ze sparowanym promotorowym DNA nazywa się kompleksem zamkniętym

Rozplecenie DNA

• Aby antysensowna nić mogła tworzyć pary z zasadami rybonukleotydów, dwuniciowy DNA musi być rozpleciony przez polimerazę

• Ujemne superzwinięcie wzmaga transkrypcję wielu genów, ponieważ ułatwia polimerazie rozplecenie DNA, jednakże niektóre promotory nie są aktywowane przez ujemne superzwinięcie, co oznacza, że różnice w naturalnej topolo­gii DNA (róż­nice w przestrzennym ułożeniu sekwencji -35 w stosunku do sekwencji -10 w dwuniciowej helisie) mogą wpływać na transkrypcję.

• Promotory enzymatycznych podjednostek gyrazy są hamowane przez ujemne superzwinięcie. Gyraza DNA jest odpowiedzialna za ujemne superzwinięcie genomu E. coli, a zatem może ono służyć jako mechanizm kontroli ekspresji genu gyrazy DNA, działający na zasadzie sprzężenia zwrotnego

• Początkowe rozplecenie DNA prowadzi do utworzenia otwartego kompleksu z poli­merazą, proces ten nazywa się ścisłym wiązaniem

Inicjacja syntezy łańcucha RNA

• Niemal wszystkie miejsca startu syntezy łańcucha RNA zawierają resztę purynową, przy czym G występuje częściej niż A

• Synteza RNA w prze­ciwieństwie do syntezy DNA zachodzi bez startera

• Synteza łańcucha zaczyna się od GTP lub ATP.

• Polimeraza na początek wbudowuje dwa pierwsze nukleotydy i tworzy między nimi wiązanie fosfodiestrowe

• Pierwszych dziewięć nukleotydów zostaje połączonych bez przesuwania się enzymu wzdłuż DNA

• Każdorazowo po włączeniu do łańcucha któregoś z pierwszych 9 nukleotydów istnieje znaczne prawdopodobieństwo usunięcia inicjowanego łańcucha RNA

• Ten proces poronnej inicjacji jest istotny dla ogólnego tempa przebiegu transkrypcji, ponieważ głównie on decyduje o szybkości uwalniania promotora przez polimerazę

• Uwolnienie promotora pozwala na kolejną inicjację trans­krypcji przez następną cząsteczkę polimerazy

• Uwolnienie promotora wymaga minimum 1-2 sekund, a więc jest długo trwającym procesem w porównaniu z innymi etapami transkrypcji

• Ekspresja genu jest kontrolowana głównie na etapie inicjacji

• U bakterii szybkość inicjacji transkrypcji zależy od struktury promotora oraz aktywności aktywatorów i represorów

Elongacja łańcucha RNA

• Po udanej inicjacji enzym uwalnia czynnik σ i tworzy potrójny kompleks polimeraza-DNA-powstający RNA

• Polimeraza przesuwa się wzdłuż DNA (uwolnienie promotora), pozwalając na ponowną inicjację transkrypcji z tego samego promotora przez następną cząsteczkę polimerazy RNA

• Region rozplecionego DNA nazwany bąblem transkrypcyjnym przesuwa się z polimerazą wzdłuż DNA. Długość rozplecionego odcinka DNA pozostaje stała i wynosi około 17 pz

• Koniec 5' RNA tworzy hybrydową helisę z antysensowną nicią DNA na odcinku około 12 pz

• Polimeraza E. coli przesuwa się z przeciętną szybkością 40 nt na sekundę

• Stałe utrzymanie krótkiego odcinka rozplecionego DNA wska­zuje, że polimeraza rozplata DNA przed bąblem transkrypcyjnym i splata tuż za nim

Terminacja łańcucha RNA

• Polimeraza RNA pozostaje związana z DNA i kontynuuje transkrypcję aż dotrze do sekwencji terminacyjnej (sygnał stop) na końcu jednostki transkrypcyjnej

• Najczęściej występującym sygnałem stop jest struktura spinki do włosów, której transkrypt RNA zawiera odcinki wzajemnie komplementarne, stąd RNA może tworzyć stabilną strukturę spinki zawierającą ramię i pętlę

• Na ogół struktura ramienia jest bardzo bogata w pary G-C, zwiększające stabilność parowania zasad

• Taka struktura poprzedza często sekwen­cję czterech lub więcej reszt U

• Wydaje się, że polimeraza zatrzymuje się bezpośrednio po zsyntetyzowaniu struktury spinki

• Następujący po niej odcinek reszt U w RNA tworzy bardzo słabe pary z odpowiadającymi im resztami A w antysensownej nici DNA, co sprzyja oddysocjowaniu RNA z kompleksu utworzonego z matrycową nicią DNA.

• Następnie niesparowana nić antysensowna DNA ponownie łączy się z nicią sensowną , a rdzeń enzymu oddysocjowuje od DNA

Terminacja zależna od rho

• Poza strukturami spinki, poprzedzającymi odcinek reszt U, przy których polimeraza RNA sama się zatrzymuje, istnieją inne miejsca terminacyjne, które nie tworzą stabilnych struktur spinki

• Wykorzystują one dodatkowy czynnik, białko rho (ρ), będące helikazą, które pośredniczy w terminacji transkrypcji

• Rho jest heksamerycznym białkiem, które hydrolizuje ATP w obecności jednoniciowego RNA

• Białko wiąże się z odcinkiem RNA na długości 72 nt, roz­poznając określone cechy strukturalne, a nie sekwencję zgodną

• Rho przemieszcza się wzdłuż syntetyzowanego RNA w kierunku kompleksu transkrypcyjnego i umożliwia polimerazie RNA terminację transkrypcji w miejscu terminacyjnym, zależnym od rho

• Podobnie jak w przypadku terminatorów niezależnych od rho, sygnały są rozpoznawane w nowo syntetyzowanym RNA, a nie w matrycy DNA

• Terminatory zależne od rho są czasami strukturami spinki, ale bez następujących po niej reszt U, które są niezbędne w terminatorach niezależnych od rho

REGULACJA TRANSKRYPCJI U PROCARYOTA

Operon lac

Operon

• W 1961 roku Jacob i Monod zaproponowali model operonu dla skoordy­nowanej regulacji transkrypcji genów uczestniczących w specyficznych szlakach metabolicznych

• Operon jest jednostką ekspresji genów, w któ­rego regulacji biorą udział:

• Geny struktury enzymów (każdy gen poza regulatorowym) uczest­niczących w specyficznych szlakach biosyntezy, których ekspresja jest skoordynowanie kontrolowana

• Elementy kontrolne, takie jak sekwencja operatorowa, która jest sek­wencją DNA regulującą transkrypcję genów struktury

• Gen(y) regulatorowy, którego produkt, na przykład represor, rozpo­znaje elementy kontrolne. Represor wiąże się z sekwencją operatora

Operon laktozowy

• Escherichia coli może wykorzystywać jako źródło węgla laktozę

• Enzymy potrzebne do wykorzystania laktozy jako źródła węgla są syntetyzowane tylko wówczas, gdy laktoza jest jedynym dostępnym źródłem węgla

• Operon laktozowy (lub operon lac) jest złożony z trzech genów stru­ktury: lacZ, lacY i lacA.

• lacZ koduje β-galaktozydazę — enzym odpowie­dzialny za hydrolizę laktozy do galaktozy i glukozy

• lacY koduje permeazę galaktozydową odpowiedzialną za transport laktozy przez ścianę komórkową bakterii

• lacA koduje transacetylazę tiogalaktozydową

• Te trzy geny struktury stanowią jedną transkrypcyjną jednostkę lacZY,, która zawiera jeden promotor P_lac

• Taka organizacja oznacza, że trzy geny struktury operonu laktozowego są wspólnie kontrolowane i ulegają eks­presji razem, czego produktem jest policistronowy mRNA, zawierający więcej niż jeden region kodujący białko

• Jednostka transkrypcyjna lacZYA ma miejsce operatorowe O_lac, które jest usytuowane na odcinku pomiędzy zasadami -5 i +21 przy końcu 5' operonu laktozowego

• Miejsce to wiąże białko zwane represorem lac, które po związaniu się z operatorem jest silnym inhibitorem transkrypcji

• Represor lac jest kodowany przez osobny regulatorowy gen lacI, który również wchodzi w skład operonu i znajduje się po stronie 5' P_lac

Represor lac

• Gen lacl koduje represor lac, który jest aktywny jako tetramer identycz­nych podjednostek

• Charakteryzuje się bardzo dużym powinowactwem do miejsca operatorowego lac, a także ogólnie dużym powinowactwem do DNA

• Miejsce operatorowe lac, O_lac jest złożone z 28 par zasad o sekwencji palindromowej.

• Ta odwrotnie powtórzona symetria operatora pasuje do symetrii represora lac, zbudowanego z czterech iden­tycznych podjednostek

• Przy braku laktozy represor wiąże się z operatorem

• Zarówno represor, jak i polimeraza RNA mogą się wiązać równocześnie z miejscem promotorowym lac i operatorem

• Represor lac zwiększa wiązanie polimerazy z promotorem lac o dwa rzędy wielkości

• Oznacza to, że gdy represor lac jest związany z sek­wencją DNA operatora O_lac, polimeraza równocześnie może się związać z sąsiednią sekwencją promotorową P_lac

Indukcja

• W nieobecności induktora represor lac ogranicza transkrypcję lacZYA do bardzo niskiego poziomu

• Po dodaniu do komórek laktozy, niski podsta­wowy poziom permeazy umożliwia pobranie laktozy przez bakterie, a β-galaktozydaza katalizuje konwersję części laktozy w allolaktozę

• Allolaktoza działa jako induktor i wiąże się z represorem lac, co powoduje zmianę konformacji represorowego tetramera i redukuje jego powino­wactwo do operatora lac

• Usunięcie represora lac z miejsca operato­rowego pozwala polimerazie (która już znajduje się na sąsiadującym pro­motorze) szybko rozpocząć transkrypcję genów lacZYA

• Zatem, dodanie laktozy lub syntetycznego iduktora, takiego jak np. izopropylo-β-D-tiogalaktozyd (IPTG), bardzo szybko stymuluje transkrypcję genów struktury operonu laktozowego

• Usunięcie induktora prowadzi z kolei do niemal natychmiastowej inhibicji tej indukowanej transkrypcji, ponieważ wolny represor lac szybko ponownie wiąże się z miejscem operatorowym

• Transkrypt lacZYA (RNA) jest wyjątkowo niestabilny, w rezultacie czego jego translacja zostaje zahamowana w bardzo krótkim czasie po zabloko­waniu transkrypcji genów lacZYA

Białko receptorowe cyklicznego AMP

• Promotor P_lac nie jest silnym promotorem

• P_lac i promotory pokrewne nie zawierają silnej sekwencji -35, a niektóre mają nawet słabe sekwencje zgodne -10

• Do wysokiego poziomu transkrypcji wymagają one działania specyficznego białka aktwującego, nazywanego białkiem receptorowym cyklicznego AMP (CRP)

• CRP można również nazywać białkiem akty­wującym geny kataboliczne (CAP)

• W obecności glukozy E. coli nie potrzebuje alternatywnego źródła węgla, jakim jest laktoza, więc operon laktozowy, nie jest aktywowany

• Jest to regulowane za pośrednictwem CRP, białka występującego w formie dimeru, które samo nie może się związać z DNA i aktywować transkryp­cji

• Glukoza zmniejsza zawartość cAMP w komórce

• W komórkach E. coli przy braku glukozy stężenie cAMP wzrasta i CRP wiąże się z cAMP

• Kom­pleks CRP-cAMP łączy się z promotorem P_lac operonu laktozowego tuż powyżej miejsca wiązania polimerazy RNA

• Przyłączenie CRP indukuje zgięcie DNA o 90°, co, wzmacnia wiązanie polimerazy RNA z promotorem, zwiększając transkrypcję 50-krotnie.

• Miejsce wiązania CRP jest powtórzone w odwrotnej orientacji i może sąsiadować z promotorem (jak w operonie laktozowym), może się także znajdować w samym promotorze lub znacznie dalej, powyżej promotora

• Różnice między miejscami wiązania CRP w promotorach różnych operonów katabolicznych mogą wpływać na zróżnicowany poziom odpowie­dzi tych operonów na cAMP in vivo

Operon trp

Operon tryptofanowy

• Operon trp zawiera 5 genów struktury potrzebnych do syntezy tryptofanu

• Operon stanowi pojedynczą jednostkę transkrypcyjną, wytwarzajcą transkrypt o wielkości 7 kpz, który jest kodowany przez sek­wencje znajdujące się poniżej promotora trp i operatora trp — miejsc P_trp i O_trp

• Podobnie jak w wielu innych operonach biorących udział w biosyn­tezie aminokwasów, operon trp podlega mechanizmom skoordynowanej kontroli ekspresji genów, gdy produkt ich działania — tryptofan wystę­puje w komórce w niedoborze.

• Tak jak w operonie lac, produkt jednostki transkrypcyjnej — RNA jest bardzo niestabilny, co umożliwia bakterii szybką reakcję w odpowiedzi na zmianę zapotrzebowania na tryptofan

Represor trp

• Produkt oddzielnego operonu trpR — represor trp oddziałuje swoiście z miejscem operatorowym operonu trp

• Symetryczna sekwencja opera­tora, tworząca miejsce wiązania represora trp, zachodzi na sekwencję pro­motora trp w miejscu pomiędzy zasadami -21 i +3

• Centrum miejsca wiązania jest palindromowe i składa się z 18 pz

• Represor trp wiąże się z tryptofanem i tylko w kompleksie z tryptofanem może wiązać się z ope­ratorem

• Represor jest dimerem dwu podjednostek, które są strukturalnie podobne do białka CRP i represora lac

• Strukturę represorowego dimeru tworzy centralny rdzeń i 2 elastyczne oddziaływające z DNA domeny, z których każda jest utworzona z C-końcowej połówki jednej podjednostki

• Tylko wówczas, gdy represor jest związany z trypto­fanem, domeny oddziaływające z DNA są dostatecznie od siebie odda­lone, a ich boczne łańcuchy przyjmują odpowiednią konformację, by oddziaływać z dużymi rowkami DNA w obszarze sekwencji operatora trp

• Zatem, tryptofan — końcowy produkt aktywności enzymów kodowanych przez operon trp — działa jako korepresor i inhibuje swoją własną syntezę

• Represor zmniejsza inicjację transkrypcji około 70 razy. Jest to więc znacznie mniejszy efekt niż w przypadku represora lac.

Atenuator

• Początkowo uważano, że za całą regulację transkrypcji operonu trp jest odpowiedzialny represor Zauważono jednak, że delecja sekwencji mię­dzy operatorem a regionem kodującym gen trpE powoduje zwiększenie zarówno podstawowej, jak i aktywowanej (odblokowanie represji) transkrypcji

• Miejsce to nazywa się atenuatorem, znajduje się przy końcu transkrybowanej sekwencji liderowej o długości 162 nt i poprzedza kodon ini­cjujący trpE

• Atenuator jest miejscem terminacyjnym rho-niezależnym, zawiera krótki rejon palindromowy bogaty w pary GC, po którym nastę­puje 8 kolejnych cząsteczek U

• Gdy sekwencja ta w transkrypcie RNA utworzy strukturę spinki, działa ona jak skuteczny terminator transkrypcyjny i powstaje transkrypt o długości tylko 140 nt

Struktura liderowego RNA

• Liderowa sekwencja RNA operonu trp zawiera cztery regiony o komple­mentarnych sekwencjach, które mogą tworzyć różne sparowane struktury RNA

• Rejony te oznacza się cyframi 1, 2, 3 i 4

• Atenuacyjna spinka jest produktem sparowania sekwencji 3 i 4 (struktura 3:4)

• Powstanie takiej spinki powoduje terminację transkrypcji

• Sekwencje 1 i 2 są również kom­plementarne i mogą utworzyć drugą spinkę 1:2

• Komplementarne są także sekwencje 2 i 3 i jeśli utworzą one strukturę spinki 2:3, to nie może powstać spinka atenuacyjna i nie dojdzie do terminacji transkrypcji

• W normalnych warunkach tworzenie się spinek 1:2 i 3:4 jest energetycznie uprzywilejowane

Peptyd liderowy

• Sekwencja liderowego RNA zawiera wydajne miejsce wiązania rybo­somu

• Produktem translacji liderowego RNA jest 14-aminokwasowy pep­tyd liderowy, kodowany przez nukleotydy 27-68 liderowego RNA

• Kodony 10 i 11 liderowego RNA kodują kolejne 2 reszty tryptofanowe - końcowy produkt działania enzymów operonu trp

• Taki lider jako oligopeptyd nie pełni istotnej roli, tryptofan należy do aminokwasów rzad­kich, a prawdopodobieństwo występowania obok siebie dwóch kolejnych kodonów tryptofanowych w innych genach jest małe

• W warunkach niedoboru tryptofanu rybosom zatrzyma się w miejscu występowania kodonów trp

• Funkcja liderowego peptydu polega na określaniu stężenia dostępnego tryptofanu i regulowaniu terminacji transkrypcji

Atenuacja

• Istotą atenuacji u E. coli jest ścisłe sprzężenie transkrypcji z translacją

• Translacja może zachodzić już w trakcie transkrypcji mRNA

• Koniec 3' sek­wencji kodującej liderowy peptyd trp zachodzi na sekwencję 1

• Dwa kodony trp znajdują się w obrębie sekwencji 1, a kodon stop - mię­dzy sekwencjami 1 i 2

• Dostępność tryptofanu (ostatecznego produktu syntetyzowanego przez enzymy operonu trp) jest „wyczuwana" poprzez jego zapotrzebowanie w procesie translacji i ona określa utworzenie się lub nie struktury spinki terminacyjnej (3:4) w mRNA

• W trakcie transkrypcji operonu trp polimeraza RNA zatrzymuje się przy końcu sekwencji 2 do momentu, gdy rybosom zacznie translację liderowego RNA

• W warunkach dużego stężenia tryptofanu rybosom szybko wbudowuje tryptofan w miejscu wyznaczanym przez obydwa kodony trp i translacja jest kontynuowana do końca liderowego RNA

• Na sekwencję 2 nachodzi rybosom i blokuje ją, co wykluczając spinkę 2:3 umożliwia utwo­rzenie się spinki 3:4 i powoduje terminację transkrypcji

• Alternatywnie, przy niedoborze tryptofanu nie będzie on dostępny w potrzebnej dla translacji postaci aminoacylo-tRNA i rybosom zatrzyma się przy dwu kodonach trp, blokując tym samym sek­wencję 1

• To pozwala sekwencji 2 utworzyć spinkę z sekwencją 3, znaną jako spinka antyterminacyjna

• Spinka terminacyjna (3:4) nie może się utworzyć, dzięki czemu może zachodzić transkrypcja genu trpE i następnych genów struktury.

• Stężenie końcowego produktu — tryptofanu decyduje o tym, czy transkrypcja ulegnie wcześniejszej terminacji (atenuacji) lub czy będzie kontynuowana i dojdzie do transkrypcji całego operonu

Znaczenie atenuacji

• Obecność tryptofanu zwiększa, przez samą tylko atenuację, represję trans­krypcji operonu trp 10-krotnie

• W połączeniu z kontrolą poprzez represor trp (70-krotna), stężenie tryptofanu może 700-krotnie zmienić ekspresję operonu trp

• Atenuacja zachodzi w co najmniej sześciu operonach kodu­jących enzymy potrzebne do biosyntezy aminokwasów

• Ope­ron his zawiera kodującą peptyd sekwencję liderową z siedmioma nastę­pującymi po sobie kodonami histydynowymi

• Nie wszystkie operony mają taką samą kombinację mechanizmów kontrolnych jak operon trp

• Operon his nie podlega regulacji typu represor-operator, a jedynym mechanizmem jego kontroli jest atenuacja

Regulacja transkrypcji przez alternatywne czynniki σ

Czynniki sigma

• Rdzeń α₂ββ'ω polimerazy RNA jest niezbędny do rozpoczęcia transkry­pcji w miejscach promotorowych Do rozpoznawania zgodnych sekwencji promotorowych -35 i -10 polimeraza RNA wymaga obecności podjednostki σ

• Jest ona potrzebna tylko do inicjacji transkry­pcji

• Po inicjacji, a przed rozpoczęciem elongacji zostaje oddzielona od rdzenia enzymu

• Zatem czynniki σ są białkami dwufunkcyjnymi, które jednocześnie mogą się wiązać z rdzeniem polimerazy RNA i rozpoznawać specyficzną sekwencję promotora w DNA

• Wiele bakterii, łącznie z E. coli syntetyzuje zestaw czynników σ, które rozpoznają różne zestawy promotorów

• Inicjacja transkrypcji od poszczególnych pro­motorów lub małych ich grup jest regulowana wspólnie przez pojedyncze represory transkrypcji (takie jak represor lac) lub aktywatory transkrypcji (takie jak białko receptorowe cAMP, CRP), jednakże w pewnych warun­kach środowiskowych potrzebna jest większa zmiana ekspresji genów w komórce.

• W takiej sytuacji bakteria może wykorzystać inny zestaw czynników σ do bezpośredniego związania polimerazy RNA z innymi sekwencjami paromotorowymi

• Proces ten powoduje, że komórka kieruje aktywność transkrypcyjną na transkrypcję genów odrębnej klasy

Rozpoznawanie promotora

• Związanie alternatywnego czynnika σ z polimerazą RNA nadaje nową specyficzność promotorową enzymowi odpowiedzialnemu za ogólną syntezę RNA w komórce

• Każdy z tych czynników rozpoznaje inne kombinacje sekwencji usytuowanych w regio­nach -35 i

-10

• Czynniki σ wchodzą w kontakt z tymi dwoma regionami, przy czym region -10 jest istotniejszy

• Podjednostka σ⁷⁰ jest u E. coli najczęściej występującym czynnikiem σ, odpowie­dzialnym za rozpoznawanie promotorów mających sekwencje zgodne-35 i-10

Szok termiczny

• Odpowiedź na szok cieplny u E. coli jest przykładem istotnej zmiany eks­presji genów wywołanej różnymi czynnikami σ

• Poddanie komórek E. coli działaniu podwyższonej temperatury indukuje syntezę zestawu około 17 białek, zwanych białkami szoku cieplnego

• Przeniesienie komórek E. coli z temperatury 37° do 42°C powoduje przejściowe nasilenie syntezy tych białek

• W wyższej temperaturze, na przykład 50°C, w której E. coli nie może już się rozwijać, białka szoku termicznego są jedynymi syntetyzo­wanymi białkami

• Promotory genów kodujących białka szoku termicz­nego E. coli są rozpoznawane przez specjalną formę holoenzymu polime­razy RNA, zawierającą odmienny wariant czynnika σ³², który jest kodo­wany przez gen rpoH

• σ³²jest rzadkim białkiem, występującym w znacz­nie mniejszych ilościach niż czynnik σ ⁷⁰

• Holoenzym zawierający czynnik σ ³² działa wyłącznie na promotory genów szoku termicznego i nie rozpoznaje ogólnych promotorów z sekwencjami zgodnymi, typowymi dla większości innych genów

• Sekwencje promotorów szoku termicz­nego różnią się od sekwencji promotorów wiążących czynnik σ ⁷⁰

Sporulacja u Bacillus subtilis

• Rozwijające się wegetatywnie komórki B. subtilis, w odpowiedzi na nieko­rzystne warunki środowiska, tworzą spory

• Utworzenie spor (sporulacja) wymaga drastycznych zmian w ekspresji genów, łącznie z zatrzymaniem zarówno syntezy prawie wszystkich białek potrzebnych do życia wegetatywnego, jak i wytwarzania białek koniecznych do wzno­wienia syntezy białka w czasie rozwoju spor, gdy znajdą się w bardziej sprzyjających warunkach

• W procesie formowania się spory dochodzi do niesymetrycznego podziału komórki bakteryjnej na dwa kompartmenty - jeden stanowiący przyszłą sporę i drugi — komórkę wyjściową, która ostatecznie ginie

• Wegetatywne komórki B. subtilis zawierają pewien zestaw czyn­ników σ, a sporulacja jest regulowana przez dodatkowy zestaw czynni­ków, inny od zestawu w komórkach wegetatywnych

• Podczas sporulacji inne czynniki σ są aktywne w tej części komórki, która odpowiada przyszłej sporze, a inne w pozostałej części różnicującej się komórki wyj­ościowej

• Krzyżowa regulacja tej kompartmentacji pozwala na ścisłą koor­dynację procesu różnicowania

Bakteriofagowe czynniki σ

• 
  Niektóre bakteriofagi kodują nowe podjednostki σ, nadające polimerazie RNA gospodarza odmienną specyficzność promotorową, pozwalającą na selektywną ekspresję genów fagowych (fag T4 u E. coli i SPO1 u B. subtilis)

• Ta strategia jest skuteczną alternatywą kodowania własnej polimerazy przez faga (jak u bakteriofaga T7)

• Bakteriofag SPO1 B. sub­tilis koduje „kaskadę" czynników σ, które ulegają ekspresji w kolejności pozwalającej na transkrypcję jego własnych genów w określonych etapach infekcji

• Najpierw ulegają ekspresji geny wczesne z udziałem normalnego holoenzymu bakteryjnego

• Wśród tych wczesnych genów znajduje się gen kodujący czynnik σ²⁸, który zastępuje w polimerazie RNA bakteryjny czynnik σ

• Holoenzym zawierający σ²⁸ jest odpowiedzialny za ekspresję genów średnio wczesnych

• Do genów tych należą geny 33 i 34, kodujące następny czynnik σ, który jest odpowiedzialny za transkrypcję genów późnych

• W ten sposób bakteriofagi wykorzystują polimerazę RNA gospodarza do kolejnej ekspresji własnych genów

Sporulacja u Bacillus subtilis

---