BIOTECHNOLOGIA
TEMAT: Drożdże, jako mikroorganizmy wykorzystywane w procesach biotechnologicznych
Drożdże należą do grupy grzybów jedokomórkowych i w klasyfikacji botanicznej dzielimy je na 2 podgrupy:
1.workowce(ascomycetes)-posiadające zdolność rozmnażania generatywnego przez wytwarzanie workow i zarodnikow workowych
2.niedoskonałe(Fungi imperfect)-nie wystepuje tu zjawisko wytwarzania zarodnikow
Jest tez podzial drozdzy ze wzgledu na przeslanki praktyczne:
1.dzikie-spotykane w stadium naturalnym w przyrodzie wykazują aktywność na początku fermentacji winiarskiej,zdolne do wytwarzania małej ilości etanolu,powoduja wady i choroby wina
2.szlachetne-uzyskiwane ze szczepów dzikicg matodami selekcji hodowli inżynierii kom i generatywnych na pozyskiwanie szczepów o ulepszonych cechach biotechnologicznych np.zwiekszonej odporności na stężenie etanolu
Obecnie jest opisanych ok.1500 gat drożdzy ktore maja zastosowanie w:
-procesach biotechnologicznych(winiarstwo,piwowarstwo etc.)
-produkcja biomasy(drożdże piekarskie,paszowe, SCP-single cell protection)
Drożdze:
-Candida kefyr- kefiry, kumys (nie wiem cyz dobrze rozczytałam)
-Cryptococcus sp.- enzymy do koagulacji białek, mleka
- Rhodotorula sp.- karotenoidy
-Sacharomyces cerevisae-drożdże piekarskie,paszowe,SCP,etanol kefir
-S.pasteurianus-produktem jest piwo
-S.bayanus-produktem jest wino
-Candida flareri-produktem są witaminy
W produkcji bioetanolu zastosowanie znajdują drożdże z rdz Sacharomyces gat. cerevisiae(Sacharum-cukier,mycetes-grzyby,cerevisiae-piwo).Drożdże z rdz.Canidia,Endomycops-produkcja mlecznych napojów,enzymów,aminokwasów
Z kolei gatunki takie, jak S. cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis i Schizosaccharomyces pombe stanowią ważne źródło białek heterologicznych w przemyśle farmaceutycznym
Drożdże rozmnażają się przez:
-pączkowanie-wegetatywne
-podział poprzeczny komórki-wegetatywne
-zarodnikowanie-wegetatywne
-kopulacja-płciowe
Wytwarzanie worków i zarodników workowych to forma samoobrony na niesprzyjające warunki środowiska(brak supstancji pokarmowych,wody).Powstające w tych warunkach zarodniki stanowią formę spoczynkową odporną na wysychanie ,brak pokarmy(f.przetrwalnikowa).Gdy są dobre warunki to zaczynają kiełkować.
...............................W tym mjsc mam rysunek u siebie w notatkach wyśle zdjecie z nim w poniedzialek po poludniu bo nie mam kabla w domu do telefonu :P
W procesie pączkowania najpierw tworzy się uwypuklenie zwane PĄCZKIEM, do ktorego przechodzi część cytoplazmy i jedno z jąder potomnych po podziale jądra macierzystego.Wzrastająca kom może się oddzielić i być samodzielna.Po krótkim czasie nabywa zdolność do tworzenia kom potomnych.Pojedyńcza kom macierzysta jest zdolna do wytworzenia 20 kom potomnych i w miejscu oddzielenia się każdej powstaje BLIZNA.Co 90-120 min można zaobserwować podwojenie się liczby kom.
Proces pączkowania dzielimy na:
-pączkowanie wielostronne(multilateralne)-kom potomne powstają na całej powierzchni kom macierzystych
-pączkowanie biegunowe-na końcach komórek,i to wystepuje u form o cylindrycznych kształtach komórek
Schizosaccharomyces- drożdże rozszczepkowe- należą do Ascomycetes- rozmnażanie przez rozszczepienie (podział)- jak u bakterii
Niekiedy komórki potomne tworzą zespoły komórek- sa połączone ze soba, ale funkcjonuja niezaleznie od siebie- są autonomiczne
Kom.drożdżowa ma przeciętnie 75% wody,w skł suchej subst wchodzą:
-białka 45-60%
-węglowodany 25-30%
-tłuszcze 4-7%
-zw.mineralne 6-9%
Zw.mineralne tworzą gł. fosforany,sole potasu,sodu,wapnia i małe ilości np. żelaza,miedzi,cynku.Fosfor wystepuje jako skł estrów cukrowych i zw.pochodnych nukleotydów i kw.tłuszczowych.Bierze udział w przemianach energetycznych i oddechowych.Potas,żelazo,cynk,mangan są czynnikami aktywującymi działalnośc enzymów.Siarka utrzymuje odpowiednią strukture białek i jest skł czynnych grup enzymatycznych.
Ściana kom drożdży-budowa warstwowa,gł subst budulcowe to MANNAN- po zewnętrznej stronie i GLUKAN po wewnętrznej stronie,są też białka,tłuszcze i zw.nieorganiczne
............................................ZNÓW RYSUNEK..............................................
Cytoplazma-gdy jest dużo pokarmu to odkłada się GLIKOGEN-rezerwowy węglowodan i dwucukier TREHALOZA-chroni kom drożdży przed autolizą
Substancje zapasowe:
-wolutyna-substanja o charakterze białkowym
-glikogen-węglowodan,ktory gromadzi się w kom drożdży hodowanych na podłożach zawierających cukry
-tłuszcze-substancje zapasowe
Drożdże należą do chemoorganotrofów,może zachodzić katabolizm glukozy na drodze glikolizy(szlak EMP) lub szlaku heksozomonofosforanowym (szlak HMP)
EMP-produktem końcowym jest pirogronian,który może być redukowany do etanolu(f.alkoholowa) lub ulegać utlenieniu do CO2 i H2O
HMP-zachodzi w warunkach tlenowych i jego produktami są pentozofosforany- prekursorzy syntezy aminokwasów, nukleotydów i kwasów nukleinowych oraz fruktozo-6- fosforan i aldehyd 3- fofoglicerynowy, które mogą być włączane do szlaku glikolizy
Gł.szlakiem fermentacji glukozy jest glikoliza.W warunkach beztlenowych aktywność enzymów cyklu HMP jest bardzo niska.W szlaku EMP glukoza jest przekształcona do fruktozo 1,6-difosforanu,który zostaje rozszczepiony przez aldolazę do aldehydu 3-fosfoglicerynowego i fosfodihydroksyacetony, a te ulegają przemianie do aldehydu octowego i CO2 katalizowanego przez dekarboksylozę pirogronianową.Utworzony aldehyd octowy jest z udziałem dehydrogenazy alkoholowej, redukowany do etanolu.
Energia metaboliczna w procesie fermentacji etanolowej jest pozyskiwana jedynie w reakcjach fosforylacji substratowej (2 mole ATP/mol glukozy). Teoretycznie z 1g glukozy powinno powstać 0.51g etanolu i 0.49g CO2 , ale ze względu na wykorzystanie glukozy do syntezy składników materiału komórkowego oraz tworzenie produktów ubocznych powstaje 0.46g etanolu i 0.44 g CO2
Metabolizm tlenowy:
- wykorzystanie glukozy zaczyna się podobnie jak w warunkach beztlenowych od szlaku glikolizy
- slzak HMP służy do tworzenia metabolitów włączanych do szlaku glikolitycznego lub do syntezy polisacharydów, nuleotydów i aminokwasów. Pirogronian utworzony na drodze EMP wskutek dekarboksylacji oksydacyjnej z udziałem koenzymu A i w obecności kompleksu dehydrogenazy pirogronianowej jest przekształcany do acetylo Co-A. Zaktywowany
acetylo-coA zostaje całkowicie utleniony do CO2 w cyklu Krebsa, który służy utlenianiu
acetylo-coA, ale też tworzeniu prekursorów (np a- ketogluforan, szczawianooctan i bursztynian) do dalszych syntez komórkowych.
Efekt Pasteura
- fermentacja alkoholowa jest hamowana przez tlen
- polega to na represji w warunkach tlenowych enzymów szlaku EMP. Dzieje się tak, bo metabolity ATP, jony H+ , cytrynian są inhibitorami fosfofruktokinazy (enzymu regulatorowego glikolizy). Hamowanie w sprzężeniu zwrotnym ma charakter sekwencyjny, bo gromadzenie się glukozo-6- fosforanu obniża aktywność heksakinazy oraz hamuje transport glukozy przez błonę cytoplazmatyczną. Zmiana warunków hodowli z bezltenowych na tlenowe u S. cerevisiae prowadzi do kierunkowego zwiększania się wydajności biomasy.
Efekt Pasteura jest obserwowany u wszystkich drożdży z wyjątkiem browarniczych.
Efekt Crabtree
Biorąc pod uwagę kryterium, jakim jest zdolność do prowadzenia fermentacji alkoholowej, drożdże podzielono na bezwzględnie tlenowe, do których należą drożdże niezdolne do prowadzenia fermentacji etanolowe, oraz względnie tlenowe tzn. zdolne do produkcji etanolu. W tej ostatniej grupie wyróżnia się drożdże Crabtree-dodatnie, prowadzące proces fermentacji w warunkach tlenowych przy dużych stężeniach glukozy i drożdże Crabtree- ujemne o niskiej aktywności fermentacyjnej, które metabolizują sacharydy do etanolu w warunkach ograniczonego dostępu tlenu.
- w warunkach tlenowych przy nadmiernym stężeniu glukozy w pożywce obserwuje się częściowe hamowanie oddychania komórek drożdży. Inhibicja oddychania jest na zasadzie katabolicznej represji glukozowej i nosi nazwę negatywnego efektu Pasteura i efektu Crabtree. Istota negatywnego ef Pasteura polega na hamowaniu.........................................................................................................................................
FAZY ROZWOJOWE DROŻDŻY
-F.rozmnażania-pączkowanie-wszystkie kom podlegają pączkowaniu,wykazują cytoplazmę rzadką i przejrzystą z połyskiem jedwabistym,dużymi wodniczkami-ta faza odpowiada stadium zafermentowania-jest tutaj znaczne zuzycie tlenu.
-F.fermentacyjna-większość kom.już nie pączkuje,gestrza cytoplazma,pojawiają się kropelki tłuszczu inne subst zapasowe,przezroczystosc cytoplazmy zmniejsza się moze sie pojawic glikogen i tluszcz.Wodniczki scisniete w cytoplazmie.
-F.spoczynku w osadzie-znaczna ilosc martwych kom i wyrazna plazmoliza,cytoplazma ziarnista i nieprzejrzysta przez subst zapaspwe.Faza ta przypada na okres fermentacji głownej i moze oznaczać moment do właściwego obciągu wina.
-F.utleniania-drożdże z osadu przechodzą na powierzchnie gdzie w obecnosci powietrza tworza zbite,przepojone tłuszczem wysepki okrągłych i niekiedy "koronkowo" pączkujących z paru str komórek.Może być widoczny pierścieniowy nalot drożdży.Kom wiążą intensywnie tlen z powietrza i prowadzą procesy utleniania alkoholu.
Faza zarodnikowa
- przy braku składników odzywczych i optimum dostępu powietrza
Wysoko wydajne szczepy drożdży stosowane w biotechnologii pozyskuje się metodami klasycznymi (selekcja, mutacja, hybrydyzacja naturalna, fuzja protoplastów) i nowoczesnymi- rekombinacja DNA
Szczepy musza się charakteryzować:
- krótkim czasem generacji
- wysoką wydajnością i szybkością tworzenia produktu
- brakiem patogenności
-stabilizacją genetyczną i fenotypową
- niskie wymagania pokarmowe i duża tolerancja na zmiany stężenia składników pożywki
- niska wrażliwość na zmiany warunków natlenienia
-toleranca na zmiany temperatury i ciśnienia, pH
Drożdże piekarskie
- wysoka szybkość wzrostu, wysoka aktywność enzymatyczna (szybkie zafermentowanie)
- zdolność do adaptacji do środowiska- zwiększone ciśnienie osmotyczne
- aktywność beta-fruktofuranozydazy, alfa- glukozydazy- do hydrolizy cukrów
-aktywnośc lipaz i proteaz- rozkład lipidów i białek (zapewnia to dobry bukiet zapachowo- smakowy)
- wysoka zawartość trechalozy- większa trwałośc i odporność
- wysoka zawartość białek
- do spulchniania ciast gat. S.c.
Drożdże paszowe
- do ich produkcji można wykorzystać surowce odpadowe- wywary gorzelnicze, melasę, serwatkę, poślady zbóż, słoma itp- najczęściej do ich produkcji wykorzystuje się szczepy należące do S. cerevisiae, Candida utilis, C. tropicalis, Kluyveromyces marxianus, K. lactis, Debaryomyces sp. i inne.
Drożdże paszowe mogą być wykorzystywane do produkcji preparatów białkowych (SCP)
D. gorzelnicze
- surowce roślinne- skrobiowe
- w przemysłowym- melasa lub serwatka
-cechy;
-zdolność szybkiego zafermentowania, działanie w kwaśnym środowisku i temperaturach 34-39 stopni Celsjusza, odpornośc na stężenie etanolu ponad 12% w/v, na podwyższone ciśnienie osmotyczne oraz maksymalna wydajność produkcji etanolu
W celu wykorzystania niekonwencjonalnych substratów przez szczepy S.c., K.i do materiału genetycznego tych drożdży można wprowadzić geny kodujące alfa-amylazę i glukoamylazę, pochodzące od drożdży amylolitycznych - Debaryomycetes occidentalis.
Szczepy S.c. mogą być zdolne do fermentacji laktozy po wprowadzeniu do ich genów kodujących odpowiednio: beta-glukozydaze i permeazę laktozową, pochodzące od drożdży K.sp.
podobne znaczenie ma również więkasza zawartość glicerolu czy trehalozy oraz podwyższona aktywność katalazy w kom.drożdży. usunięcie kodującego kwaśną trehalazę lub ekspresje genu AD2, odpowiedzialnego za syntezę nienasyconych kwasów tłuszczowych może przyczynić się do wzrostu tolerancji komórek drożdży na wysokie ciśnienie osmotyczne lub zwiększone stężenie etanolu.
Do produkcji etanolu z pomocą S. cerevisiae wykorzystuje się glukozę, fruktozę, sacharozę, maltozę, galaktozę, naltotriozę, ale nie są zdolne do rozkładania laktozy i polisacharydów.
Szczepy S. cerevisiae można poddać modyfikacji genetycznej łącząc korzystne cechy technologiczne reprezentowane przez inne rodzaje i gatunki drożdży. Wskutek fuzji protoplastów drożdży S. cerevisiae z hetero.......
Kolejnym kierunkiem doskonalenia szczepów drożdży gorzelniczych są modyfikacje genetyczne zmierzające do zwiększenia tolerancji komórek na podwyższony poziom etanolu, zwiększone ciśnienie osmotyczne- w warunkach stresu wywołanego tymi czynnikami.............................................................................................................
Drożdże winiarskie
-naturalna hybrydyzacja Saccharomyces i potem wyselekcjonowanie w środowiskach produkcyjnych(?)
- wszystkie obecnie otrzymywane izolaty winiarskie tego gatunku powstały w wyniku zmian genotypowych i fenotypowych drożdży krążących pomiędzy winnicami, a winiarniami
-szczepy drożdży przeznacozne do produkcji win powinny się charakeryzować:
- krótkim okresem adaptacji do środowiska......................................................................................................
- zdolnością do flokulacji i szybkiego osadzania się po zakończeniu fermentacji, co umożliwia szybkie klarowanie wina
- małą wrażliwością na kwasy organiczne w stężeniu powyżej 7g/dm3 w przeliczeniu na kwas jabłkowy oraz pH środowiska fermentacyjnego poniżej 5
- wytwarzaniem produktów ubocznych fermentacji , decydujących o właściwym smaku, aromacie wina
-produkcją etanolu do wymaganego poziomu, zależnie od rodzaju
Drożdze S.pastorianus ze wzg na wytwarzanie enzymu alfa-galaktozydazy, zwykle są zdolne do całkowitego metabolizowania trisacharydu rafinozy.
Browarnicze
- dwa gatunki- S. cerevisiae (górnej fermentacji) i S. pastorianus (dolnej fermentacji)
- S. pastorianus- tworzą enzym alfa- galaktozę- zwykle zdolną do całkowitego metabolizowania trisacharydu rafinozy
działają w temperaturze 5-12 stopni- dlatego dolna fermentacja
- S. cerevisiae- 14-23 stopnie- górna fermentacja, oraz mają zdolność do flokulacji (sedymentacja, zbijanie się)
- cechy:
- szybkość wzrostu i wydajna produkcja biomasy- 3krotny wzrost biomasy w czasie propagacji; zdolność do szybkiej fermentacji brzeczki- ekonomiczniej aby było;)
- wytwarzanie związków smakowych i zapachowych, warunkujących odpowiedni bukiet piwa
- uzdolnieniami flokulacyjnymi, właściwą szybkością osadzania się kom. wolniejszą w czesie fermentacji głównie do fermentowania a szybkoą podczas leżakowania
Schizosaccharomyces pombe
- na owocach- w przemyśle alkoholowym
- właściwości:
- fermentacja w wyskoich temperaturach- kraje tropikalne
Rhodotorula sp.
- w glebie i na produktach spożywczych
- wytwarza czerwony barwnik